LU3SV611 - EC2 du 29 mars 2022

SUJET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

TOUTES VOS REPONSES DOIVENT ETRE JUSTIFIEES.
(Tout résultat sans justification ne sera pas noté)

Le gène AP-1 code un facteur de transcription régulant l’expression de plusieurs gènes parmi lesquels le gène
codant la cycline D.

Plusieurs mutants localisés dans le gène AP-1 ont été identifiés (Figure 1).

Figure 1 : organisation du gène AP-1. La

position des 4 mutants est indiquée sur le
schéma.

M1 : délétion de 4 nucléotides
M2 : transition C>T
M3 : délétion de 3 nucléotides
M4 : transition G>A

Afin d’analyser la conséquence de ces mutations, des cellules murines déficientes pour le gène AP-1 (les deux
copies ont été délétées) sont transfectées avec un vecteur exprimant soit l’ADN d’AP-1 sauvage, soit celui portant
les mutations M1 à M4. Le niveau d’expression des ARN cycline D de ces cellules transfectées a été analysée
par northern blot 48 heures après transfection. Une analyse des extraits protéiques par western blot avec un
anticorps dirigé contre la protéine AP-1 a été également réalisée (Figure 2).

Figure 2 : analyse par northern blot ou western blot des extraits de cellules transfectées par les vecteurs
exprimant la protéine AP-1 sauvage (Ct), les mutants de la protéine AP-1 (M1 à M4). Mock : cellules non
transfectées. Les sondes ou les anticorps utilisés sont indiqués à gauche de chaque filtre.
Question 1 : justifiez la présence des contrôles dans l’expérience décrite dans la figure 2.

L’actine (northern) et la tubuline (western) sont des témoins de charge qui permettent de vérifier que la
même quantité d'ARN ou de protéines a été déposée dans les puits de chaque gel, pour que l'analyse soit
valide et pour pouvoir comparer les résultats entre les différents échantillons. Ces gènes sont utilisés
comme référence car leur expression ne varie pas d'une condition à l'autre.

Question 2 : interprétez l'expérience de northern blot en indiquant quelle(s) hypothèse (s) sont les plus
probable(s) pour expliquer les effets des mutations M1 à M4.

Le contrôle « Actine » montre qu’une même quantité d’ARN a été déposée dans chaque puits, il est donc
possible d’analyser les résultats de l’expérience.

La piste « mock » indique le niveau basal d’expression de l’ARNm de la Cycline D dans les cellules
déficientes en AP-1. La piste « Ct » met en évidence une activation de la transcription du gène de la Cycline
D par AP-1. Cette activation de la transcription est identique au contrôle « Ct » pour la mutation M1. Ceci
nous indique que la mutation M1 n'a pas d'effet sur le rôle normal de la protéine AP-1.
En revanche les mutations M2 et M4 suppriment totalement l’effet activateur d’AP-1, l’intensité de la
bande observée étant presque équivalent à celle de la piste « Mock ».
La mutation M3 produit un effet intermédiaire avec une activation qui semble plus faible que dans la piste
contrôle.

Les mutations ayant un effet sur l’activation de la transcription du gène de la Cycline D sont celles présentes
dans la séquence codante d’AP-1 (M2, M3, M4).

Les mutations M2 et M4 qui induisent le même effet sont des mutations ponctuelles susceptibles de ne modifier
qu’un seul acide aminé, la mutation M3 supprime un acide aminé dans la séquence d’AP-1. Ces informations
ne permettent pas pour l’instant d’en dire plus sur ces expériences.

Les hypothèses possibles seraient :

- Ces mutations pourraient avoir modifié la séquence de la protéine AP-1 soit dans un domaine
de fixation au promoteur du gène de la Cycline D, soit dans un domaine d’activation par AP-1
dans ce même promoteur.

Question 3 : quel est l’intérêt d’avoir réalisé un western blot ?

Le western blot permet de vérifier/montrer que la protéine AP-1 est bien présente et en quantité
équivalente dans les différents échantillons et seulement absente de la piste « Mock » car les cellules
utilisées ne possèdent plus ce gène. Les différentes mutations M1 à M4 ne perturbent pas son expression
au niveau transcriptionnel et/ou traductionnel (pas d’introduction d’un codon « Stop » pour M2 et M4),
seulement sa ou ses fonctions.

Dans une seconde série d’expériences, des extraits protéiques ont été obtenus à partir des mêmes cellules murines
déficientes en gène AP-1 transfectées avec un vecteur exprimant soit AP-1 sauvage ou les mutants de ce gène.
Chaque extrait est analysé par une approche de gel retard en utilisant comme sonde le promoteur de transcription
du gène cycline D.

