TP : LES TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT

Les micro-organismes dans leur environnement naturel coexistent en populations mélangées et

complexes hébergeant plusieurs espèces.

Cette coexistence à l’état naturel est appelée communauté microbienne ou population mixte ou
encore microbiocénose.

Cette diversité microbienne pose problème aux microbiologistes, car un seul type de micro-
organismene peut être étudie dans une culture mélangée. En effet tous les travaux de laboratoire
sont basés sur l’utilisation d’une seule espèce c’est-à-dire de culture pure ou monomicrobienne.

Il est donc nécessaire d’isoler séparément ou individuellement des espèces de ce mélange en

utilisant des procédés aseptiques.

L’Asepsie signifie l’absence de micro-organismes, elle impose l’utilisation de matériel de telle

sorte qu’aucun microbe indésirable ne puisse s’introduire dans les procédures microbiologiques
(isolement, ensemencement, repiquage, beurrage…). L’antonyme est sepsie, signifiant non
stérile ou présence de micro-organismes.

L’ensemencement est l’opération qui consiste à déposer dans un milieu de culture stérile des
germes prélevés d’une culture mère (milieu naturel ou culture pure) à l’aide d’une anse de
platine ou d’une pipette Pasteur.

Parmi les opérations d’ensemencement on cite : L’isolement ; Le repiquage ; Le beurrage.

L’isolement : consiste en un ensemencement microbien effectué dans un but de séparation, de

façon à obtenir des colonies nettement distinctes.

Intérêt de l’isolement :

 L’obtention de cultures pures indispensables à toute étude et identification

microbiologiques ;
 L’étude morphologique des colonies isolées ;
 Le contrôle des cultures (recherche de contaminants et d’éventuels mutants).

Le repiquage : est la transplantation d’une culture pure sur un milieu de culture neuf.

Le beurrage : est un ensemencement massif en stries serrées à la surface d’un milieu solide
dans le but d’obtenir une culture abondante.

I. Le coulage d’un milieu gélosé en boîte de Pétri :

Les milieux de culture solide avant ensemencement, doivent être fondus et coulés en couche
mince dans des boîtes de Pétri.

Le délai de conservation des milieux n’accède pas 3 ou 4 jours.

 Dévisser et ouvrir le flacon dans la zone stérile.
 Flamber le goulot du flacon à travers la flamme bleue du bec Bünsen.
 Entrouvrir la boîte de Pétri à couler.
 Passer Louverture de flacon dans la flamme et verser dans le fond de la boîte entre 10 à
20 ml du milieu de culture fondu (45 -50°C).
 Laisser la boîte à moitié ouverte en direction de la flamme pendant quelque secondes
pour évacuer la vapeur d’eau.
 Passer l’ouverture du flacon dans la flamme une deuxième fois, puis on coule les boites
suivantes de la même manière avant de fermer le flacon définitivement.
 On déplace les boites par glissement doux sur une zone plus froide de la paillasse et on
les renferme des quelles sont complètement solidifiées.
 Après solidification, on met les boîtes à l’envers (couvercle en bas) pour empêcher l’eau
de se condenser sur le couvercle et de retomber sur le milieu.

-Leur stockage ce fait dans cette position.

-Si les milieux doivent être utilisées immédiatement, on les fait sécher à l’étuve a 37 °C.

 Enfin on ensemence les boites de pétri, selon les techniques d’ensemencement.

II. Les règles générale sur l’ensemencement :

L’ensemencement qu’il soit réalisé sur milieu liquide ou solide doit respecter les consignes
suivantes :

 Dévisser les tubes à essai dans la zone stérile en saisissant le bouchon entre le
petit doigt et la paume de la main droite et tenir la pipette Pasteur entre le pouce
et l’index de la même main.
 Déposer et ouvrir les boites de Pétri dans la zone stérile.
 Tenir le tube contenant la suspension microbienne par la main gauche, en
position horizontale, l’orifice du tube dirigé vers la flamme pour éviter la
contamination.
 Flamber légèrement l’orifice du tube et prélever une goutte de la suspension
microbienne par la pipette Pasteur au préalable flambée et refroidie.
 Flamber l’orifice du tube à ensemencer et introduire la suspension bactérienne
prélevée au préalable dans le milieu de culture neuf.
 Flamber et visser le tube ensemencé. Ce dernier sera ensuite
incubé à l’étuve pendant une durée appropriée à une température optimale
de la croissance.
 Pour les boites de pétri, après ensemencement, on incube dans l’étuve les boîtes
à l’envers (couvercle en bas) pour empêcher l’eau de se condenser sur le
couvercle et de retomber sur le milieu.
III. Les techniques d’ensemencement :

1. Ensemencement par stries ou par épuisement sur gélose :

C’est une méthode classique d’isolement, permettant l’obtention de culture pure, par
dissémination des germes microbiens ( bactéries, levures) à la surface des milieux de culture
solides et ce fait à l’aide de pipette Pasteur ou d’anse de platine stérilisée par flambage au
bec Bünsen et refroidie au contact du milieu.

A- Sur milieu solidifié incliné en tubes à essai :

Il est réalisé comme suit :

 Prélever à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’une anse de platine flambée et refroidie
l’inoculum à partir d’une culture en milieu gélosé ou liquide.
 Déposer l’inoculum sur la pente gélosée à 1cm de son point le plus déclive afin
d’éviter l’eau de condensation.
 Réaliser, à l’aide de la boucle de la pipette Pasteur ou le fil de platine de l’anse
contenant les germes, des stries serrées sur la surface inclinée depuis la partie la plus
basse jusqu’à la partie la plus élevée.

