REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE M’HAMED
BOUGARA BOUMERDES
FACULTE DES SCIENCESDE
L’INGENIEUR

DEPARTEMENT DE GENIE DES PROCEDES

(GENIE DE L’ENVIRONNEMENT)

THEME

L’EXAMEN MICROSCOPIQUE
DES BACTÉRIES À L’ÉTAT
FRAIS

Réalisé par:
 SaidounAnouar

Année universitaire : 2019/2020

 Sommaire
Introduction

But de TP……………………………………………………………………………1
Matériel nécessaires…………………………………………………………………1
Les parties d’un microscope et leur rôle…………………………………………….1
Technique……………………………………………………………………………2
Exemple d’Observation d’un frottis coloré…………………………….……………5
Références
Introduction
La microbiologieensemble des disciplines biologiques qui traitent des organismes
microscopiques, qu'ils appartiennent au règne végétal (bactéries, algues, champignons) ou au
règne animal. Elle est aujourd'hui divisée en de multiples branches : bactériologie, mycologie,
parasitologie et virologie.[1]

Etudier la morphologie microbienne, au microscope, c’est rechercher la forme des bactéries et

leur mode de groupement.

Ces renseignements peuvent être fournis par une simple préparation à l’état frais entre lame et
lamelle, les bactéries étant alors observées vivantes, ou par l’observation d’un frottis coloré.

Les examens microscopiques de prélèvements peuvent fournir des informations très

précieuses pour le diagnostic et le traitement d’une infection. Dans tous les cas, ils orientent le
diagnostic, le choix des milieux de culture et les conditions d’incubation.

A partir d’une souche pure, c’est le premier critère d’identification.

Les examens microscopiques d’un prélèvement polymicrobien permettent enfin de connaître

les proportions de chaque sous-population dans le prélèvement.[2]

a. But de TP
Il permet l’étude microscopique des bactéries vivantes, en l'absence de toute fixation ou
coloration.[3]
Cette méthode permet d'observer :
- la MORPHOLOGIE des bactéries
- le MODE de GROUPEMENT
- la MOBILITE
- la DENSITE ou PROPORTION de chaque microorganisme en cas de mélange

b. Matériel nécessaires
- lames
- lamelles
- microscope
c. Les parties d’un microscope et leur rôle
1. Tube optique: Contient de nombreux miroir qui permettent à l’image à se rendre à
l’oculaire.
2. Révolver ou port-objectif: Soutient les objectifs et permet la rotation de ceux-ci.
3. Objectifs: Transmet l’agrandissement de l’image.
4. Valets: Permet de stabiliser la lame.
5. Diaphragme ou condenseur: Permet d’ajuster la quantité de lumière émise.
6. Lumière: Émet la source lumineuse afin de pouvoir observer l’image.
7. Pied: Soutient le microscope
8. Vis micrométrique: Permet d’ajuster l’image précisément.

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9. Vis macrométrique : Permet d’ajuster l’image rapidement.
10. Platine: Permet de déposer et soutenir la lame qui contient l’objet observé.
11. Potence: Permet le transport du microscope.
12. Oculaire: Permet de transmettre l’image-objet en l’agrandissant de 10X au total [4]

Figure 1 : microscope optique

d. Technique
En microbiologie, une préparation à l’état frais consiste à enfermer entre lame et lamelle une
suspension de micro-organismes vivants.
L’ancienne technique du lutage est actuellement abandonnée (sauf exception lors de l’étude
des bactéries anaérobie strictes). Il convient donc de réaliser une préparation correcte (sans
déborder) afin de limiter la diffusion des micro-organismes dans l’environnement du
laboratoire.[3]

1. Prélèvement 

 A partir d’une culture liquide : Prélever un aliquote de suspension à

l’anse (ou à la pipette stérile)

 A partir d’un milieu solide : réaliser une suspension en eau

physiologique à partir d’une culture jeune et prélever un aliquote de suspension à l’anse
de platine (ou à la pipette stérile)

