Résonance 

paramagnétique 
électronique (RPE)

Application à l’évaluation de la production 
mitochondriale d’EROs

C. Monteil
UFR Médecine‐Pharmacie Rouen
• Partie 1 : Introduction à la RPE

Généralités
Principe
Schéma d’un spectromètre RPE
Spectre électromagnétique
Spin‐trap/spin‐probes

• Partie 2 : Application à la mesure de production mitochondriale d’EROs

• Partie 3 : avantages et limites
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Généralités
• => Technique d’analyse qui ne concerne que 
les espèces paramagnétiques, comme les 
radicaux libres, les métaux de transition (ex : 
CuII, FeII/III,MnII…)
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Généralités
• Remarques sur les grandeurs physiques et leurs 
unités

Les grandeurs magnétiques : 
champ magnétique Tesla ou Gauss (1G=10‐4T)
moment magnétique µ Am² ou J.T‐1
L’unité d’énergie en RPE
fréquence  ν = E/h  MHz ou GHz
(1 MHz = 6,6261x10‐28 J)
le nombre d’ondes 1/= E/hc
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Généralités
• Les échanges d’énergie entre matière et rayonnement

‐ La matière : niveaux d’énergie
‐ Le rayonnement : ondes électromagnétiques
 Photons 
E=hν=h(c/) E hν

h=cste de Planck 
ν =fréquence de radiation (nb d’oscillations/s)
c= vitesse de la lumière
 longueur d’onde (distance parcourue pdt le tps d’une oscillation)
http://www.lbs.fst.u‐3mrs.fr/Chap1.pps 
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Généralités
• L’électron
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Principe
• Effet Zeeman
L’électron se comporte comme un barreau aimanté qui, placé dans un
champ magnétique (B), s’aligne sur l’axe du champ. Deux populations
existent, une de basse énergie alignée au champ et une de plus haute
énergie opposée au champ
Champ nul Champ B

B
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Principe
• Effet Zeeman
Ms=+1/2 Magnéton de Bohr
9,27.10‐24 JT‐1
µ

E=gB
Champ magnétique 
Ms=‐1/2 G ou mT

B=0 B>0
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Principe
• Les transitions de RPE
E=hν=gB0
Cste de Planck
6,62.10‐34 Js
Fréquence
GHz ou MHz

Transitions => signal absorption=> raie de résonance 
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Principe
• Fréquences utilisées et bandes correspondantes

Bandes B ʋ (GHz)
L 43 mT 1,2
S 114 mT 3,2
X 336 mT 9,4
K 892 mT 25
Q 1,249 T 35
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Principe
• Interactions hyperfines
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Appareillage

échantillon détecteur
Source

Pont
console
cavité
aimant RPE
magnettek

Bruker
Partie 1 : Introduction à la RPE
Spectre RPE

Vergely et al. Archives of biochemistry and biophysics 420 (2003)

 Partie 1 : Introduction à la RPE
Spin‐trap/spin‐probes
• Spin trap + RL° Spin adduct°
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Spin‐trap/spin‐probes
• Spin trap : nitrones

(5,5‐dimethylpyrroline‐N‐oxide) 

(N‐tert‐butyl‐‐phenylnitrone)) 
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Spin‐trap/spin‐probes
• Spin trap : nitroso spin traps

(2‐methyl‐2‐nitrospropane) 

(3,5‐dibromo‐4‐nitrosobenzene sulfonic acid)) 
• Spin trap : inconvénients
‐ demie vie courte (ex adduit du superoxyde avec le DMPO = 50 s à pH 7, < 
systèmes cellulaires) car dismutation

Bartosz G Clinica chimica acta 2006

• Spin trap : inconvénients

‐ réduction par les antioxydants endogènes

‐ solution : CD‐ congélation‐concentrations élevées ‐ nouveaux spin traps

plus stables

5‐ethoxyphosphoryl‐5‐methyl‐1‐pyrroline N‐oxide
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Spin‐trap/spin‐probes
• Spin probe + RL° Spin probe° + RX

1‐hydroxy‐3‐methoxycarbonyl‐2,2,5,5‐tetramethyl‐pyrrolidine
(Dikalov et al. Biochem Pharmacol 2007) 
 Partie 1 : Introduction à la RPE
Spin‐trap/spin‐probes
• Spin probe + RL° Spin probe° + RX

Bartosz G Clinica chimica acta 2006

Partie 1 : Introduction à la RPE
Spin‐trap/spin‐probes

(Dikalov et al. Biochem Pharmacol 2007) 

(Dikalov et al. 2002) 
 DEPMPO/O2°‐

DEPMPO/°OH

DEPMPO/O2°‐ +
DEPMPO/°OH
 Avantages Limites Solution
Spin traps Identification des RL  ½ vie courte  Cyclodextrine
+++ (biodégradation,  Nouveaux 
Quantification ± bioréductions) composés ?
Spin trap + RL°

