Enzymologie-Métabolisme

ESBS
J. Haiech
haiech@pharma.u-strasbg.fr
 Fux des cours

Chimie Biologique

Préparation TP
S2 Enzymologie
Enzymologie
Allostérie Allostérie
Modélisation Modélisation
Procédés Industriels
Case studies

Métabolisme
Modélisation
S3
 Plan des cours
• Introduction
– Notion d’interaction proteine-ligand
– introduction aux concepts d’allostérie et de
coopérativité
• Un exemple : l’hémoglobine
• Modèle et modélisation : excel et virtual cell
• Enzymologie industrielle sur des études de cas :
Rapport OCDE de 2001 « The application of
biotechnology to industrial sustainability ».
• Groupe de 4 étudiants pour les études de cas.
 Pourquoi ce cours ?
• La cellule est une usine chimique
• Elle est contrainte par :
– L’adaptation aux matières premières
– Son volume
– L’adaptation aux besoins.
+
A E1 A1 E2 A2 E3 A3 E4 B

-
Interaction protéine ligand

Biochimie fonctionnelle
 Introduction

Signal

Fixation  Effet
 Le signal
• Liaison
– Masse molaire (Biacore, …)
– Nombre de ligand lié par molécule de protéine
(séparation libre-lié), dialyse, dialyse en flux continu,
• Conformationnel
– Suivi d’une modification de structure (RMN,
spectroscopie, …)
– microcalorimétrie
• Fonctionnel
– Vitesse de réaction (Activité catalytique)
– Modification Calcique intracellulaire, …
 Liaison

Km
S

S S
S
S
S
S S
S

Ligand total
Ligand libre
 Equations
• Conservation de la masse
– Lt= (L) + (PL)
– Pt = (P) + (PL)
– Kd= (P)(L)/(PL)
– Signal : ν = (Lt- (L))/Pt
• Objectif : Trouver une équation qui décrit
le signal en fonction de la concentration
en ligand libre.
Un microcalorimètre
Une titration
 Enzymologie

Vm

P
Km
S
Récepteur-Hormone

Ligand

Ligand
Ligand
Récepteur Récepteur
Récepteur

Ca, cAMP, …

Temps
 Quelques rappels

Visualiser les équations et les lois

de la physique
Exploration de l’espace

Collision

Liaison efficace

kon = kdiffusion* kefficacité

Augmenter l’efficacité

Modifier la diffusion
 I.6. Rappel : Loi d’action de Masse
H2O
H2O
H2O
H2O H2O
H2O
H2O H2O H2O
H2O
H2O

kon
P L

koff

Ka= kon/koff = 1/Kd = [PL]/[P][L]

 Les conséquences quand on
veut optimiser un médicament
Faits et fantaisies
 Mutagénèse
• On fait un mutant et on regarde les effets
– Modification du kon (diffusion, efficacité)
– Modification du koff (« force » de rétention du
ligand)
• Agonistes/antagonistes
– Modification du couplage
Modification du récepteur
•Modification de la
diffusion (kon)
•Modification de
l’interaction (koff)
•Modification du couplage
•Modification de la
fonction Modification du ligand
•Modification de la
diffusion (kon)
•Modification de
l’interaction (koff)
•Modification du couplage
Les équations sur une
protéine à un site
 Suivi de la liaison

L
L
L

L
L kon
P

koff
L

Ka= kon/koff = 1/Kd = [PL]/[P][L]

 Suivi de la liaison

L
L
L

L
L
P

Pt = 5 molécules L libre = 2 ; L libre = 6 ;

Llié= 1 Llié= 2
ν= Llié/Pt 1/5 2/5
 Suivi de la liaison

L
L Lb
P
L
PL
L
L
Lb
P
PL
L
P
Pt = [P] + [PL] Conservation de la masse
Ka= kon/koff = 1/Kd = [PL]/[P][L] ν= [PL]/Pt
Loi d’action de masse Signal observé
 Equation

ν = Ka[L]/(1 + Ka [L])
1 + Ka [L] est le polynôme de liaison
 Signification
Le numérateur décrit le signal que l’on observe

ν = Ka[L]/(1 + Ka [L])

kon
P L

koff

1 + Ka [L] décrit les espèces en présence

 Généralisation
Le numérateur décrit le signal que l’on observe

S = S0 + S1*Ka[L]/(1 + Ka [L])
S0

S1
kon
P L

koff

1 + Ka [L] décrit les espèces en présence

 Enzymologie
ν = Ka[L]/(1 + Ka [L])

Vm

Km = 1/Ka P
E
S
ES

V = Vm*Ka[S]/(1 + Ka [S]) = Vm [S] / (Km + [S])

 Réceptologie
ν = Ka[L]/(1 + Ka [L])
cAMP

Ka
R
SH
RH

cAMP = F(paramètres, cAMP, GTP…)*Ka[S]/(1 + Ka [S])

Interaction protéine ligand
Plus d’un site
De la biochimie à la
pharmacologie
Protéines avec 2 sites pour le
même ligand
Schéma microscopique

k1 k’2 = c k2

k’1=c k1
k2
 Schéma Macroscopique

K2
K1

PL2
P PL
 Equation Macroscopique (Adair-
Klotz)

Pt = [P] + [PL] + [PL2] Conservation de la masse

K1 = [PL]/[P] [L]
Loi d’actions de masse
K2 = [PL2]/[PL] [L]

ν=([PL]+2*[PL2])/Pt Signal observé

ν= (K1*[L]+2*K1*K2*[L]2)/(1+ K1*[L]+K1*K2*[L]2)
 Signification (Adair-Klotz)