 A partir de produits alimentaires ou biologiques : selon le cas l’examen

sera direct ou nécessitera une dilution (milieu solide) ou une concentration (urines)

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 2. Dépôt de la goutte de suspension sur la lame

La lame doit être propre et sèche

3. Dépôt de la lamelle 

Déposer délicatement une la lamelle selon la technique décrite ci-dessous :

Avancer la lamelle Lorsque la goutte Laisser tomber

vers la préparation adhère à la lamelle la lamelle

4. Si la préparation est incorrecte, modifier comme ci-dessous 

Préparation correcte. Présence de beaucoup de bulle d’air. Préparation

Le liquide est bien Elles ne doivent pas apparaître sur le incorrecte.
réparti champ montré. Recommencer
5. Mise au point 

 Repérer la bordure d’une bulle d’air à l’objectif x10.

 Faire la mise au point en faible luminosité (condensateur baissé et diaphragme légèrement
fermé) objectif x40.
 Attendre 1 minute pour ne pas confondre une mobilité positive et un simple mouvement
liquidien
 L’observation ne doit pas excéder 3 minutes (bactéries sensibles à la chaleur)
 Eliminer les lames dans le bac de 3 en 1

6. Observations 

 Rechercher la motilité des bactéries aérobies à partir d'Etat Frais en bordure d'une bulle
d'air.
 Rechercher la motilité des bactéries anaérobies strictes à partir de préparations

Une bactérie MOBILE doit se déplacer dans le champ microscopique avec un

mouvement qui lui est propre, les autres bactéries restant immobiles.

Les bactéries mobiles peuvent laisser deviner leurs ciliatures :

- un déplacement rapide linéaire : ciliature susceptible d'être polaire
- un déplacement lent, circulaire et sinueux : ciliature susceptible d'être péritriche

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 Présentation des résultats d’observation :

ETAT FRAIS objectif x 40 (grossissement 400)

FORME MOBILITE GROUPEMENT DENSITE

Bacilles ou - ou + vraisemblablement Paire ou Isolé ou Evaluation de la

coque péritriche ou polaire selon le cas Chaînettes ou amas proportion de
et préciser la vitalité chaque germe
dans un mélange

7. Causes d’erreur

 Mobilité faussement négative :

- nature du milieu : milieux sélectifs, milieux trop secs, milieux trop âgés
- température de croissance : en fonction de l'espèce
- rapport avec l'O2 : bactérie mobile aérobie observée dans une préparation sans air
(ou inversement pour les anaérobies)
- fautes techniques : observations trop tardives, utilisation d'instruments non refroidis...

 Mobilité faussement positive :

- mouvements transmis par les courants du liquide, qui entraînent toutes les bactéries
dans le même sens.
- mouvements browniens : mouvements désordonnés autour d'un axe, sans
déplacement véritable.
- mouvements pendulaires : mouvements de certaines espèces, prenant comme axe une
de leurs extrémités (Shigella) ce n'est pas une motilité.

e. Exemple d’Observation d’un frottis coloré[2]

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 1- Réalisation d’un frottis

Avant toute coloration, il faut réaliser un frottis, c’est-à-dire un étalement, si possible

monocouche, des bactéries sur une lame.

La technique du frottis est fort simple :

Déposer sur une lame propre une goutte d’eau stérile si la culture prélevée est solide, puis
prélever à l’aide de l’anse de platine une parcelle de la culture. Mélanger afin d’obtenir une
suspension homogène. Il est également possible de déposer une goutte de milieu liquide
incubé ou une goutte de suspension.
Réaliser le frottis en partant du centre de la lame, en décrivant avec l’anse des mouvements
circulaires de façon à obtenir un étalement mince et homogène sur au moins 2/3 de la
lame.
Stériliser l’anse.
Sécher et fixer le frottis au-dessus de la flamme du bec Bunsen sans trop le chauffer. La
technique la plus sûre consiste à passer dans la flamme le frottis 3 ou 4 fois une demi-
seconde, face sans bactéries vers la flamme.
Le frottis étant fixé, la lame ne présente plus de danger de contamination.

