TP enzymologie :

Etude enzymatique et structurale de la

Lactate Deshydrogenase (LDH)
Compte rendu

Enseignants: Bruno Collinet et Solène Lefebvre

Groupe: Léa Politis et Adèle Gambino (groupe Db)
Le 15 novembre 2017

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Introduction
Les enzymes contrôlent la majorité des réactions du vivant. Elles participent à la régulation de
nombreuses voies métaboliques. Les lactates déshydrogénases (LDH), sont des protéines
enzymatiques clefs de la fermentation lactique. Elles réduisent le pyruvate en lactate, selon la
réaction suivante:

Lors de ce TP, nous avons premièrement étudié l’activité enzymatique de la LDH du muscle
(d’autres groupes ont étudiés la LDH du cœur), en faisant un dosage par spectrophotométrie
de celle-ci, dans le sens de production du lactate. Puis nous avons fait une étude de saturation
de la LDH de muscle par le pyruvate en réitérant cette expérience de dosage avec des
concentrations en substrat croissante. Cela nous a permis de déterminer les paramètres
cinétiques de l’enzyme.

Nous avons ensuite réalisé une étude structurale de la LDH, dans le but de déterminer sa
structure quaternaire. À l'aide d'une électrophorèse en conditions dénaturantes, nous avons pu
déterminer le poids moléculaire d'une des sous-unités de la LDH. Puis une chromatographie
d'exclusion moléculaire en condition natives nous a permis de connaitre la masse moléculaire
totale de l'enzyme. Nous avons ainsi pu déterminer le nombre de sous-unités constituant la
LDH.

Enfin, en utilisant le logiciel PyMOL et la protein data bank (PBD) nous nous intéresserons à
la structure tridimensionnelle de la LDH du muscle dans le but de compléter les informations
expérimentales obtenues précédemment.

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 I- Etude de l’activité enzymatique de la LDH
A. Dosage de l’activité de la LDH

But :
Cette manipulation a pour but de doser l'activité de la LDH musculaire. Elle permet
également de perfectionner nos techniques de pipetage (usage des différentes pipettes par
exemple) et d'améliorer notre précision pour la suite du TP.

Méthode:
Nous avons observé, à l’aide d’un suivi par spectrophotométrie, l’évolution de la réaction
suivante :
Pyruvate + NADH Lactate + NAD+

Nous avons mesuré la disparition du NADH au cours du temps.

Le spectrophotomètre nous donner automatiquement les vitesses initiales des 6 essais
effectués afin d'en faire une moyenne et ainsi d'en déduire l'activité spécifique des LDH à
l'aide de la loi de Beer Lambert (A= Ɛ x l x C)

Léa Politis Absorbance initiale du Vitesse initiale Activité

NADH (ΔA.min-1) spécifique
(μmol.min-
1.mg-1) ou
(UI.mg-1)
Essai 1 0,943 0,2008
Essai 2 0,949 0,1834
Essai 3 0,963 0,1924
Moyenne des 3 0,952 0,1922 247,2
essais
Ecart type 0,01027 8,702.10-3
% d’erreur 1,07 4,5

Détails des calculs

Moyenne :

Formule générale :

Absorbance du NADH : Vitesse initiale en ΔA 340nm.min-1 :

𝐸1+𝐸2+𝐸3 0,943+0,949+0,963 𝑉1+𝑉2+𝑉3 0,2008+0,1834+0,1924
= = = 0,952 = = = 0,1922
𝑛 3 𝑛 3

Ecart type :

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Formule générale :

Absorbance du NADH :
√(0,943−0,952)2 +(0,949−0,952)2 +(0,953−0,952)²
σn-1= = 0,01027
2

Vitesse initiale en ΔA 340nm.min-1 :

√(0,2008−0,1922)2 +(0,1834−0,1922)2 +(0,1924−0,1922)²
σn-1= = 8,702.10-3
2

% d’erreur :

σn−1 ∗ 100
Formule générale :

Absorbance du NADH : Vitesse initiale en Δ Abs 340nm.min-1 :