K2
K1

ν= (K1*[L]+2*K1*K2*[L]2)/(1+ K1*[L]+K1*K2*[L]2)
 Signification (Adair-Klotz)

K2
K1

ν= (K1*[L]+2*K1*K2*[L]2)/(1+ K1*[L]+K1*K2*[L]2)
 Signification (Adair-Klotz)

K2
K1

ν= (0*1+ 1*K1*[L]+2*K1*K2*[L]2) /(1+ K1*[L]+K1*K2*[L]2)

 Équation microscopique

k1 k’2 = c k2

k’1=c k1
k2

ν= ((k1+k2)*[L]+2*c*k1*k2*[L]2)/(1+ (k1+k2)*[L]+c*k1*k2*[L]2)
Relations entre macroscopique et
microscopique
k1 k’2 = c k2

K2
K1

k’1=c k1
k2

K1=k1+k2 K1=k1+k2

K1*K2 = c*k1*k2 K2= c*k1*k2/(k1+k2)

 Généralisation (Adair-Klotz)
S1

S0 S2

K2
K1

ν= (S0 + S1*K1*[L]+S2*K1*K2*[L]2)/(1+ K1*[L]+K1*K2*[L]2)

Protéine avec 2 sites pour 2
ligands différents
 Équation
s1

s0 s3
ks k’i = c ki

I
k’s=c ks
ki

s2

ν= (s0+ s1*ks*[S]+s2*ki*[I]+s3*c*ks*ki*[I]*[L]) / (1+ ks*[S]+ki*[I]+c*ks*ki*[I]*[L])

 Inhibition enzymatique
s1 = Vm

s0 = 0 s3= 0
ks k’i = c ki

I
k’s=c ks
ki

s2 = 0

ν= (Vm*ks*[S]) / (1+ ks*[S]+ki*[I]+c*ks*ki*[I]*[L])

 Trois types d’inhibition
• Inhibition compétitive c=0
• Inhibition non compétitive c=1
• Inhibition uncompétitive ki=0 et cki=k’i
(valeur réelle finie).
 Généralisation
• Nombre de types de sites quelconques,
• Nombres de ligands quelconques
• Types de signaux.
Conformational changes hemoglobin

http://www.chem.uci.edu/~pfarmer/127i/myo-hemo.html

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobi
n/MetalComplexinBlood.html#ChangeMovie
 Voies majeures de régulation d’une activité
enzymatique :
• Contrôle de la quantité d’enzyme
Régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle

• Formes multiples des enzymes : isoenzymes

• Contrôle de l’activité d’une enzyme

Modulation de l’activité enzymatique par :

Modification Ligand
covalente (modification non covalente)
ALLOSTERIE
 I) Définition de l’allostérie

Allos = différent, autre Stéréos : structure, volume, forme

Fixation d’un ligand sur une protéine modifie la fixation

d’autres ligands

Nécessité d’avoir au minimum 2 sites

Site activateur
Site catalytique

Site inhibiteur
ALLOSTERIE

Beaucoup d’enzymes allostériques sont oligomériques

Sites catalytiques agissant
indépendamment

Fixation du ligand sur un site,

modifie l’affinité du second site
pour le ligand
coopérativité
• Si l’affinité du second site augmente :
coopérativité positive
• Si l’affinité du second site diminue :
coopérativité négative
La coopérativité se fait via un changement conformationnel

L
ALLOSTERIE
ALLOSTERIE

Augmentation de l’affinité
L pour le ligand

L L
Les effets allostériques peuvent concerner

Χ Des sites de liaison pour un même ligand

Coopérativité homotropique
Plusieurs sites catalytiques sur des s.u. différentes

Χ Des sites de liaison pour des ligands différents

Coopérativité hétérotropique

1 site catalytique + 1 site régulateur (ou plusieurs)

Fixation d’effecteurs allostériques

Régulation allostérique des enzymes

Liaison d’un ligand à un site différent du site catalytique;

cette liaison induisant un changement de structure du
site catalytique

Allos = autre Stéréos : structure,volume, forme

Cf inhibition non compétitive qd α ≠ 1 et inhibition
uncompétitve

Nécessité d’avoir au minimum 2 sites

Définition plus générale de l’allostérie

Fixation d’un ligand sur une protéine modifie la fixation
d’autres ligands
coopérativité
II) Généralités

hémoglobine et myoglobine

Jouent un rôle fondamental dans le métabolisme

animal (métabolisme aérobie)

acquisition, transport et utilisation de O2

transport et stockage de O2 Réseau tubulaire : insectes

Poumons / branchies • Organismes primitifs :

dissolution de O2 et CO2
dans le sang

Hb (vertébrés) • Animaux supérieurs : présence

de protéines de transport et de
stockage (dans sang ou dans
cellules spécialisées)

CO2 O2 Charge en O2 > à celle obtenue

par simple dissolution dans le
Myoglobine sang

O2
Tissus
Myoglobine : stockage de O2 (~ toutes les espèces animales)

: transport de O2 (vertébrés + qqs invertébrés)

Hémoglobine
: transport du CO2 à partir des tissus
Structure de la myoglobine (Mb) et de l’hémoglobine (Hb)
8 hélices α (A_H)
45 x 35 x 25 Å

Mb HbA (adulte) α2β2

Globine
Structure de la myoglobine (Mb) et de l’hémoglobine (Hb)
8 hélices α (A_H)
45 x 35 x 25 Å

Mb HbA (adulte) α2β2

Hémoglobine

α2 : vert et bleu

α : 141 aa β : 146 aa β2 : jaune et turquoise

Expression de la globine humaine à différents stades
du développement
% de synthèse / globine totale

N mois

ξ2ε2, ξ2γ2, α2ε2 _ α2γ2 _ α2β2

Hb embryonnaire Hb F Hb adulte
 Hémoglobine
Biochimie
• Masse moléculaire: 64,5 Kd
• Structure quaternaire:
4 chaînes identiques deux à deux
α 2β 2
• α : 141 acides aminés,
• β : 146
Par érythrocyte : 2.6x108 molécules
3 à 3.5 g de fer/homme (80% Fe total)
 Comment Mb et Hb, de structures

similaires, jouent-elles leur rôle

dans le stockage et le transport de O2 ?