B- Sur milieu solidifié en boîtes de Pétri :

a) Isolement par épuisement sur trois secteurs ou quadrants

 Diviser la boîte de Pétri en trois quadrants sur le fond extérieur.

 Stériliser l’anse de platine par flambage, la refroidir puis prélever l’inoculum.
  Inoculer le premier tiers de la boîte en balayant l’anse sur la surface de la gélose
avec des stries (lignes) non chevauchantes.
 Stériliser à nouveau l’anse et la refroidir et inoculer le deuxième tiers par des stries
en empiétant légèrement sur le 1er quadrant.
 Répéter cette opération pour le 3 ème quadrant en partant du 2ème quadrant.
 Les boîtes sont incubées à la température optimale à la croissance des micro-
organismes.
 Cette technique permet de séparer progressivement les micro-organismes de
l’échantillon de départ ainsi la dose de l’inoculum diminuera entre le premier et le
troisième quadrant.
 Chaque germe isolé formera une colonie (souche) ou clone constitué de cellules
dérivées d’un parent unique.

Pour s’assurer de la pureté d’une espèce il est indispensable de répéter au moins une fois cette
procédure d’isolement de stries ;

Une culture pure est obtenue lorsqu’on cultive un seul type de colonie sur la boîte on parle
alors de souche bactérienne pure.

NB : les bactéries dites syntrophiques ne peuvent pas se multiplier à l’état de colonies isolées,
elles doivent être associées à d’autres bactéries qui leur fournissent des
composés biochimiques indisponibles dans le milieu de culture.
Elles ne se multiplient pas en culture pure mais en consortium c’est-à-dire en culture contenant
plus d’une espèce.

b) Isolement par épuisement sur quatre secteurs ou quadrants

 Diviser la boîte de Pétri en quatre quadrants sur le fond extérieur.

 Stériliser l’anse de platine par flambage, la refroidir puis prélever l’inoculum .
 Soulever le couvercle de la boîte de Pétri et déposer l’inoculum sur une petite surface
au point initial.
 Stériliser l’anse, la refroidir et faire des stries serrées sur toute la surface des
quadrants 1 et 2.
  Stériliser à nouveau l’anse et faire des stries serrées sur les quadrants 2 et 3.
 Répéter cette opération pour les quadrants 3 et 4 et incuber à température optimale.

2- Ensemencement par inondation en nappe ou par étalement :

En tube

 La surface du milieu gélosé incliné est inondée avec quelques gouttes

de liquide à ensemencer .
 Incliner le tube de manière à ce que toute la surface soit imprégnée.

En boîte

 Un faible volume (0,1mL) de suspension bactérienne est déposé à la

surface d’un milieu stérile en boîte de Pétri.
 L’échantillon est étalé de façon homogène sur la surface à l’aide d’une
tige d’étaloir ou de râteau stérile.
3- Ensemencement dans la masse ou étalement en profondeur :

C’est une méthode qui permet de séparer les micro-organismes d’un mélange et de procéder
au dénombrement de chaque type de colonie.

 L’échantillon est mélangé à un milieu gélosé en surfusion

(T° entre 45 et 48°C) avant sa solidification.
 Après homogénéisation, le mélange est versé dans des boîtes de Pétri
où il va se solidifier.
 Après incubation les colonies sont réparties de façon homogène dans
la masse en surface et en profondeur.

NB : Certaines bactéries ne supportant pas les hautes températures

peuvent être tuées même à une brève exposition à 45°C.

4- Ensemencement en touches ou en spots :

 En boîte de Pétri ou en tube incliné contenant un milieu d’identification, un

inoculum riche est déposé sur une petite surface de milieu.
 Les touches sont en général ovales (1 à 2cm de diamètre).
 Cette technique permet de faire plusieurs essais de culture sur
une même boîte.
5- Ensemencement par piqûre centrale profonde ou par piqûres périphériques profondes :

 Il se fait dans un milieu de culture en culot à partir d’une culture en milieu liquide
ou solide.
 Le fil de platine ou la boucle de la pipette Pasteur chargée d’inoculum est introduit
verticalement au milieu ou bien autour de la masse.

6- Ensemencement dans un milieu liquide :

C’est un ensemencement dans la masse d’un milieu liquide

 Il ne suffit pas de plonger l’instrument chargé de germes dans le liquide à

ensemencer ;
 Pour que la totalité des microbes présents sur la boucle soit ensemencée, il faut
émulsionner peu à peu sur les parois internes du tube au contact du milieu liquide,
sans faire de bulles.

NB : Dans tous les cas, il faudra étiqueter les boîtes ou tubes ensemencés avec les
indications nécessaires, à savoir la date de l’ensemencement, le nom du germe ensemencé,
l’origine du prélèvement, le nom du milieu de culture ect…
IV. Les précautions d’asepsie :

 Port de blouse est obligatoire.

 Désinfection de la surface de travail avec de l’alcool ou à l’eau de Javel avant et après

manipulation.

 Se laver les mains au savon, les désinfecter à l’alcool, avant et après manipulation.

 Dégager les cheveux s’ils sont longs.

 Eviter de parler, de manger, de tousser ou d’éternuer au cours des manipulations ;

 Toutes les manipulations (prélèvements, transferts et ensemencements)

doivent être effectuées dans la zone stérile du bec Bünsen.

 Les portes et les fenêtres de la salle de travail doivent être fermées pour éviter les
courants d’air ;

 Eviter le déplacement du manipulateur ;

 Le matériel nécessaire à la manipulation doit être disposé dans la zone

stérile et doit être accessible au manipulateur ;

NB : un micro-organisme, avant d’être identifié est considéré comme potentiellement

pathogène, c’est pour cela qu’il faut respecter les consignes d’asepsie.