0,01027∗100 8,702.10−3∗100
% d‘erreur = = 1.07 % % d‘erreur = = 4.5 %
0,952 0,952

Activité spécifique de la LDH exprimée en mmol.min-1.mg-1 de protéine :

L’activité spécifique correspond à la quantité de substrat transformée par mg d’enzyme par

minute.
Elle peut s’écrire : 𝐴s = 𝑉i * 𝑚
Avec :
- l’activité spécifique As s’exprime en mmol.min-1.mg-1
- la masse de l’enzyme 𝑚 en mg
- 𝑉i, la vitesse initiale moyennée de la réaction en mol.l-1.min-1 correspondant ici à la
concentration de NADH consommée.
Afin de calculer cette concentration, nous utilisons la loi de Beer- Lambert : 𝐴=ε × l × c
Avec :
- ε, le coefficient d’extinction molaire pour le NADH à la longueur d’onde de 340nm
ε = 6220 M-1.cm-1
- l, longueur de la cuve l = 1cm
- A : Absorbance
- c, concentration de NADH consommée en mol.L-1

ΔA
On a donc ΔA = ε×l×Δc qui se transforme en : Δc =
ε×l

Et la vitesse moyenne initiale, Vim = 0,1922 ΔA.min-1

0,1992 30,9
= 3,09 x 10-5 M.min-1 = 30,9 µmol.L-1.min-1 = µmol.mL-1.min-1
6220∗1 1000

Nous calculons ensuite la quantité d’enzyme.

Concentration d’enzyme : [LDH]= 5mg.ml-1

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Cette concentration a été diluée au 400eme dans un volume de 10mL dans une cuve de 1ml
(soit une dilution au 100eme).

Ainsi la quantité de LDH dans la cuve est :

5
[LDH] = 400∗100 =1,25×10−4mg.mL-1

Nous pouvons désormais calculer l’activité spécifique de la LDH :

30,9
1000
𝐴s = = 247,2 µmol.min-1.mg-1
1,25∗10−4


B. Protocole de dosage de l'activité de la LDH

Il existe de multiples méthodes de suivi des réactions enzymatiques Le protocole du TP nous
permet d’obtenir la vitesse initiale Vi (en ΔA.min-1) de la réaction de catalyse, en utilisant la
spectrométrie. Le NADH absorbe à 340nm et son oxydation en NAD+ (qui n’absorbe pas à
340nm), nous permet de suivre l’évolution de la réaction catalysée par la LDH. Le pyruvate
est introduit en excès par rapport à l’enzyme afin d’obtenir une courbe de saturation. On est
dans une situation d’excès de substrat : [S0]>>[Et]. On obtient ainsi la Vmax, la Km et la Ki
de l’enzyme. Pour obtenir ces valeurs le pyruvate est introduit dans des quantités variables. Le
tampon, le NADH et l’enzyme sont toujours introduits dans les mêmes volumes dans la cuve
de spectrométrie. Afin de toujours obtenir une solution d’un volume de 1ml dans la cuve la
quantité d’eau introduite varie pour compenser le pyruvate.

Les différents éléments résumés dans le tableau ont été introduits dans une cuve de
spectrophotomètre dans l'ordre dans lequel ils figurent dans le tableau. Après addition du
pyruvate, on établit le "blanc", c'est à dire que l'on mesure à 340 nm l'absorbance de
l'ensemble de la cuve et des composés déjà présents (tampon, eau et pyruvate).
On vérifie après addition du NADH que l'absorbance est voisine de 0,9 , absorbance
théorique du NADH.
La réaction démarre après ajout de LDH, on enregistre la variation d'absorbance au cours du
temps.