Spin adduct Constante de  Concentrations

vitesse  élevées

Concentrations 
élevées

Spin probes Constante de vitesse Spécificité AO

+++
Interprétation des  Réduction ± DETC
Spin probe + RL°
spectres +++ deferoxamine
spin probe + RX Quantification +++
Partie 2: application à la mesure de 
production mitochondriale d’EROs
Exemple 1

‐ mise en évidence de la production d’anions superoxyde dans un système acellulaire
hypoxanthine 0,5 mM + XO 5 mU/ml + CMH 0,5 mM ± antioxydants
incubation 1h 37°c ‐ congélation

Vergeade et al. FRBM 2010
 ‐ mise en évidence de la production de peroxynitrite dans un système acellulaire

‐ système in vitro : sin‐1 (5.10‐5‐5.10‐3 µM) + CMH (500 µM) ±
MEG (mercaptoethylguanidine 10‐3M)

Thèse M. Isabelle
 ‐ Mitochondries isolées rats 
Incubation Tp Krebs/Hepes + deferoxamine + DETC; 1h à 37°C puis congélation
Environ 50 µg protéines mito
‐ Application à des mitochondries isolées de rats pathologiques 
Exemple 2

100 µg protéines mito + DMPO 200 mM + glu/mal

3 min d’incubation; lecture à T° ambiante
Exemple 3 
Production tissulaire de ROS et O2°‐

‐ Production tissulaire totale de ROS :
Vg (rat) : 15‐20 mg tissu + KHB + deferoxamine+ DETC
 Incubation 30 min 37°C‐lavage‐réincubation + CMH 30 min 37°C
 Capillaires 50 µl milieu d’incubation

‐ Production tissulaire totale de superoxyde
Vg (rat) : 15‐20 mg tissu + KHB + deferoxamine+ DETC + PEG‐SOD – incubation 30 min
 + CMH‐incubation 30 min
 Capillaires 50 µl 
Production mitochondriale totale

‐ mitochondries isolées de Vg (rat) : 7‐10µg protéines + CMH 
 Capillaires en verre de 50 µl 
 Mesures en mode « Time Scan » 10 min 37°C (toutes les 10s)
Production mitochondriale de O2°‐

‐ mitochondries isolées de Vg (rat) : 7‐10µg protéines + PPH ± SOD (50 UI/ml) 

 Capillaires en verre de 50 µl 
 Mesures en mode « Time Scan » 10 min 37°C (toutes les 10s)
Activité respiratoire du complexe I

‐ mitochondries isolées de Vg (rat)  + spin label (Nox‐13.1‐OS) 

+ CMH 
+ glutamate
Exemple 4
 Génération d’O2°‐ par Fe3+ CytC en présence de NADH et H202

DMPO‐OOH
Fe3+CytC (0,1 mM), H2O2 (0,5 mM),
NADH (1 mM), DMPO (50 mM), CD
(0,1 M) 1

Fe3+CytC , H2O2 , NADH, DMPO, CD 
DMPO‐OOH
4

Fe3+CytC , H2O2 , NADH, DMPO, CD  DMPO‐OH

2

Fe3+CytC , H2O2 , NADH, DMPO, CD   3
SOD
DMPO‐X
Fe3+CytC , H2O2 , NADH, DMPO, CD 5

Fe3+CytC , H2O2 , NADH, DMPO, CD   6
Effet de la concentration de NADH sur la génération d’O2°‐ par Fe3+ CytC en présence de H202

NADH 0,1 mM

NADH 0,5 mM

NADH 1 mM

NADH 2 mM
Influence de l’oxygène sur la génération d’O2°‐ par Fe3+ CytC en présence de NADH et H202
Partie 3 : Avantages et limites
But

Comparaison de deux méthodes de détection d’EROs, dans des cultures cellulaires et 
des mitochondries isolées

2 méthodes de détection 

RPE
Microscopie confocale
CPH/PPH
Cultures ou mitochondries isolées
DCF‐DA / MitoSOX
Cultures et conditions de stress :
HL1 : H/R
32D : dépendante à l’IL3
NIH 3T3 : SVF 
Détection de la production de ROS
localisation mitochondriale vs extramitochondriale et intracellulaire vs extracellulaire
Sites de production
Production de H2O2 dans des mitochondries isolées en stade 4
Pour résumer :

Avantages :
‐ identification directe et quantification d’EROs
‐ localisation intra/extracellulaire et extra/intramitochondriale sur 
mitochondries isolées
‐ possibilité d’études ex vivo, à partir de tissus congelés
‐ congélation également possible des cellules ou mitochondries => possibilité de 
collaborations !
‐ Possibilité de mesures in vivo (Bande L)

Inconvénients
‐ interprétation des spectres parfois délicates
‐ choix des sondes
‐ Détection au niveau d’une seule cellule impossible (sensibilité)
‐ détection de ROS non radicalaires impossible
‐ topographie de la production de ROS

Conclusion => Combinaison de différentes méthodologies
UV/Vis