Purification Des Protéines

1
PURIFICATION DES BIOMOLECULES

EXEMPLE LES PROTEINE
ELLE S sont toujours retrouvées en tant que composantes d’un mélange
complexe incluant d’autres macromolécules biologiques;
Alors que certaines protéines sont très abondantes (anticorps sanguins),

d’autres ne sont rencontrés qu’en quantités très infimes (quelques
molécules par cellule);
La première étape dans l’étude de la structure/fonction d’une protéine sera

donc toujours sa purification;
À partir d’un échantillon biologique contenant la protéine d’intérêt, on

effectue une série d’expériences effectuées séquentiellement qui
permettront progressivement d’obtenir la protéine désirée sour forme
« pure »;
La purification d’une protéine est grandement facilitée si on connaît au

départ:
 Les caractéristiques physico-chimiques générales de la protéine: Masse r,éelle pI,
solubilité;
 Si une méthode expérimentale permet de détecter la présence de la protéine (réactifs,
réaction enzymatique, effect physiologique, etc). 2
Techniques de purification des
protéines
1.Isolement des protéines

A. Choix d’une source de protéines
B. Techniques de solubilisation
C. Stabilisation des protéines
D. Détection des protéines
E. Stratégie générale de purification de
protéines
2. Solubilité des protéines
A. Influence de la concentration en sels
B. Influence du pH
3. Separation par chromatographie

A. Chromatographie par échange d’ions
B. Chromatographie par filtration sur gel
C. Chromatographie d’affinité
D. Autres techniques chromatographiques
4. Electrophorèse
A. SDS-PAGE
B. Focalisation isoélectrique
5. Ultracentrifugation
A. Ultracentrifugation préparative
Purification des protéines
Pourquoi purifier
Etudier les propriétés d’une protéine
Déterminer sa séquence en acides aminés
Déterminer sa structure tridimensionnelle
Utiliser une protéine (enzyme) dans un processus pour obtenir
un produit pharmaceutique ou alimentaire
Difficulté
Les cellules contiennent généralement plus de 1000
types de protéines différentes. Chaque protéine a donc
en moyenne une abondance inférieure à 1/1000
Solution
Tirer profit des différences de propriétés physicochimiques
et biochimiques des protéines:
solubilité, taille, point isoélectrique, charge,
hydrophobicité, affinité pour certains ligands22
Ces techniques sont des outils de base de la biochimie et
beaucoup de ces techniques sont utilisées en routine pour
des applications cliniques ou industrielles.
1 ISOLEMENT DES PROTEINES
Certaines protéines représentent la substance principale

d’une cellule, par exemple l’hémoglobine dans les globules
rouges. D’autres protéines, comme le répresseur de l’opéron
lactose d’E. coli, se trouvent qu’à raison de quelques
molécules par cellule. Les mêmes techniques sont utilisées
pour purifier ces deux protéines. Leur isolement et leur
purification représentent souvent des jours de travail pour
obtenir quelques milligramms (mg) ou microgramms (g) de
la protéine désirée .
A. Choix d’une source de protéines
Les protéines qui assurent des fonctions identiques se

retrouvent en général chez de nombreux organismes, par
exemple les enzymes de la glycolyse
Mais, on peut trouver différentes variantes d’une même

protéine dans différents tissus du même organisme ou dans
différents compartiments de la même cellule, par exemple
des isozymes
Le choix doit tenir compte de critères tels que: possibilité de

se procurer facilement des quantités suffisantes du tissu
d’ou on veut isoler la protéine
On utilise souvent des tissus d’animaux tels que poulets,

boeufs, porcs ou rats. On peut également partir de
microorganismes comme E. coli ou la levure
A. Choix d’une source de protéines....
Par clonage moléculaire, pratiquement n’importe quel gène

codant une protéine peut être isolé de son organisme
d’origine et exprimé en grande quantité (surexprimé) dans
un organisme approprié mis en culture tel que E. coli ou la
levure
La protéine ainsi clonée et surexprimé peut représenter

jusqu’à 30% des protéines totales de la cellule
surproductrice
Ceci facilite beaucoup l’isolement et la purification de la

protéine clonée
PURIFICATION DES PROTÉINES
PROCÉDURE GÉNÉRALE
Extrait protéique brut
Homogénéisation
Détection de la présence Étapes de purification
de la protéine d’intérêt: grossières
- Activité
- Pureté
- Quantité
PURE! Chromatographie
(bon, bin, j’espère…) 1, 2, 3….x étapes 11
Purification des protéines
1. MÉTHODES GROSSIÈRES
A-HOMOGÉNÉISATION
La pré-purificatiion d’’agrégats protéiques d’’intérêt
Les cultures de cellulaire et de levures recombinantes sont très souvent

utilisées dans l’industrie biotechnologique afin de produire des protéines
d’intérêt, notamment des enzymes. Ces protéines sont en général
surexprimées et s’accumulent en grandes quantités à l’intérieur des cellules
hôtes soit sous forme d’agrégats amorphes ou de corps d’inclusion, soit
associées à des membranes ou localisées dans un compartiment cellulaire
particulier.
La pré-purification consiste à séparer le plus efficacement possible la protéine