Structure de la myoglobine (Mb) et de l’hémoglobine (Hb)
8 hélices α (A_H)
45 x 35 x 25 Å

Mb HbA (adulte) α2β2

Critères pour le transport d’O2 par des protéines

 Fixation de O2

 Empêcher l’oxydation de toutes substances pendant le

transport ou le stockage

 Libération de O2 au niveau des tissus

Observation
Chaîne polypeptidique seule ne permet pas
la liaison de O2

Liaison de O2 par certains métaux de transition :

Fe2+ ou Cu2+
III) Liaison de 02 à Mb et Hb
A) Structures de liaison de O2

Noyau tetrapyrrolique (numérotation IUPAC)

Grpt 4 méthyl
méthène 2 vinyl
A 2 propionate
20
1

D B

porphyrine Ferroprotoporphyrine (IX)

= Hème
Ferroprotoporphyrine
= Hème

Fixation non covalente

à Mb et Hb
III) Liaison de 02 à Mb et Hb
A) Structures de liaison de O2
Noyau tetrapyrrolique
Grpt
méthène 4 méthyl
2 vinyl
2 propionate

porphyrine Protoporphyrine IX
Liaison de O2 à la myoglobine

Fe2+

Protoporphyrine IX Ferroprotoporphyrine
= Hème

Fixation non covalente

à Mb et Hb
Coordination de Fe2+ E7
His 64 = His distale
O2

N Fe2+ N

http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C10/C10Links/ww
w.fordham.edu/Biochem_3521/lect9/lect9.html
(F8)
His 93 = His proximale
Coordination de Fe2+ (3d6 4s0) E7
His 64 = His distale
O2

N Fe2+ N

http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C10/C10Links/ww
w.fordham.edu/Biochem_3521/lect9/lect9.html
(F8)
His 93 = His proximale
 Hème +
apoprotéine

Myoglobine
+ O2

Oxymyoglobine

Environnement
hydrophobe

Protection
de Fe2+ de
l’oxydation Biochemistry, Matthews , Van Holde, Ahern
Stockage de Mb ou Hb en dehors
de l’environnement cellulaire

Lente oxydation

Metmyoglobine ou Methémoglobine
(Interaction avec Tyr qui remplace His F8)

Inactivation du site de liaison de O2

(Liaison de H2O)
B) Analyse de la liaison de O2 à Mb

1) Graphe : liaison de O2 à Mb en fonction de [O2]

a) Mesure de la concentration de 02 dissout

Loi de Henri : concentration d’un gaz dissout dans un

fluide est proportionnelle à la pression partielle de ce gaz

D’où réglage et mesure facile de la concentration en O2

dissout par variation de la pression partielle en O2 au-
dessus d’une solution de Mb
b) Mesure expérimentale de la fraction de Mb liée à O2

Liaison de O2 à Mb

désoxyMb _ OxyMb

Changement dans le spectre d’absorption

(déplacement d’e- dans le noyau de la
porphyrine)

Détermination de la fraction de Mb ayant liée O2

c) Courbe de liaison de O2 à Mb

θ = fraction de Mb liée à O2

sites liés à O2
θ=
sites totaux

PO2 : pression partielle en O2

P50 : pression partielle en O2

pour laquelle la moitié
des sites sont occupés
Courbe hyperbolique
Analogie avec courbe relative à une réaction enzymatique

Vmax
vitesse

Vmax / 2

[S] = KM

[S], µM
2) Les équations décrivant la liaison : θ = f(PO2)

Mb + O2 Δ MbO2

[ MbO2 ]
K? K = constante d’affinité
[ Mb ][O2 ] = constante d’association

Mb : 1 site de liaison de O2

[ MbO 2 ] PO2
? ? ?
[ Mb ] ? [ MbO 2 ] P50 ? PO 2
 K [O 2 ] [O 2 ]
? ? ?
1 ? K [O2 ] 1 K ? [O 2 ]

[O 2 ]
1 K ? [O2 ]1 2 ? ?
[O2 ]1 2 ? [O2 ]

PO2
? ?
P 50 ? PO2
Les équations décrivant la liaison (développement)

Mb + O2 Δ MbO2

[ MbO2 ]
K? K = constante d’affinité
[ Mb ][O2 ] = constante d’association

Mb : 1 site de liaison de O2

[ MbO2 ] K [ Mb][O 2 ]
? ? ?
[ Mb ] ? [ MbO 2 ] [ Mb ] ? K [ Mb ][O 2 ]
Les propriétés de liaison de O2 de la Mb permettent
l’extraction de O2 du sang

Forte affinité pour O2

P50 : 4 mmHg

PO2 capillaires : capillaires

30 mm Hg

Courbe hyperbolique
3) Dynamique du relargage de O2 par Mb

k1
K? Libération de O2,
k ?1 sans sortie

Régulation de l’affinité
au niveau de k-1

Le degré d’affinité Sortie de O2 de Mb

de Mb pour O2
dépendrait de la
flexibilité de Mb
C) Transport de O2 par l’hémoglobine
1) Propriétés du transporteur efficace

