Paris VI Ronéos 2021-2022

Rédactrice 1 : Adèle Brisse

Rédactrice 2 : Oumeima Chaari
Relecteur : Fermaut Abéline

BIOLOGIE 4

DIFFÉRENCIATION ET CELLULES SOUCHES

(enseignement dirigé magistral)

I. Rappel des points importants de cours

1. La différenciation des cellules

2. Transcription et facteurs de transcription
3. Régulation épigénétique
4. Les cellules souches
5. La reprogrammation cellulaire
6. Applications médicales des cellules souches

II. Questions libres

 I. Rappel des points importants de cours

1. La différenciation des cellules

DIFFÉRENCIATION : acquisition d’un phénotype spécifique, en termes de

morphologie et de fonction, qui résulte de l’expression régulée d'un répertoire de
gènes.

Si l’on prend l’exemple de deux groupes de cellules :

- les cellules musculaires cardiaques doivent se contracter de façon régulière
(myosine)
- les hépatocytes stockent des lipides et du glycogène, ils sécrètent des
protéines et de l’albumine, ils font de la réponse inflammatoire, ils nettoient le
cholestérol (acinus)
Ces deux types cellulaires ont des fonctions différentes et pourtant elles ont le même
génome.
Ces différences résident dans la régulation de la transcription des gènes qu’ils
soient exprimés ou non.

On part d'une cellule œuf qui se divise et chacune de ces cellules à un

déterminisme. On passe d’une cellule souche à une cellule indifférenciée ( ou
progéniteurs, c’est-à-dire engagées dans une voie de différenciation) puis à des
cellules différenciées.
Dans la majorité des cas, ce sont des situations qui existent physiologiquement.
Mais aujourd'hui, de façon physiologique et surtout par des manipulations, on arrive
à faire le trajet inverse : rendre des cellules différenciées à un état de cellules
souches.

Ce mécanisme repose sur la régulation transcriptionnelle

des gènes (ADN→ ARN) puis de la traduction (→
protéines). Cette cellule souche (ou indifférenciée) va
répondre à son environnement et va s’adapter dans le
panel d'expression de gènes.
Elle reçoit des modifications environnementales,
métaboliques, des signaux diffusibles, des interactions
cellules-cellules ou cellules-matrice. Au final, on peut dire
qu’elle adapte l'expression des gènes (arn, protéines et
leurs fonctions).
 2. Transcription et facteurs de transcription :

Sur le schéma, on voit une région transcrite qui donnera un ARNm quand elle code
pour une protéine. Pour cela, il faut que l’ARN polymérase qui va synthétiser cette
séquence d’ARN, soit positionnée au début du gène, au début de la région qui va
être transcrite. Des facteurs généraux de transcription viennent se fixer sur la
TATA box pour permettre l’activation de l’ARN polymérase.
Cet événement se produit à chaque fois qu'il y a accès à la TATA box. Elle est
non-spécifique donc l’ARN polymérase et les facteurs généraux de transcription
viennent se fixer sur tous les gènes accessibles.

Facteurs généraux de transcription + ARN polymérase => complexe d’initiation

de la transcription

L’efficacité de fixation du complexe d’initiation de la transcription est très faible

(proche de 0). Pour qu’il devienne efficace, le complexe doit être stabilisé et stimulé.
C’est le rôle des facteurs de transcription. Ils viennent se fixer sur des séquences
CIS situées en amont ou en aval des gènes. Tous les facteurs de transcription ont
une séquence qui leur permet de se fixer à l’ADN mais ce domaine de liaison à
l’ADN peut être différent.

DOMAINE CIS = séquence d’ADN sur lequel se fixe le facteur trans (ils ont tous un
domaine de liaison à l’adn).
Les corégulateurs ( protéines qui ont des interactions protéine-protéine faibles ) ne
se fixent pas à l'ADN mais communiquent avec le complexe d’initiation à la
transcription.

CAPSULE 1 Q2: Le complexe d’initiation de la transcription varie en fonction des

gènes ce qui explique que certains sont transcrits plus efficacement que d’autres.