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Nous avons réalisé les tests ci-dessous afin d’obtenir les différentes mesures de la vitesse initiale en fonction de la concentration en pyruvate. Les
tests et leurs résultats sont montrés dans le tableau suivant :

Concentration 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 1 1,5 2 4 6 8
de pyruvate
dans l’essai
(mM)
Volume de 500
Tampon (μL)
Volume d’H2O 479 478 477 476 475 470 460 455 450 445 440 435 430 405 380 280 180 80
(μL)
Volume de 10
NADH
(μL)
Volume de 1 2 3 4 5 10 15 20 25 30 35 40 50 75 100 200 300 400
solution mère
de Pyruvate à
20mM (μL)
Volume 10
d’enzyme
(μL)
Enregistrement des cinétiques pendant 30s
Vi (ΔA.min-1) 0,01 0,04 0,03 0,04 0,05 0,09 0,11 0,16 0,18 0,16 0,19 0,18 0,13 0,20 0,22 021 0,17 0,19
49 65 68 76 78 35 68 03 02 56 19 81 92 11 19 20 84 43

Par la suite, nous avons rentré les données dans le logiciel Kaleidagraph et obtenu le graphique suivant :

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Lors d’une cinétique de Michaelis-Menten la vitesse initiale croît exponentiellement jusqu’à
atteindre un plateau, la Vmax. La courbe obtenue présente une cinétique qui ne correspond
pas à un mécanisme Michaelien classique. En effet, en introduisant le substrat en excès la
vitesse atteint rapidement un maximum avant de décroître. Il n’y a donc pas de plateau aux
alentours de l’asymptote de Vmax. La décroissance observée représente le phénomène
d’inhibition par excès de substrat. Il s’agit ici d’une inhibition par excès de substrat. La
courbe violette est la courbe théorique correspondante à notre modèle, elle a pour équation :
𝑉𝑚𝑎𝑥∗[𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑒]
[𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑒]
𝐾𝑚+[𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑒]+
𝐾𝑖

Afin d’améliorer la corrélation de nos points et de la courbe théorique qui doit être obtenue,
nous avons décidé d’écarter deux points. Ainsi notre coefficient de corrélation R², passe de
0,97563 à 0,98807.

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8
Les paramètres cinétiques de la LDH retenus sont obtenus avec le deuxième graphique.
Ainsi :

- Vmax = 0,28533 mM
- Km = 0,35797 ΔA.min-1
- Ki = 14,702 mM
Nous souhaitons déterminer l’activité spécifique de la LDH (en μmol.min-1.mg-1) à partir de la
valeur de la Vmax obtenue avec le deuxième graphique.
L’activité spécifique correspond à la quantité de substrat transformée par mg d’enzyme par
minute.
Elle peut s’écrire : 𝐴s = 𝑉max * 𝑚
Avec :
- l’activité spécifique As s’exprime en mmol.min-1.mg-1
- la masse de l’enzyme 𝑚 en mg
- 𝑉max, la vitesse maximale de la réaction en mol.l-1.min-1 correspondant ici à la
concentration de NADH consommée.
Afin de calculer cette concentration, nous utilisons la loi de Beer- Lambert : 𝐴=ε × l × c
Avec :
- ε, le coefficient d’extinction molaire pour le NADH à la longueur d’onde de 340nm
ε = 6220 M-1.cm-1
- l, longueur de la cuve l = 1cm
- A : Absorbance
- c, concentration de NADH consommée en mol.L-1

ΔA
On a donc ΔA = ε×l×Δc qui se transforme en : Δc =
ε×l

Et la vitesse maximale, Vmax = 0,28533 ΔA.min-1

0,28533 45,9
= 4,59 x 10-5 M.min-1 = 45,9 µmol.L-1.min-1 = µmol.mL-1.min-1
6220∗1 1000

Nous calculons ensuite la quantité d’enzyme.

Concentration d’enzyme : [LDH]= 5mg.ml-1
Cette concentration a été diluée au 400eme dans un volume de 10mL dans une cuve de 1ml
(soit une dilution au 100eme).