• Liaison de O2 quand PO2 ≅ 100 mm Hg (poumon)

• Libération de O2 quand PO2 ≅ 30 mm Hg (tissus)

Transfert d’une fraction significative d’O2 vers les tissus

2) Courbes de liaison pour différents types de transporteurs
a) Transporteur à forte affinité b) Transporteur à faible affinité

θ θ
myoglobine myoglobine
Transporteur
à forte affinité
PO2 (poumon)

PO2 (tissus) Transporteur

à faible affinité

Hyperbole Hyperbole

• Bonne aptitude à la liaison, • Inefficace pour la liaison,

• Relargage difficile • Relargage facile
Courbes de liaison pour différents types de transporteurs
- suite -
c) Affinité faible et forte

θ θ
Transporteur Liaison forte
Myoglobine
à forte affinité

PO2 (poumon) Transition

Protéine de faible - forte
transport

Liaison faible

Courbe : sigmoïde Courbe sigmoïde expliquée

Efficace pour la fixation par une transition entre affinité
et le relargage faible vers une affinité forte
 3) La représentation de Hill
a) Equation pour la myoglobine (sans coopérativité)

PO2 ? PO2
Myoglobine ? ? ?
P 50 ? PO2 1? ? P50

?
log ? log PO ? log P50
1? ? 2
 ?
b) La courbe de Hill pour Mb log ? log PO ? log P50
1? ? 2

Etat de forte affinité

Pente = 1
Transition entre états
Pente > 1

?1???
?log Pente = 1
myoglobine

Etat de faible affinité

Pente = 1

log P50 log PO2

c) La courbe de Hill pour Hb

Etat de forte affinité

Pente = 1
Transition entre états

?1???
Pente > 1

?log
myoglobine

Etat de faible affinité

Pente = 1

log PO2
Avantage de la représentation de Hill
forte affinité

transition

Pente : coefficient de Hill

?1???
log ?
Etat de faible affinité
Pente = 1
• Reflète le ° de coopérativité
faible affinité • Pour Hb nH ≅ 3,5

log PO2

• Permet de voir la transition de l’état de faible affinité

vers l’état de forte affinité
• Distinction entre coopérativité positive et négative
• Permet de quantifier la coopérativité : mesure de la pente
Χ Mais il faut travailler sur une large gamme de concentration
d) Equation pour la représentation de Hill dans
le cas d’une protéine avec coopérativité

?
log ? n H log PO ? n H log P50 nH : coefficient de Hill
1? ? 2

e) Equation décrivant la saturation en fonction de PO2

nH
PO2
? ? nH nH
P50 ? PO 2
Pour une protéine à 4 sites, présentant un coopérativité positive

1 < nH ≤ 4
 ? PO2
?
1? ? P50

?
log ? log PO ? log P50
1? ? 2

nH nH
PO2 PO2
? ? ? ? nH nH
nH nH P50 ? PO2
P 50 ? PO2
?
log ? n log PO ? n log P50
1? ? 2
III) Modèles physiques expliquant l’allostérie

 Modèle de Monod, Wyman,Changeux (MWC)

= modèle concerté = modèle de symétrie(1965)

Monod, J., Wyman, J., Changeux, J.P. (1965). On the nature of

allosteric transitions. J. Mol. Biol. 12, 88-118

 Modèle de Koshland, Nemethy, Filmer (KNF)

= modèle séquentiel
Koshland, D. E., Nemethy, G., Filmer, D. (1966) Comparison of
experimental binding data and theoritical models in protein
containing subunits. Biochemistry, 5, 365-385

 Modèle des équilibres multiples

A) Modèle MWC = modèle concerté
1) Présentation du modèle
Ce modèle considère que :

Χ les protéines allostériques sont des oligomères constitués

de s.u (= protomères) identiques

Χ les s.u. sont disposées de manière symétrique les unes

par rapport aux autres

Χ chaque s.u. contient un site de liaison du ligand

Χ l’oligomère peut exister dans deux états conformationnels

différents; ces états conformationnels sont en équilibre

Χ la transition entre les deux états conformationnels se

fait avec rétention de la symétrie
2) Représentation schématique des équilibres dans le modèle
MWC
T (tendu) R (relâché)
Faible affinité O2 Forte affinité O2
[T0]
L=
0 O2 / Hb [R0]
KST KSR
1 O2 / Hb KSR
α=
KST KSR KST

2 O2 / Hb
KST KSR sans O2
3 O2 / Hb O2 lié
KST KSR
4 O2 / Hb Niveau
macroscopique
 L’allostérie est expliquée par un déplacement de

l’équilibre des états conformationnels lors de la liaison

du ligand (vers l’état ayant l’affinité la plus élevée).

3) Modèle MWC au niveau microscopique

T (tendu) R (relâché)
Faible affinité O2 Forte affinité O2
1 2 1 2
3 4 3 4
 Modèle MWC (niveau microscopique)
T (tendu) R (relâché)
Faible affinité O2 Forte affinité O2
1 2 1 2
3 4 3 4
 ALLOSTERIE
Résumé :

- Fixation d’un ligand sur une protéine modifie la fixation

d’autres ligands

- Nécessité d’avoir au moins deux sites

(sites non indépendants)
- S’observe souvent pour des protéines oligomériques

- Etude de l’Hb comme exemple de protéine allostérique

B) Modèle séquentiel (KNF)

1) Le modèle

La liaison d’un ligand à une s.u.