FAUX: Ce complexe (facteurs généraux de la transcription + ARN polymérase ) se

fixe sur la TATA Box dès que l’ADN est accessible. Cela est régulier et identique
pour tous les gènes. Ce sont les facteurs de transcription qui permettent que le
complexe soit installé fréquemment sur un gène qui va être transcrit et rarement sur
un qui va être non transcrit. En d’autres termes, ce qui fait varier la transcription, ce
sont les facteurs de transcription (qui sont recrutés en aval ou en amont par le
promoteur).
(A ne pas retenir, pour notre culture perso: certains complexes peuvent être différents car sur la TATA
box se fixe TBP qui a des protéines accessoires qui peuvent varier en fonction du type cellulaire pour
donner une plus ou moins grande affinité.)

Le complexe d’initiation à la transcription et son assemblage sont identiques pour

tous les gènes. La conséquence, c’est qu’en diagnostique, on peut utiliser ce
mécanisme. Il y a eu un concept qu’on appelle la transcription illégitime (il existe
toujours).
Si le complexe peut se mettre sur tous les gènes, ça veut dire que dans toutes les
cellules on aura tous les ARN messagers sauf que pour avoir une importance
biologique, le niveau de transcription doit être fort.
Avec la méthode PCR, on est capable de mettre en évidence un transcrit présent
dans une cellule. Mais ce n’est pas parce qu’on a réussi à mettre en évidence un
ARN dans une cellule que cela a une importance car parfois un ARN représente une
seule protéine qui n’a pas forcément beaucoup d’implication.
On peut donc l’utiliser en diagnostic sur la base de la transcription illégitime avec la
notion de bruit de fond.

Les facteurs de transcription régulent la stabilisation et la vitesse de l’ARN

polymérase II.

Qu’est-ce qu’un FACTEUR DE TRANSCRIPTION ?

C’est une protéines à 3 domaines particuliers:

- un domaine de liaison à l'ADN qui reconnaît une
séquence consensus (séquence qui est la
moyenne des séquences sur lesquelles le facteur
se fixe, pas toujours la même).
- des domaines de phosphorylation, glycosylation,
hydrolyse partielle… qui régulent son activité.
- un domaine d’interaction avec le complexe
d’initiation de la transcription qui se fait par des
relations protéines-protéines.

CAPSULE 1 Q3: Un facteur de transcription est une protéine recrutée par le

complexe d’initiation de la transcription.

FAUX: Un facteur de transcription est recruté par la séquence CIS du

promoteur et intéragit avec le complexe d’initation de la transcription.
Certains facteurs sont activateurs (faible ou fort) et d’autres sont inhibiteurs. Si on
enlève le domaine de recrutement d’un facteur activateur, il y aura moins d’activation
car il ne pourra plus se fixer. Mais si on enlève celui d’un facteur inhibiteur, on
observe une augmentation de la transcription.
Le complexe d'initiation de la transcription va donc être activé ou inhibé par des
facteurs de transcription. Cela permet une adaptation aux conditions
environnementales (signal de non-prolifération…).

Il existe des replis de l’ADN pour que les facteurs de transcription et le complexe
d’initiation se mettent à proximité afin de pouvoir interagir ensemble par
l’intermédiaire d’interactions protéines-protéines.

Comme les facteurs de transcription sont des protéines, ils vont être régulés à tous
les niveaux (régulation transcriptionnelle, traductionnelle, post-transcriptionnelle
comme la dimérisation, phosphorylation, hydroxylation ou encore la protéolyse).

Pour comprendre et expliquer cela, prenons l’exemple du gène c-fos, qui est activé
par des facteurs de croissance. Ce gène va être transcrit puis traduit, ce qui va
donner des protéines. La protéine active devra être dans une conformation d’homo-
ou d’hétérodimére. Ensuite, il va y avoir des modifications post-traductionnelles de
ces protéines dans le cytoplasme. Puis, ce facteur de transcription devra être
transloqué dans le noyau pour avoir accès à l 'ADN et ainsi devenir fonctionnel (car
le noyau est la zone d’activité des facteurs de transcription). Dans le noyau, il existe
d’autres facteurs pouvant les réguler comme l’ouverture de la chromatine, l’action de
co-régulateurs ou la fixation de ligands.

