Les milieux de culture en bactriologie

1- Dfinition
Un milieu de culture est une prparation au sein de laquelle des micro-organismes peuvent se multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme tudi ce qui implique : - couvrir les besoins en ions minraux, en facteurs de croissance, apporter la source de carbone et dnergie ; - prsenter un pH voisin du pH optimal ; - prsenter une force ionique optimale (le milieu peut tre isotonique mais ce nest pas obligatoire).

2- Les diffrents types de milieux

Il existe une grande varit de milieux de culture en rapport avec la diversit des exigences nutritives des microorganismes. On distingue gnralement : les milieux synthtiques de composition exactement connue, qualitativement et quantativement. Ces milieux sont surtout utiliss pour ltude des bactries autotrophes ou pour tudier les besoins nutritifs dun germe. Ils sont rarement utiliss en routine lexception de quelques uns : Citrate de Simons, Citrate de Christensen, Ure-Tryptophane Les milieux empiriques de composition connue seulement avec approximation car dpendant des matires premires utilises : extrait de viande ou de levure, peptones, sucres et ventuellement liquides biologiques (srum, sang) mais qui conviennent aux micro-organismes tudis. Ce sont les milieux les plus employs aujourdhui. Exemple : LB, Columbia, Gassner, Tryptycase soja, Chocolat,

Une autre distinction de milieu se fait par la consistance de ceux-ci. En effet, les micro-organismes se dveloppent parfaitement dans les milieux liquides mais lisolement bactrien ncessite des milieux solides afin de sparer les diffrents germes prsents dans un prlvement. On obtient les milieux solides en ajoutant un agent glifiant un milieu liquide. Le glifiant le plus utilis est lagar-agar ou glose : il sagit dun polygalactoside sulfat prsentant la proprit de former avec leau un gel solide une temprature infrieure environ 60 C tout en tant liqufiable par bullition, auquel cas, il reste en surfusion (liquide) jusquaux environs de 45C. Dautre part, trs peu de micro-organismes sont capables dhydrolyser lagar. Il sagit donc du procd le plus utilis pour fabriquer des milieux solides, laddition de diverses autres molcules ne posant aucun problme particulier dans ce milieu aqueux. Les milieux solides destins tre couls en bote de Ptri ou en tube ont une teneur en glose assez leve (15 g.L -1) tandis que les gloses molles ou semi-solides sont peu gloses (3 5 g.L-1) et prsentent une consistance intermdiaire.

3- Description de quelques milieux 3-1 Les milieux non slectifs

On regroupe sous ce vocable tous les milieux ne contenant aucune molcule inhibitrice. Ils sont en gnral de prparation assez simple et gnralement peu coteux. Ces milieux contiennent une base nutritive constitue de molcules azotes (acides amins, facteurs de croissance diverses) provenant de lhydrolyse de produit dorigine vivante (animale, vgtale, myclienne) comme les peptones, les extraits de viande ou de levure. Souvent, les milieux non slectifs comportent une molcule et son systme de rvlation (sucre le plus souvent) ce qui permet une premire discrimination des genres mais ce nest pas obligatoire. Exemple : La glose Mueller-Hinton
Infusion de viande de buf Peptone de casine Amidon de mas Agar 300 ml.L-1 17.5 g.L-1 1.5 g.L-1 17 g.L-1

Ce milieu riche est la glose de rfrence pour la ralisation dantibiogramme selon la mthode de Kirby-Bauer. Sa composition (notamment la concentration en magnsium, en calcium, en thymine et en thymidine), son paisseur sont standardises (norme standards M6-P du NCCLS). Il permet la pousse de nombreux micro-organismes

3-2 Les milieux non slectifs enrichis

Ils sont obtenus en incorporant un milieu de base adquat des liquides ou suspensions riches en molcules organiques diverses : du sang, du srum, du liquide dascite, de lextrait globulaire, des supplments polyvitaminiques Les qualits nutritives peuvent tre amliores par dnaturation thermique des constituants, en particulier pour le sang. Ils permettent la pousse de nombreux germes exigeants ou trs exigeants. Les plus utilises sont les gloses au sang frais ou au sang cuit, et la glose chocolat. Exemple Les gloses au sang frais et chocolat Laddition de sang au milieu de base peut avoir plusieurs buts : - apporter des facteurs de croissance ncessaire au micro-organisme tudi - neutraliser certains inhibiteurs contenus dans les petones des milieux - neutraliser, du fait de laction peroxydasique et catalasique de lhmoglobine, des ions superoxydes ou des peroxydes toxiques produits par le micro-organisme (intressant en particulier pour les bactries catalase comme les Streptococcaceae) Par ailleurs, il permet la lecture dun caractre important lors de la dtermination du germe : lhmolyse. Le sang peut tre dorigines diverses : cheval, mouton, lapin, homme, buf (attention certains germes prsentent un type dhmolyse sur un sang et un autre type dhmolyse avec un autre sang). Il est ajouter raison de 5 10% au milieu de base (Columbia, Tryptycase soja, Mueller Hinton, cur cervelle). Celui-ci ne doit pas contenir de glucose, car il inhibe les hmolysines.

Glose au sang

Glose Chocolat

3-3 Les milieux slectifs

Les milieux slectifs sont des milieux empchant la culture de certains micro-organismes. Ils sont utiliss pour lisolement bactrien dans des produits polymicrobiens. La slection peut tre chimique ou antibiotique. Ce sont des milieux riches ou non et donnant souvent un ou plusieurs caractres biochimiques dorientations permettant une identification plus simple des germes. La glose Gassner La glose de Gassner est une glose slective des germes Gram ngatifs non exigeants (Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pseudomonaceae, Alcaligenaceae) Son activit slective est due au Jaune mtachrome. Par ailleurs, il contient du lactose et du Bleu leau (indicateur pH) qui permettent de diffrencier les germes LACTOSE + (bleu) des germes LACTOSE (jaune).

Souche Lactose +

Souche Lactose -

Il existe de nombreux milieux ayant le mme pouvoir slectif que la Glose de Gassner. Certain utilise les mme indicateurs dautre non. On peut citer la glose rouge neutre/vert brillant, la glose MacConkey, le milieu de Lvine ect..

3-4 Les milieux denrichissement

La prsence de certaines bactries pouvoir pathogne spcifique dans un prlvement, a une signification pathologique indiscutable, mme si elles sont peu reprsentes. Cest le cas par exemple des Salmonella, des biotypes entropathognes, de Yersinia enterocolitica, des vibrions cholriques ou encore des Listeria ou des Enterocoques. Quelques fois, leur proportion peut tre minime par rapport celle de la flore commensale et leur prsence ne peut tre rvle par un isolement (slectif). Labsence de colonies suspectes sur lisolement slectif ne suffit pas pour affirmer labsence de ces bactries dans le prlvement. Cest pourquoi un enrichissement est mis en route en mme temps que lisolement (slectif). Enrichir, cest augmenter la reprsentation (proportion) dun sous-groupe de micro-organismes dans un ensemble plus vaste. Un milieu denrichissement runit deux caractristiques : il contient des molcules action slective inhibant totalement ou partiellement la culture des microorganismes non recherchs ou utilise une temprature dincubation particulire, ou encore une atmosphre particulire ; il est liquide (bouillon) afin que son action slective sexerce sur une population importante et homogne.