Ainsi la quantité de LDH dans la cuve est :

5
[LDH] = 400∗100 =1,25×10−4mg.mL-1

Nous pouvons désormais calculer l’activité spécifique de la LDH :

45,9
1000
𝐴s = = 367,2 µmol.min-1.mg-1
1,25∗10−4

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A partir de l’AS, nous pouvons obtenir la constante catalytique Kcat, l’activité spécifique
moléculaire donc la rapidité de l’enzyme à transformer le substrat, c’est-à-dire le turn over de
la LDH.
Asm= As.MM s-1
On peut aussi déterminer la Kcat grâce à cette relation :
𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑉𝑚𝑎𝑥=𝐾𝑐𝑎𝑡×[𝐸0] ↔ 𝐾𝑐𝑎𝑡= [𝐸0]

V𝑚𝑎𝑥=4,59 x 10-5 µM.min-1

D’après les résultats de la chromatographie du muscle est de 142 000 Da=142 000g.mol-1

Donc [𝐿𝐷𝐻]f= [𝐿𝐷𝐻]en g.L-1/ MM LDH muscle = 1,25×10-4/142 000 = 8,8×10-10 M

𝐾𝑐𝑎𝑡=𝑉𝑚𝑎𝑥 / [𝐸0]=4,59×10−5 / 8,8×10−10= 5,22 ×104 min-1= 5,22×104/60= 870 s-1

Une mole de LDH peut donc catalyser 870 réactions par seconde.

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II- Etude de la structure quaternaire de la LDH

A. Electrophorèse en conditions dénaturantes

Afin de connaitre la structure quaternaire de l’enzyme LDH, nous étudions un gel
d’électrophorèse SDS-PAGE. Cela consiste à faire migrer des protéines dans un gel de
polyacrylamide, sous l’influence d’un champ électrique, permettant ainsi leur séparation. Pour
cela, la lactate deshydrogenase, est mise en contacte d’un détergent anionique, le SDS
(dodecyl sulfate de sodium) qui dénature et charge négativement les protéines, ainsi que d’un
agent réducteur (le β-mercaptoéthanol) qui va détruire les ponts disulfures. Les protéines vont
perdre leur structure quaternaire qui les auraient bloqué dans les mailles du gel et elles auront
toutes une charge apparente négative et migreront donc vers l’anode. Cela signifie que seul le
poids moléculaire des protéines sera le facteur de leur séparation. Les protéines ayant un petit
poids moléculaire, seront moins retenues dans les pores du gel et migreront donc plus loin que
les grosses. Des marqueurs dont la masse moléculaire est connue vont nous permettre de
déduire celle d’une sous-unité de LDH.
Les résultats de l’électrophorèse sont analysés par l’intermédiaire du facteur Rf qui définit la
mobilité relative des protéines :

Log(MM) Rf

1,97 0,22

1,83 0,34

1,65 0,54

1,46 0,74

1,96 0,30

Nous avons grâce à la courbe étalon pu déterminer la masse moléculaire d’une sous unité de
la LDH.
En effet, la Rf de la LDH est égale à 0,67 car la distance parcouru lors de l’électrophorèse est
de 5,6cm pour une distance de front de migration de 8,5cm. Nous avons ensuite regardé à
quelle valeur de log(MM) correspond 0,67 et nous avons pu en conclure que :
Rf = 0,68 ↔ Log(MM)=1,55= 35,5 KDa.
La masse moléculaire d’une sous unité de la LDH de cœur est égale à 35,5KDa.

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 B. Chromatographie d’exclusion moléculaire en conditions natives
La chromatographie d'exclusion permet la séparation des molécules à travers un gel poreux en
fonction du poids moléculaire de la protéine. La phase stationnaire est constituée de billes de
polysaccharide poreuses. La phase mobile est constituée d’un éluant (eau, tampon,..) servant à
entrainer les molécules du mélange. Les grosses molécules sont éluées en premier car leur
diamètre (rayon de Stokes, Rs) est supérieur à celui des billes poreuses. Les petites molécules
sont éluées en dernier de par leur petit diamètre et leur capacité à entrer dans les pores des
billes ce qui ralentit leur migration. On s’est servi de cette technique pour déterminer la masse
moléculaire de la LDH native.
On utilise les protéines marqueurs dont on connait la masse moléculaire et le Rs pour réaliser
une gamme étalon qui nous permettra de trouver la MM et le Rs de la LDH. Le bleu dextran,
étant une grosse molécule, sera l’indicateur V0 (volume mort, c’est-à-dire l’espace entre les
billes) et le bichromate potassium de faible masse moléculaire représentera Vt (volume total).
Le reste des marqueurs sont des protéines standard de MM et Rs connus. Le chromatogramme
obtenu nous indique les Ve (volume d’élution) de ces marqueurs.