CAPSULE 2 Q2: Pour être fonctionnel, un facteur de transcription doit toujours être
situé dans le noyau.
VRAI: mais cela ne veut pas dire qu’ils sont toujours dans le noyau
exemple 1: les hormones stéroïdiennes qui sont dans le cytoplasme nécessitent de
l'oestrogène ou de la progestérone pour migrer dans le noyau et devenir des
récepteurs nucléaires
exemple 2: SREBP: métabolisme du cholestérol, situé dans la membrane du
réticulum endoplasmique. Il attend que des signaux lui indiquent de faire rentrer du
cholestérol dans la cellule pour ensuite rentrer dans le noyau.

CAPSULE 2 Q3: Lorsqu’on réalise une analyse en immunofluorescence d’une coupe

de tissu avec un anticorps reconnaissant un facteur de transcription, on peut le
retrouver dans n’importe quel compartiment cellulaire.

VRAI: si on fait une immunofluorescence on peut le trouver dans n 'importe quel

compartiment (réticulum, cytoplasme, noyau) même s’il n’est pas forcément
fonctionnel.

3. Régulation épigénétique:

(voir cours bio 1)

Des régulations épigénétiques (modifications transmissibles et réversibles de
l’activité des gènes sans altération de la séquence d’ADN) se produisent au cours de
la différenciation et dans les régulations métaboliques des gènes. Pour l’ADN, il
s’agit de méthylation des cytosines et pour les histones, il s’agit d’acétylation, de
méthylation, de phosphorylation ou encore d’ubiquitination.

4. Les cellules souches:

Les cellules souches ont deux caractéristiques principales: l’auto-renouvellement et

une capacité de différenciation.
Deux types de divisions se produisent en fonction des territoires dans lesquels on
les regarde :

Division symétrique: une cellule souche donne deux cellules souches identiques et
puis à un moment donné, un signal engagera une partie des cellules dans la
différenciation.

Division asymétrique: une cellule souche donne une cellule souche et une cellule
engagée dans la différenciation. Ceci serait coordonné et orienté grâce à la
répartition non-homogène des ARNm dans la cellule mère. Les deux cellules filles
n’ont alors pas le même matériel génétique et s’orientent vers des finalités
différentes.

L'auto-renouvellement est lié à la sénescence réplicative. Il y a l’idée d’une horloge

biologique, c’est-à-dire qu’à chaque réplication de l’ADN, il y a une perte distale de
télomère accompagné d’un raccourcissement progressif des chromosomes jusqu'à
toucher des séquences importantes pour la survie de la cellule ce qui fait que la
division s'arrête.
Dans les cellules souches, il existe un mécanisme qui permet de maintenir la
longueur des télomères. C’est le rôle de la télomérase guidées par des séquences
d’ARN.
Le même système est présent dans les cellules cancéreuses (multiplication
quasi-illimitées).

Bases moléculaires de l’auto-renouvellement:

Les facteurs de transcription favorisent l'auto-renouvellement et empêchent que les

promoteurs de gènes importants dans la différenciation s’expriment. Il en existe 3
importants: SOX2, OCT4, et NANOG. De plus, ils sont impliqués dans des boucles
d'autorégulation leur permettant de se coordonner entre eux. Ils ont une capacité à
s’auto-activer grâce à leur promoteur.
Une cellule souche a deux destins : soit s’auto-renouveler, soit s’engager dans la
différenciation.
Quand OCT4, SOX2 et NANOG s’expriment, les gènes de différenciation sont
bloqués, ce qui provoque une activation de l'auto-renouvellement.