Mock Ct M1 M2 M3 M4

Figure 3 : autoradiographie du gel obtenu dans

l’expérience de gel retard décrite ci-dessus avec les
migration extraits protéiques de cellules transfectées par le vecteur
exprimant la protéine sauvage (Ct), les mutants M1 à
M4. Mock : cellules non transfectées.
Question 4 : donner brièvement le principe et le but d’un gel retard.

Le but d'une expérience de gel retard est de mettre en évidence une interaction entre acide nucléique (dans
le cas présent de l'ADN) et protéine. Dans le principe, si une sonde nucléique (ADN) marquée est liée par
une protéine, sa migration dans le gel (électrophorèse en conditions non-dénaturantes) sera ralentie par
rapport à la sonde seule.

Question 5 : interprétez cette expérience de gel retard en indiquant quelle(s) hypothèse (s) sont les plus
probables pour expliquer les effets des mutations M1 à M4.

En absence de la protéine AP-1 (Mock), aucune protéine ne se fixe sur le promoteur de transcription du
gène de la Cycline D (témoin négatif). Pour les pistes « Ct », « M1 » et « M2 » un retard de migration
équivalent est observé. La protéine AP-1 se fixe sur le promoteur du gène Cycline D.
Les mutations M1 et M2 ne modifient pas le domaine de fixation à l’ADN d’AP-1. Ce qui est logique
pour M1 qui n’est pas dans la séquence codant ce gène.
La mutation M4 inhibe la fixation d’AP-1 sur le promoteur. Cette mutation doit se trouver dans le
domaine de fixation à l’ADN du promoteur de la cycline D.
La mutation M3 permet une fixation partielle d’AP-1 au promoteur d’où l’augmentation du taux
de transcription de la figure 2. Cette mutation diminuerait donc l’affinité d’AP-1 pour son site de fixation
dans le promoteur et serait localisée dans un second domaine de fixation à l’ADN de la séquence d’AP-1.

Question 6 : en vous référant aux travaux dirigés, donnez un modèle sur l’organisation structurale de la
protéine AP-1.

M2 M3 M4
Nter Cter
Domaine activateur Domaine de liaison
de transcription à l'ADN

Dans une seconde étude, deux mutants localisés en amont du +1 de transcription de la cycline D ont été analysés.
Dans les deux cas, il s’agit d’une délétion de 7 paires de bases localisée en position -250 (mutant M5) et -50
(mutant M6).
La séquence sauvage [-500 à +1] et les deux mêmes séquences contenant les mutations M5 ou M6 du gène de la
Cycline D ont été clonées dans un vecteur contenant le gène rapporteur luciférase. Ces trois plasmides et le
plasmide vide (T) ont été transfectés dans des cellules murines déficientes en gène AP-1 soit seul, soit en présence
d’un plasmide exprimant la protéine AP-1 sauvage. L’activité luciférase a été évaluée 24 heures après
transfection.

Figure 4 : activité luciférase mesurée à partir des

extraits de cellules transfectées avec les vecteurs
contenant le gène luciférase sous le contrôle du
promoteur de la cycline D sauvage (Ct) ou des
mutants M5 ou M6. T ; extrait de cellules non
transfectées. La transfection est effectuée dans des
cellules contenant ou pas un plasmide exprimant
AP-1.
Question 7 : quel est l’intérêt de ce type d’expérience et que permet-elle d’évaluer ?

Ce type d’expériences permet de mettre en évidence/d’identifier des régions contenant des séquences
promotrices ou régulatrices (activation, répression) dans l’ADN. La présence du gène rapporteur permet
de quantifier l’activité des promoteurs en présence de séquences régulatrices et/ou de mutations.

Question 8 : en interprétant ces résultats, que pouvez-vous déduire quant à la localisation des mutations
M5 et M6 ?

Dans l’histogramme de la figure 4 :

- la colonne T (plasmide vide sans promoteur) indique la valeur du bruit de fond des mesures
d’activité luciférase ;
- la colonne Ct indique la valeur correspondant à l’activité basale du promoteur du gène de la
Cycline D qui est inférieure à 1000 en absence d’Ap-1 et supérieure à 8000 en présence d’AP-
1 (activation de la transcription), AP-1 se fixe sur son site spécifique dans le promoteur du gène
de la Cycline D ;
- la colonne M5 (délétion de 7 paires de bases en position -250) montre que l’activité luciférase
reste similaire en absence ou en présence d’AP-1 et comparable au niveau basal, la délétion a
probablement supprimé le site de fixation du facteur de transcription AP-1 dans le promoteur
du gène de la Cycline D ; M5 est localisée dans une séquence de régulation proximale.
- la colonne M6 (délétion de 7 paires de bases en position -50) montre que l’activité luciférase
reste similaire en absence ou en présence d’AP-1 et comparable au valeur du bruit de fond, la
délétion a probablement supprimé une partie essentielle de la région promotrice du gène de la
Cycline D, le promoteur est inactif. M6 est localisé dans le promoteur minimal.