• change la conformation de cette dernière

• affecte l’affinité des autres s.u pour le ligand

Extension du concept
d’ajustement induit
 2) Représentation des équilibres
T
sans L
L L lié

Possibilité de présence d’états hybrides

R
Modèle MWC Modèle séquentiel
T R
 C) Equilibres multiples
Modèle MWC

T R
D) Illustration de la liaison de O2 à Hb

dans la cadre des différents modèles

Liaison de O2 par Hb (modèle MWC)

[O2] croissantes
Sous-unité Hb
faible affinité
O2
Sous-unité Hb
forte affinité Pas O2 fixé
Hb tétramère « T » O2 fixé

Hb tétramère « R »
Liaison de O2 par Hb (modèle KNF)

[O2] croissante
Sous-unité Hb
faible affinité
O2
Sous-unité Hb
forte affinité Pas O2 fixé
Hb tétramère « T » O2 fixé

Hb tétramère « R »
 Données récentes concernant la liaison de O2 à Hb (Ackers)

Hb : dimère de dimère (αβ)2

O2 O2
α1 α2 O2
β1 β2

État R

Affinité 20x supérieure

État T

MWC / KNF Adapté de Ackers et al. Science (1992) 255, 54-63

IV) Changements de structure de Hb après fixation de O2

A) Changement local au niveau de l’hème

Histidine proximale

Forme désoxy Forme oxy

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html
#ChangeMovie
 Histidine proximale

Forme désoxy Forme oxy

contrainte

contraintes
Transition
Effet de la liaison de O2

Mouvement de l’héiice F

Remplacement de HisF8 par

Gly et addition d’un imidazole
(sans liaison covalente)

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobi
n/MetalComplexinBlood.html#ChangeMovie
IV) Changements de structure de Hb après fixation de O2

A) Changement local au niveau de l’hème

Histidine proximale

0,4 Å

désoxygéné oxygéné

http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/heme_b_HIS.html
B) Changement de la structure IV de Hb
1) Rotation des dimères α/β les uns par rapport aux autres

désoxy oxy

http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/entrance.html

http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/gallery.html
2) Modification des interactions entre s.u.

His

T
P

désoxyHb oxyHb

Changements de la cavité entourant l’hème

http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/entrance.html
http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/cavity.html
La courbe de Hill pour Hb

Etat de forte affinité

Pente = 1
Transition entre états

?1???
Pente > 1

?log
myoglobine

Etat de faible affinité

Pente = 1

log PO2
Vue globale des changements de structure de Hb

Propagation d’un changement de structure local

vers l’ensemble de la protéine
V) Effets d’autres ligands sur le comportement allostérique
de Hb – Les effecteurs allostériques -
A) Fonction de Hb et régulation

Hb
Libération du CO2 Fixation O2 au niveau
des poumons

Transport CO2 vers Transport O2

les poumons vers les tissus

Fixation de CO2 Libération de O2 au

produit par les tissus niveau des tissus
http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html#ChangeMovie
V) Effets d’autres ligands sur le comportement allostérique de Hb
– Les effecteurs allostériques -

A) Régulation de Hb

poumon

Hb-CO2 Hb-O2

tissus

http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html#ChangeMovie
Quels sont les effecteurs allostériques de Hb ?
 Au niveau des tissus

Production de CO2 (PCO2 = 40 mm Hg) Si activité intense

(tissu musculaire)

Acidification des érythrocytes Déficit en O2

Anhydrase carbonique
CO2 + H2O Δ HCO3- + H+ Production
d’acide lactique

Acidification
(tissu et sang veineux)

Demande O2 plus élevée

Nécessité d’une régulation de Hb par pH et CO2

Molécules produites lors du
métabolisme cellulaire et tissulaire Si activité intense
(tissu musculaire)
Métabolisme cellulaire
Déficit en O2

Production
d’acide lactique

Production de CO2
Acidification
(PCO2 = 40 mm Hg)

Demande O2 plus élevée

Nécessité de transport
( Hb libre) Dissociation plus importante
de Hb-O2
Régulation de Hb par pH et CO2
B) Régulation par le pH et le CO2

1) Effet de pH (effet de Bohr)

Baisse de pH < 7,4 (capillaires des tissus)

Diminution de l’affinité de Hb pour O2

Hb – 4 O2 + nH+ Δ Hb – nH+ + 4 O2

Libération plus importante de O2

 L’effet de pH sur la liaison de O2 à Hb s’explique par une plus
grande affinité de certains sites pour H+ dans la forme désoxy

- Contribution majeure de His 146 en C-ter des s.u. β

Pont salin entre Asp 94 et His 146 protonée
(existe dans la forme désoxy)

_ His 146 protonée a un pKa élévé

_ His 146 déprotonée a un pKa normal (~ 6,5)

- Mais aussi autres résidus (NH2 ter des s.u. α)

L’acidification déplace l’équilibre vers la forme désoxy Hb

 L’effet de pH sur la liaison de O2 à Hb s’explique par une plus
grande affinité de certains sites pour H+ dans la forme désoxy

- Contribution majeure de His 146 en C-ter des s.u. β

Pont salin entre Asp 94 et His 146 protonée
(existe dans la forme désoxy)

- Mais aussi autres résidus (NH2 ter des s.u. α)

L’acidification déplace l’équilibre vers la forme désoxy Hb

2) Modification des interactions entre s.u.