À partir de la fécondation, les cellules vont se diviser. Il va y avoir le stade morula, où

les cellules sont dites TOTIPOTENTES. Ces cellules peuvent donner l’individu et les
annexes. On parle de cellules souches PLURIPOTENTES lorsqu’elles viennent de
la masse cellulaire interne du blastocyste. Celles-ci peuvent devenir des cellules
souches embryonnaires si on les dérivent. Elles peuvent reconstituer un individu
mais pas les annexes.
A partir du stade de foetus, les cellules sont dites MULTIPOTENTES (exemple des
cellules hématopoïétiques, de la moelle osseuse, du follicule pileux ou de l’intestin).

On a toujours des cellules souches dans un tissu différencié qui permettent le

renouvellement du tissu.

Notion de NICHE: maintien de l’état souche au sein d’un environnement complexe

Induction de la différenciation:

Les cellules souches vont s'engager dans une différenciation.

CAPSULE QUESTION: la différenciation résulte de l’accumulation de signaux

diffusibles puis de signaux intercellulaires

FAUX: le « puis » met une notion de succession ce qui n'était pas le cas ici. En effet,
on peut avoir simultanément les deux. Il n'y a pas de chronologie entre les types de
signaux diffusibles et intercellulaires même s'il est nécessaire d'avoir une
chronologie d’activation car les cellules doivent être compétentes pour pouvoir
recevoir l’information de différenciation et ceci de façon progressive (cellule
hématopoïétique).

CAPSULE QUESTION: la séquence nucléotidiques du promoteur d'un gène

détermine le type cellulaire dans lequel le gène va être transcrit.
VRAI: Il y a sur ces 2 gènes des facteurs de transcription qui sont ubiquitaires,
c'est-à-dire présents dans toutes les cellules (ici les bleus et marrons), et d’autres
qui sont des facteurs spécifiques de tissu. En effet, il y a des facteurs qui sont
exprimés uniquement dans les cellules musculaires ou uniquement dans les cellules
hépatiques.
Par exemple le promoteur de l'albumine n'a pas le rectangle orange ou le rectangle
rose des facteurs spécifiques de la différenciation myogénique donc ils ne pourront
pas se fixer sur ce promoteur et donc ils ne pourront pas activer la transcription des
gènes de la myosine (puisque ces facteurs de transcription ne seront pas dans la
cellule hépatique). Donc c'est bien la séquence nucléotidique du promoteur qui va
déterminer si le gène est exprimé ou pas dans une cellule.

ATTENTION: Ce n’est pas la séquence nucléotidique qui est différente d’un

promoteur à un autre, mais les facteurs spécifiques qui sont différents d’une cellule à
l’autre. Le gène sera exprimé en fonction des facteurs de transcription présents dans
la cellule.

La combinatoire des séquences cis d'un promoteur sélectionne les facteurs

transcriptionnels qui s'y fixeront dont les facteurs de spécificité tissulaire.

Combinaison et cascade d’activation

Il faut un signal A et un signal B qui permettent simultanément de rendre la cellule

compétente c'est-à-dire qu'elle va pouvoir exprimer des récepteurs R3 et R4, quel
qu'il soit, pour des facteurs diffusibles ou des facteurs de contacts, qui vont pouvoir
recevoir les signaux C et D. Il y a donc nécessité de chronologie des événements.

5. Reprogrammation cellulaire

Selon la vision qu'on avait dans les années 60, des cellules pluripotentes soumises à
des signaux vont descendre progressivement la “vallée” jusqu’à se retrouver soit
comme une cellule rouge ou verte (par exemple hépatique ou musculaire). Il y a des
zones de choix. Une fois le choix fait, il y a un déterminisme. Mais il peut y avoir une
TRANSDIFFÉRENCIATION, c'est-à-dire qu'on peut passer d'une cellule différenciée
à une autre cellule différenciée. Ce n’est pas fréquent mais c'est ce qui se passe lors
de la transition épithélio-mésenchymateuse (création de métastase par ce
processus).
On a découvert récemment un mécanisme de reprogrammation cellulaire. Il s’agit de
faire exprimer des facteurs de transcription des cellules souches dans une cellule
différenciée afin de lui faire remonter la voie pour qu'elle redevienne une cellule
souche pluripotente.