On peut alors effectuer la coloration désirée.

Remarque : avant de colorer, attendre que la lame refroidisse sous peine de cristallisation du
premier colorant ou de casse de la lame…

2- Technique générale d’une coloration

Toutes les colorations en bactériologie suivent un même principe qui peut se définir en 3
(éventuellement 4) étapes qui sont :

- Etape de COLORATION (c’est le colorant qui donnera un résultat positif à la fin)

- Une éventuelle étape de mordançage ou d’intensification de la coloration
- Une étape de décoloration ou EPREUVE (c’est le caractère que l’ontcherche à
mettre en évidence)
- Une étape de CONTRE COLORATION qui permet d’observer les germes
décolorés précédemment (donc c’est le colorant donnant un résultat négatif)

3- La coloration de Gram

A- Principe

La coloration de Gram est la base de l’identification d’une souche bactérienne. Elle doit être
parfaitement maîtrisée car c’est le point de départ du choix des examens complémentaires à
effectuer, des milieux à ensemencer etc…

Au terme du processus de coloration, les bactéries dites « Gram Négatives » apparaissent

roses tandis que les bactéries dites « Gram Positives » sont colorés en bleu foncé/violet (rem :
certaines bactéries telles que les Bacillus, apparaissent parfois roses et violettes sur le même

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frottis, on les dit « Gram labiles »  et les différences de coloration sont dues à des différences
d’âge des bactéries)

La coloration de Gram est une coloration qui teste l’alcoolo résistance d’une souche
bactérienne. En effet, les différences de coloration des bactéries reposent sur des différences
de constitution de la paroi :

Figure 2 : paroi des bactéries Gram + et Gram -

Les bactéries Gram négatives ont une paroi plus fine que celles à Gram positives. De plus,
cette paroi est très riche en lipides (membrane externe de la paroi) dans laquelle l’éthanol est
fortement soluble…

B- Technique

- Réaliser un frottis et le fixer.

- Coloration : violet de gentiane phéniqué durant une minute. Toutes les bactéries
prennent ce colorant et sont donc colorées en violet.
- rincer à l’eau du robinet
- Mordançage : recouvrir la lame de réactif de Lugol1 minute (réactif iodo-ioduré qui
accentue la coloration).
- Rincer à l’eau

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 - Epreuve  (alcoolo résistance) : Plonger 3 ou 4 fois une demi-secondedans un pot
d’alcool puis rincer à l’eau du robinet immédiatement. Pendant cette étape, les lipides
de la paroi des Gram moins sont dissous et l’alcool peut donc pénétrer dans le corps
bactérien et expulser le violet de gentiane. Les bactéries Gram moins sont alcoolo-
sensibles et sont donc décolorées. La paroi des Gram plus ne laisse pas passer l’alcool
et sont dites alcoolo-résistantes et restent colorées en violet.
- Contre coloration : Fuschine diluée au 1/20ème ou de safranine pendant une minute.
Toutes les bactéries prennent le colorant mais le violet masque la fuschine. Les
« Gram positives » apparaissent donc violettes, les « Gram négatives », recolorées par
la fuschine, apparaissent roses.
- Rincer à l’eau du robinet et sécher entre deux feuilles de papier absorbant.
- Observer à l’objectif 100 à immersion, à pleine lumière.

Remarque : la coloration de Gram est parfois appelée coloration V.L.A.F afin de se rappeler
les colorants et dans quel ordre ils doivent être utilisés (Violet, Lugol, Alcool, Fuschine).

Figure 3 : coloration Gram sous microscope

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 Références
Sites internet :

[1]https://www.actu
environnement.com/ae/dictionnaire_environnement/definition/microbiologie.php4

[2]

Observation à l'état frais

www.dmipfmv.ulg.ac.be › bacvet › observations

[3]
Fiche technique n°2 microbiologie :
mas.stephanie.free.fr › microbiologie_bio1 › etat_frais

[4]
https://studylibfr.com/doc/2904994/les-parties-d-un-microscope-et-leur-r%C3%B4le