His

T
P

désoxyHb oxyHb

Changements de la cavité entourant l’hème

http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/entrance.html
http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/cavity.html
Effet du pH sur l’affinité de Hb pour O2
tissus poumons
2) Effet du CO2
Libération du CO2 des tissus diminue l’affinité de O2
pour Hb
a) Par libération de H+
Anhydrase carbonique
Contribution à
CO2 + H2O Δ HCO3- + H+ l’effet de Bohr

Sortie des érythrocytes et

Fixation sur NH2 terminal des
transport sous forme chaînes α et β
dissoute dans le sérum
H
+
- NH3 + HCO3- - N – COO- + H+ + H2O
carbamate
L’anhydrase carbonique des érythrocytes au
niveau des tissus
Tissu Capillaire
2) Effet du CO2
Libération du CO2 des tissus diminue l’affinité de O2
pour Hb
a) Par libération de H+

CO2 + H2O Δ HCO3- + H+ Contribution à

l’effet de Bohr

Sortie des érythrocytes et

Fixation sur NH2 terminal des
transport sous forme chaînes α et β
dissoute dans le sérum
H
+
- NH3 + HCO3- - N – COO- + H+ + H2O
carbamate
b) Par stabilisation de la forme désoxy Hb
Etablissement de ponts salins entre les chaînes α et β
caractéristiques de la forme désoxy
 Résumé Poumons
(PCO2 = 0 mm Hg)
(PO2 = 100 mm Hg)
pH = 7,6

• Fixation de O2
• Déstabilisation des
extrémités carbamylées
• Libération du CO2
Transport du CO2
sous forme Tissus
• liée à Hb (PCO2 = 40 mm Hg)
• dissoute dans (PO2 = 20 mm Hg)
sérum pH = 7,2
• Libération de O2 (PO2, pH et
carbamylation)
• Carbamylation des NH2- ter
(fixation de CO2)
 Libération du CO2 au niveau du poumon
Tissu Poumon
Tissu Capillaire Capillaire poumon

Hb – 4 O2 + nH+ Δ Hb – nH+ + 4 O2

HCO3- + H+ Δ CO2 + H2O

 H+ et CO2
=
effecteurs allostériques

Transition allostérique entre

des états de forte et faible
affinité pour O2
Pourquoi l’hyperventilation conduit-elle au

vertige, voire à l’évanouissement ?

• H+ et CO2 sont des effecteurs à action rapide, facilitant
l’échange de CO2 et O2 dans le cycle respiratoire

• Autre effecteur agissant sur des périodes plus longues

et permettant une adaptation progressive des
organismes à une modification de la disponibilité en O2
C) Régulation par le DPG (diphosphoglycérate)

Observation

Χ Hb en solution a une affinité pour O2 > Hb dans érythrocytes

Χ Adaptation à l’altitude se traduit par

• Une augmentation de la synthèse d’hémoglobine

• Une modification du taux de DPG COO-

H – C – O – PO32-

H – C – O – PO32-

H
DPG diminue l’affinité de O2 pour Hb

Permet une libération plus facile

de O2 au niveau des tissus
Liaison du 2,3-DPG à la désoxy Hb
Cavité avec 8 charges +

Stabilisation de la forme désoxy

http://www.andrew.cmu.edu/user/jl2p/Hb_html/cavity.html
Le site du DPG
 Régulation par le DPG
La fixation du DPG
sur l’hémoglobine
induit un changement
de conformation qui
conduit à resserrer
la cavité en
expulsant l’O2 d’où
une baisse d ’affinité libération accrue au niveau
pour l ’O2. des tissus
Dans Hb fœtale HbF, remplacement de His β143 par Ser

HbF : α2γ2
Ser

Diminution de l’affinité de
HbF pour DPG

Augmentation de l’affinité
de HbF pour O2

Permet le passage de O2
de la mère à l’enfant
Expression de la globine humaine à différents stades
du développement
% de synthèse / globine totale

N mois

ζ2ε2, ζ2γ2, α2ε2 _ α2γ2 _ α2β2

Hb embryonnaire Hb F Hb adulte
Devlin
Effets combinés de CO2 et DPG Hb sans
effecteurs
sur l’affinité de O2 pour Hb Effets combinés du
CO2 et du DPG sur la
liaison de O2 à Hb
DPG

DPG + CO2
Sang

PO2 mm Hg
 (PCO2 = 0 mm Hg)
Au niveau du poumon (PO2 = 100 mm Hg)
pH = 7,6

Hb – 4 O2 + nH+ Δ Hb – nH+ + 4 O2

Fixation de O2 et libération de H+

CO2 + H2O Δ HCO3- + H+

Libération du CO2 à partir de HCO3-

 H+ , CO2, DPG
=
effecteurs allostériques

Modification de l’équilibre
conformationnel vers désoxy Hb
VI) Liaison du CO à Mb et Hb

CO de dimension similaire à O2 peut se lier dans la poche

de l’hème

Liaison avec une affinité supérieure à O2

Liaison difficile à réverser

TOXICITE
Fixation du CO
Les résidus bloquants dans l’état T
• La liaison coopérative de O2 à Hb est un exemple d’effet
allostérique.

• Dans la liaison allostérique, la fixation d’un ligand sur une

protéine modifie la l’affinité des sites non occupés. Les
ligands pour les différents sites peuvent être les mêmes
(O2 de Hb) ou différents.

• L’allostérie est aussi un mécanisme important de

régulation de l’activité enzymatique. Dans ce cas un type
de molécules joue sur l’affinité d’une protéine sur un
autre type de molécules.

• Les protéines constituées de plusieurs s.u. se prêtent

bien à la régulation allostérique (d’où leur présence dans
des chaînes de réactions qui doivent être finement
régulées).
• La liaison coopérative de O2 à Hb est un exemple d’effet
allostérique.

Mais l’allostérie est aussi un mécanisme important de

régulation de l’activité d’autres protéines et notamment
des enzymes .