CAPSULE QUESTION: les cellules souches embryonnaires sont issues d’une

reprogrammation du noyau. FAUX (erreur énoncé)

KLF4 et Nanog ont les mêmes

fonctions mais ça dépend des
publications.
Nanog, Oct4 et Sox2 sont les
facteurs majeurs de la
transcription. KLF4 peut
remplacer Nanog mais ça dépend
de la littérature et des articles.
Il est nécessaire d’avoir une
expression transitoire pour
exprimer ces facteurs
transcriptionnels spécifiques des cellules souches parce qu’il y a par la suite une
induction endogène de ces mêmes facteurs qui permettent de maintenir cet état.
Donc il y a juste besoin d'une initiation pour qu’ensuite le programme cellulaire
puisse se mettre en route.
À partir de cellules indifférenciées, dans lesquelles on surexprime ces facteurs
transcriptionnels, qui permettent l'autorenouvellement et qui bloquent la
différenciation, on obtient des cellules souches. En cultivant celles-ci dans un
environnement spécifique avec des produits que l’on teste de façon expérimentale et
en suivant une chronologie particulière, on arrive à induire une voie de
différenciation particulière.
Finalement, il y a des programmes de différenciation qui vont être différents si on
veut obtenir une cellule hépatique, une cellule nerveuse etc.

6. Application médicales des cellules souches

Avec ces cellules IPS, on peut

avoir des éléments importants
qui peuvent être de la
thérapeutique. En ayant des
modèles de cellules
pathologiques, on peut cribler
des molécules in-vitro et donc
déterminer plus rapidement les
molécules qui sont utiles.
On peut aussi en les cultivant
remplacer des tissus qui sont
dégénérés, ou bien lésés.

II. Questions libres (questions posées par les étudiants en fin de cours)

- Est-ce que l’ARN pol 2 est intégrée au complexe d’initiation de la transcription

? Mr.Lacorte dit qu’il l’intègre car il la voit comme une définition fonctionnelle. Le
complexe d’initiation n’a pas de sens si on n’y met pas l’ARN polymérase 2

- Question sur le promoteur et la TATA Box ? La TATA Box qui est en amont du +1
de transcription, fait partie du promoteur proximal. On a un complexe d’initiation qui
est sur la TATA Box, tout le reste va conduire à l’activation ou à l’inhibition. On peut
avoir des facteurs de transcription qui se fixent sur des séquences d’ADN qui sont en
5’, sur des séquences introniques mais aussi sur des séquences en 3’. Si l’on met
tous nos gènes à la queuleuleu, le 5’ d’un gène devient le 3’ d’un autre. (pas de
question sur ça excepté sur la fonctionnalité de ce qui active ou de ce qui conduit à
une transcription)
- Question sur la niche intestinale ? Au niveau de l’épithélium absorbtif du jéjunum /
iléon, vous avez des villosités mais au pied de chacune de celles-ci vous avez une
crypte. Donc autant vous avez de villosités, autant vous avez de cryptes qui
l’entourent. Au fond de la crypte vous avez les cellules souches mais en petite
quantité, moins d’une dizaine.

- Est-ce que quand on parle de complexe d’initiation, on parle de la TATA Box?

Le complexe d’initiation de la transcription est un complexe protéique qui vient se
fixer sur une séquence nucléotidique qui est la TATA Box (séquence de recrutement
qui permet de fixer la TBP dessus et ensuite l’assemblage de facteurs de
transcription généraux qui permettent de constituer le complexe d’initiation de la
transcription.

- Question sur la combinatoire et les cascades ? La combinatoire, ça veut dire qu’il

y a plusieurs signaux qui arrivent en même temps, c’est la notion de signal A / signal
B. La chronologie, c’est qu’il faut un signal A et un signal B simultanés puis un signal
C et D simultanés aussi mais différents et plus tard.