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Dans le but de réaliser le graphique √-logKav=f(Rs) ou bien Kav=f(logMM), on a utilisé la
formule suivante : Kav=(Ve-Vt)/(Vt-V0), Kav étant le coefficient de distribution.

Premier graphique: √-logKav= f(Rs):

Protéine √-logKav Rs

Ferritinine 0,8075 61

Catalase 0,6908 52,2

Aldolase 0,6467 48,1

Albumine (BSA) 0,5554 35,5

Ovalbumine 0,4986 30,5

Chymotrypsinogène 0,3938 20,9

Ribonucéase A 0,3476 16,4

Lactate deshydrogénase (LDH) 0,6229 44,5

Par détermination graphique on obtient une valeur de 45 Ångströms pour le rayon de Stokes
Rs de la LDH du muscle. (Voir annexe 1)

Nous avons ensuite calculé la masse moléculaire de la LDH:

Avec : η = 0,01 poise Rs= 44,5. 10-8 cm

S20,w =7,3.10 –13 secondes N= 6,022 1023 mol-1
υ =l0,73 cm3.g-1 ρ =1 g.ml-1

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donc MM= (6*3,14*0,01*44,5.10^-8*7,3.10^-13*6,022.10^23)/(1-0,73*1)= 136502 Dalton
donc 136,502KDa
Deuxième graphique: Kav=f(logMM)

Protéine log(MM) Kav

Ferritinine 2,64 0,2228

Catalase 2,37 0,3333

Aldolase 2,19 0,3817

Albumine (BSA) 1,83 0,4915

Ovalbumine 1,63 0,5642

Chymotrypsinogène 1,40 0,6997

Ribonucéase A 1,14 0,7571

Par lecture graphique on obtient une masse moléculaire de 136KDa. (Voir annexe 2)
On peut conclure que la LDH est un homotetramère car elle contient 4 sous-unités identiques,
c’est donc un tétramère.

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III. Visualisation de la structure de la LDH à l’aide du logiciel Pymol
Après avoir étudié la cinétique et la structure quaternaire de la LDH du muscle de lapin, nous
avons suivi les questions / réponses d’un tutoriel avec le logiciel Pymol pour visualiser la
structure tridimensionnelle de la LDH grâce aux données du site Protein Data Bank (PDB).
1. Préciser par quelle la structure a été résolue (RMN, radiocristallographie aux rayons
X, microscopie électronique ou autre ?) ; à quelle résolution cette structure a-t-elle été
obtenue ?
La structure de la LDH a été résolue par radiocristallographie aussi appelée diffraction par
rayons X. La structure a été obtenue avec une résolution de 2,38 angströms.

2. Quels sont les 3 ligands co-cristallisés avec la structure ? Sont-ils des substrats de la
LDH ?
Les 3 ligands co-cristallisés avec la LDH sont :
- Le NAI (NADH), co-substrat de la LDH
- L’acide oxamique ou oxamate, analogue du substrat qui a sans doute une fonction
d’inhibiteur compétitif de l’enzyme en prenant la place du substrat et en ralentissant
l’oxydation du NADH en NAD+.
- L’ion acétate, qui agit comme un tampon lors de la cristallisation

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 3. Combien de sous unités (au total) identifiez-vous ? Quelle est la structure quaternaire
de la LDH ?
Après avoir masqué les molécules d’eau et les atomes des chaînes latérales nous avons colorié
chaque sous unité d’une couleur différente. Sur l’écran, nous avons alors pu observer deux
molécules de la LDH (maille) composées chacune de 4 sous-unités. La LDH est donc un
tétramère.
4. Décrivez le contenu de structures secondaires de la sous-unité.
Dans une sous-unité de la LDH, on observe des hélices alpha en périphérie et des feuillets
beta parallèles et antiparallèles au centre. La sous-unité présente également des cofacteurs :
l’oxamate et le NADH, qui jouent probablement un rôle dans l’activité catalytique de
l’enzyme.
5. Combien identifiez-vous d’atomes d’azote et de phosphore dans le NADH et dans la
molécule d’oxamate ?
Le NADH possède 7 atomes d’azote et 2 atomes de phosphore tandis que l’oxamate possède
un seul atome d’azote.