• Les protéines constituées de plusieurs s.u. se prêtent

bien à la régulation allostérique (d’où leur présence dans
des chaînes de réactions qui doivent être finement
régulées).
VII) Mutations dans l’hémoglobine

β6 (Glu _ Val)
Effets de quelques mutations dans Hb
_ Polymérisation et formation d’hématies falciformes β6 Glu _ Val

_ Changement d’affinité pour O2

α87 (F8) His _ Tyr forme de la MetHb M Iwate

β74 (E18) Gly _ Asp liaison DPG diminué Shepherds Bush

α141 Arg _ His favorise état R Suresnes

Inhibition de la transition allostérique
_ Perte de l’hème
β42 Phe _ Ser Instable, perte de hème Hammersmith

_ Dissociation du tetramère
α136 Leu _ Pro Dissociation Bibba
 Drépanocytose
(régions tropicales
 hématies bloquant les capillaires

hématies fragiles (anémie)

http://gingi.uchicago.edu/
Dans la forme désoxy, Val se loge
dans une poche à la jonction EF
d’une chaîne β d’un autre tétramère
http://www.kidneyatlas.org/book4/adk4-04.pdf
 La Drépanocytose
Maladie héréditaire du Globule Rouge (transmission mode
autosomique récessive) :
– la fréquence est très grande (les sujets transmetteurs
atteignent 30 % de la population dans certaines
régions);
– plus de la moitié des enfants atteints décèdent avant
l'âge de 5 ans;
– les survivants développent des complications;
dégénératives à l'origine d'une lourde morbidité et d'un
raccourcissement de l'espérance de vie;
– aucun traitement curatif n'est connu.
 La Drépanocytose

Cette affection
constitue en Afrique
(au Sud du Sahara)
un réel problème de
Santé Publique 
 Anémie
Falciforme
Hemoglobin A Hemoglobin S
α2

β1

β2
α1

La différence avec l'hémoglobine A

provient du remplacement, en sixième
position de la chaîne ß, de l'acide
glutamique habituel par une valine.
Millions années
Atelier Modélisation

Travail participatif
Qu’attends-t-on de la modélisation
?
• Une représentation « intelligente » des
données
• Une capacité de prédiction
• Une capacité d’explication
• …
 Qu’est ce qu’un modèle ?
• Une expression reliant des variables à des
observables
• Une expression calculable
• Une expression qui a été construite à partir de
quelques hypothèses de départ (prémices,
axiomes, …)
– Loi d’action de masse
– Loi de conservation de la masse
– Hypothèse de Michaelis-Mentens
– Expression de flux
– …
 La cellule virtuelle

http://www.nrcam.uchc.edu/
Utilisation de Virtual Cell
La modélisation d’une cellule
Compartiment
Compartiment et objet
Modéliser un flux
Transformer en un système
d’équations
Simuler le système
 Le modèle de TJ Lukas
T. J. Lukas
A Signal Transduction Pathway Model Prototype II:
Application to Ca2+-Calmodulin Signaling and
Myosin Light Chain Phosphorylation
Biophys. J., September 1, 2004; 87(3): 1417 - 1425.
Le modèle
Quelques réactions
Enzymes et Industrie

Production et Utilisation
Enzymes in Industry

• Markets
• Types
• Scale
• Values
• Future
• Examples
 Industrial Enzyme Classes
• Commodity enzymes
– High volume (tonnes p.a)
– Low purity (but not necessarily so)
– Low cost (e.g. $5-40 per kg)
– Low profit margins
• Speciality enzymes
– Low volume (g – kg)
– High purity
– High cost ($5 – 10,000 per g)
– High profit margins
 Enzymes in Industry
• Distribution of enzymes by substrate
– Protein hydrolysing 59%
– Carbohydrate hydrolysing 28%
– Lipid hydrolysing 3%
– Speciality (analytical, pharma, research) 10%
Enzymes in Industry
Textile processing
Grain processing
Food processing
Cleaning
Feed enzymes
Diagnostic/pharma
Waste management
Other

Process % by value
Textile processing 10
Grain processing 12
Food processing 18
Cleaning 44
Feed enzymes 4
Diagnostic/pharma 4
Waste management 4
Other 4
 Industrial enzymes: Market
trends
• Increasing 10-15% annually by volume
• Increasing 4-5% annually by value
• Decreased margins for commodity
enzymes
• Increased use of speciality enzymes
– Diagnostic enzymes
– Fine chemicals manufacture
– Chiral separation
 Industrial enzymes

• Food • Amylases in bread-making

• Lipases in flavour
processing development
• Proteases in cheese
making
• Pectinases in clarifying fruit
juices
• Textiles
• Cellulases in treating
denim to generate ‘stone-
washed’
texture/appearance
• Grain
 Industrial enzymes
• Feed enzymes
• Enzymes to assist in the
digestibility of animal feeds
(cellulase, xylanase, phytase)

• Waste management • Lipases as drain-cleaning agents

• Reporter enzymes (alkaline

phosphatase, glucose oxidase, β-
• Diagnostic enzymes glucosidase) and diagnostic
enzymes (DNA polymerase)
 Industrial enzymes

• Speciality
• Biotransformations
– Lipases, esterases and
oxidoreductases for chiral separations
– Glucotransferases in synthesis of
oligosaccharides
– Thermolysin in aspartame synthesis
– Nitrile hydratases in acrylamide and
nicotinamide synthesis
– Proteases in peptide synthesis
– Penicillin acylase for manufacture of
semisynthetic penicillins
– Aspartase in the manufacture of L-
aspartate
Examples of Industrial
Enzyme Processes
– Starch conversions and the production of
High Fructose Syrups