6. Quels sont les 5 acides aminés identifiés à moins de 4 angströms de l’oxamate (donnez
leur nom et leur numéro dans la séquence) ?
Les 5 acides aminés identifiés à moins de 4 angströms de l’oxamate sont :
- L’asparagine (N) 137
- L’histidine (H) 192
- La thréonine (T) 247
- L’arginine (R) 168
- L’alanine (A) 237

7. Combien de liaisons hydrogènes identifiez-vous ? Pour chacune d’entre elles, dites

avec quel acide aminé elles sont engendrées.

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On peut identifier 5 liaisons hydrogènes entre l’oxamate et les acides aminés environnants.
Deux sont engendrées entre des oxygènes et l’arginine R 168, deux sont engendrées entre la
thréonine T 247 et un azote et un oxygène et une est engendrée entre un oxygène et
l’asparagine N 137
8. Visualisez l’atome de souffre au voisinage d’un des 2 riboses du NADH : de quel
acide aminé provient-il (donner son nom et son numéro dans la séquence)?
L’atome de souffre au voisinage d’un des 2 riboses du NADH provient de la méthionine
M 53.
9. Calculez la distance entre l’atome de souffre identifié à la question Q8 et l’atome
d’oxygène porté par le carbone C2 du ribose portant l’adénine du NADH.
La distance entre l’atome de souffre identifié à la question Q8 et l’atome d’oxygène porté par
le carbone C2 du ribose portant l’adénine du NADH est de 3,5 angströms.
10. Calculez maintenant la distance entre l’atome d’azote de l’oxamate et l’atome
d’oxygène porté par le carbone C2 du ribose portant le groupement Nicotinamide du
NADH.
La distance entre l’atome d’azote de l’oxamate et l’atome d’oxygène porté par le carbone C2
du ribose portant le groupement Nicotinamide du NADH est de 6 angströms.

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Conclusion

Ces expériences avaient pour but d’effectuer une étude enzymatique et structurale de la lactate
déshydrogénase grâce à différentes techniques. On s’est particulièrement intéressés à deux
isoformes de cette enzyme: la LDH cardiaque et la LDH musculaire, afin de comprendre les
différences de ces deux dernières.
Premièrement, nous avons effectué l’étudie enzymatique de la LDH et l’étude de sa fonction
de saturation. On a observé différents comportements cinétiques selon le type de sous-unités
(musculaire ou cardiaque) de la LDH. Effectivement, ces isoformes de la LDH sont
spécialisées dans des tissus au fonctionnement très différents d’où le fait qu’on obtienne des
cinétiques enzymatiques différentes. Ce qui nous a permis de déterminer que cette enzyme est
inhibée par excès de son substrat, le pyruvate.
Ensuite, les techniques d’électrophorèse en conditions dénaturantes et de chromatographie
d’exclusion en conditions natives, nous ont permis de déterminer la masse moléculaire et le
nombre de sous- unités de la LDH. On a découvert que la LDH est un tétramère puisqu’elle
possède 4 sous-unités.
Enfin, l’utilisation du logiciel PyMOL et de la PBD, nous a permis de visualiser la structure
moléculaire de la LDH de cœur et de ses ligands (NADH et l’oxamate qui est un inhibiteur
compétitif). Cela, afin de comprendre l’interaction de ces derniers dans le site actif. On a donc
pu déterminer les types de liaisons dans cette protéine et les liaisons avec ses ligands (dans le
site actif).

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