– Aspartame biosynthesis

– Nitrile conversions
• Acrylamide
• Nicotinamide
 Corn starch processing 1
Maize grain Corn steep liquor
Germ Edible oil
Endosperm Oil meal
Hulls
Gluten

Starch Industrial and

food uses
Short chain
dextrins (foods)
Maltose syrups
Corn syrups Food additives

Ethanol
High fructose syrups
Corn starch processing 2.
Starch slurry
40% wt., pH 6.5
* Add Termamyl®
* Inject steam
* Incubate at 105oC, 5-7 min
Maltose
Adjust pH to 4.5
Reduce temperature to 95oC
Add amyloglucosidase
Glucose

Reduce temperature to 60-70oC

Add xylose (glucose) isomerase
High fructose syrup
 Enzyme step 1: Action of
Termamyl® on starch granules

• Termamyl® is an α-amylase
(cleaves α-1-4 glucosidic
bonds in starch)
• High temperature expands Maltose concentration
starch granules, making
amylose and amylopectin
chains more accessible
• Termamyl is sufficiently
stable at high temperatures if
short reaction times are used Amylase activity
• Starch hydrolysis is a batch
process (the enzyme is not 0 (minutes) 10
reused!)
 Enzyme step 2: Conversion of
maltose to glucose
• Amyloglucosidase is not as thermostable
as Termamyl (temperature must be
reduced)
• Amyloglucosidase has a pH optimum of
6.5 (Termamyl® operates optimally at 8.5):
pH must be reduced
• Reaction kinetics are slower
• Long incubations result in caramelisation
of the saccharides - resulting in product
loss and increase in impurities
 Enzyme step 3: Conversion of
glucose to fructose

• Fructose is much sweeter than glucose; it can be used

as a sweetening agent in foodstuffs, and is more
profitable than glucose
• The enzyme xylose isomerase will convert glucose to
fructose, in an equilibrium reaction
Glucose Δ Fructose
• A 50:50 mixture of glucose:fructose is sold as high
fructose syrup (HFS)
• Xylose (glucose) isomerase is much less thermostable,
and inhibited by Ca ions.
 Aspartame biosynthesis
Aspartame (L-phenylalanyl-L-aspartyl-methyl ester) is a low-calorie
artificial sweetener used widely in soft drinks and confectionary products
(e.g., Diet Coke). It can be synthesised chemically, or biocatalytically by
peptide synthesis using a thermostable protease – Thermolysin® from the
facultative thermophile, Bacillus thermoproteolyticus.

CBZ-L-Phenylalanine + L-Aspartyl-OMe
Immobilised Thermolysin in low-water content organic
solvent system: 50oC
CBZ-L-Phe-L-Asp-OMe
Chemical removal of CBZ group
(deblocking)

L-Phe-L-Asp-OMe
(Aspartame)
 Key process characteristics
• Immobilised enzyme allows continuous process and
enzyme reuse
• Proteases normally hydrolyse peptide bonds: a low
water activity solvent system (organic solvent based) is
necessary to reverse the normal equilibrium
• Organic solvents often promote enzyme denaturation:
Thermolysin® as a stable thermophilic protease
• Product recovery is easy – the CBZ-L-Phe-L-Asp-OMe
intermediate crystallizes out in the reaction media
 Column-based biosynthesis of
Aspartame®
• Thermolysin® is used in a Substrates in
column format
• Reaction will be run
continuously until Immobilised
substrate ‘breakthrough’ thermolysin
is observed
• This indicates that the Product out
enzyme efficiency is
dropping (inhibition or Column recharge
denaturation) 100%
• Several columns may be Product yield

operated in series to
achieve maximum Substrates in out-flow
0%
conversion efficiencies
Time (weeks or months)
 Nitrile biotransformations
1. Synthesis of acrylamide. A small proportion of the worlds
supply of acrylamide (about 45kT p.a.) is synthesised
biologically, using a whole cell catalyst. The catalyst is an
engineered Rhodococcus strain containing high levels of the
enzyme nitrile hydratase (NHase). This catalyst has been through
three ‘generations’ of application:

1. Use of the native organism

2. Use of a recombinant Rhodococcus where the NHase gene
was cloned and re-expressed at high levels in the parent
organism.
3. Use of a recombinant Rhodococcus where the NHase gene was
engineered to increase stability, and to reduce substrate and
product inhibition, then re-expressed at high levels in the parent
organism
 Production of acrylamide
Acrylonitrile CH2=CH-CN
NHase-containing Rhodococcus
cells in stirred tank bioreactor

Acrylamide CH2=CH-CONH2 + NH3

Acrylamide is widely used in industry as a precursor for the

formation of acrylic polymers, in the construction, paint, and
household products industries, and for laboratory use.

The biological production of acrylamide has advantages over the

chemical synthesis because of the absence of side-reactions, and the
simpler recovery of the reaction product.
Production of nicotinamide
Nicotinamide is an essential vitamin, and is widely used in the
health-food and animal food-and-feed industries. Biological
production, using the same Rhodococcus biocatalyst as for
acrylamide production, operates at about 5kT p.a.

3-cyanopyridine

Rhodococcus whole cell biocatalyst

nicotinamide
 Other large-scale industrial
enzyme processes
• Penicillin acylase
– Penicillin (produced at very high yields by
industrial-strain Streptomyces fermentations)
is converted enzymatically to 6-
aminopenicillanic acid
– 6-Aminopenicillanic acid is a substrate for
chemical or microbial conversion to valuable
commercial antibiotics (e.g. Ampicillin)
Etude de cas

Par groupe de 4.