recherchée des débris cellulaires indésirables. La répartition de la protéine
d’intérêt entre les fractions soluble et insoluble de l’homogénat dépend entre
autres de la nature du tampon de broyage. L’efficacité des étapes constituant
la pré-purification sera donc prépondérante pour le bon déroulement de
toutes les étapes de purification qui suivront
12
Objectifs
• La caractérisation et l’optimalisation du broyage cellulaire de manière à faciliter
les étapes de pré-purification qui suivent et augmenter leur efficacité,
• L’étude de la solubilité de protéines d’intérêt dans l’homogénat cellulaire,
• La mise au point d’une batterie de tests génériques pour identifier la composition
optimale du tampon d’homogénéisation,
• La prise en compte des aspects d’efficacité, robustesse, reproductibilité et transfert
à l’échelle industrielle ont été considérés
. 13
Basées sur la solubilité de la protéine d’intérêt sous
différentes conditions:
pH
Température
Force ionique (i.e. concentration en sels);
L’idée de base est d’utiliser des conditions expérimentales qui feront

précipiter beaucoup de protéines de notre extrait brut, tout en laissant notre
protéine d’intérêt en solution;
Ce qui Permet de nous débarrasser d’une bonne partie des «cochonneries »

présentes dans l’extrait brut;
14
2-précipitation différentielle
2.1. Précipitation par modification du pH
La solubilité des protéines est rendue
possible par des interactions entre les
chaînes latérales et le solvant:
 Si le solvant est l’eau:
 Liaisons hydrogène
 Interactions électrostatiques
 Si le solvant est non-polaire:
solubilité
 Interactions hydrophobes;
Ces interactions peuvent être modifiées en

changeant la charge nette de la protéine,
donc en modifiant le pH du solvant;
pH
De manière générale, les protéines pI
précipitent lorsque le pH de la solution est
égal au pI de la protéine:
15
Généralement, le « salting out » est
2-PRÉCIPITATION DIFFÉRENTIELLE
fait par l’ajout de sulfate
1.2 «SALTING OUT »
d’ammonium:
La solubilité des protéines peut  (NH4)2SO4
aussi être modifiée en altérant la
 Plus soluble dans l’eau que le
concentration de sel dans l’extrait;
NaCl;
 Les sels ajoutés prendront la
 Requiert une quantité moins
place de l’eau autour de la
grande que le NaCl pour précipiter
protéine;
les protéines.
Une protéine donné précipitera
 Les sels neutraliseront les
généralement lorsqu’une
charges des chaînes latérales de
concentration spécifique de
la protéine;
(NH4)2SO4 est atteinte;
 Ces deux évènements Ceci permet de nettoyer notre

favoriseront l’aggrégation et la extrait brut de manière
précipitation des protéines; séquentielle;
Les protéines précipitées sont alors
jetées à la poubelle, ou sujettes à la
dialyse (pour enlever le sel de
l’échantillon); 16
PRÉCIPITATION DIFFÉRENTIELLE
1.2.SALTING OUT
PRECIPITATION!!
17
PRÉCIPITATION DIFFÉRENTIELLE
1.2.SALTING OUT
Mélange de protéines Centrifugation:

dans un tampon:  Séparation selon la
A: précipite à [ ] sel = 15%
densité;
B: précipite à [ ] sel = 25 %
C: précipite à [ ] sel = 35%
 Les molécules denses (i.e.
1) Ajoute (lentement)
(NH4)2SO4 à 20% grosses) vont sédimenter
Culot: protéine A 2) Centrifuge pour récupérer (former un culot) plus vite
les protéines précipitées que les molécules moins
Surnageant: protéines B + C denses (i.e. plus petites);
1) Ajoute (lentement)
(NH4)2SO4 à 30%
Culot: protéine B 2) Centrifuge pour récupérer
les protéines précipitées
Surnageant: protéine C
18
CENTRIFUGATION
Technique très utilisée permettant de séparer des
substance via l’application d’une force centrifuge;
L’intensité de la force centrifuge devant être

appliquée varie selon la nature de la substance à
séparer:
 500 x g pour cellules entières
 15 000 x g pour les mitochondries
 150 000 x g pour les ribosomes
Note: 1 x g = force gravitationnelle terrestre au

niveau de la mer (~ 9.8 m/s2)
Les substances particulaires vont atteindre le fond

du tube (i.e., elles forment un culot)
Le liquide résiduel est appelé le surnageant.
Peut aussi être utilisé pour séparer des substances

particulaires de densité différente (les substances
plus denses sédimenteront plus rapidement que
celles qui sont moins denses.
 e.g. séparation des érythrocytes et leucocytes 19
DIALYSE
Parce que le sel ajouté pour le « salting out »

inhibe l’activité des protéines, il doit être
enlevé avant de continuer la purification;
Ceci est fait par dialyse;
La solution de protéine est simplement

Heures introduite dans un sac fabriqué d’une
membrane semi-perméable:
 Perméable aux petites molécules (e.g. sels);
 Imperméable aux protéines;
Permet aussi de changer de tampon avant

de procéder à l’étape suivante.
20
2. MÉTHODES FINES Réservoir de tampon
Colonne
Injecteur
Après avoir utilisé des méthodes grossières (échantillon)
afin de concentrer notre protéine favorite, on
utilise des méthodes plus raffinées afin de
purifier notre protéine le plus possible;
Ceci est fait généralement en utilisant

différents types de chromatographie:
 Échange d’ions;
 Tamisage moléculaire;
 Affinité
Ceci est fait généralement en utilisant la

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC).
Pompes Collecteur de fractions21

2.1. CHROMATOGRAPHIE À ÉCHANGE D’IONS
Permet de séparer les protéines

selon leur charge Échange de cations:
 Phosphocellulose
 Carboxyméthyl (CM) cellulose
Le mélange de protéines est placé
dans un tampon dont le pH permet
à notre protéine d’avoir une charge Échange d’anions:
précise;  Diéthylaminoéthyl (DEAE) cellulose
Le mélange est ensuite déposé sur

la colonne de séparation;
CHMI 2227 - E.R. GAUTHIER, PH.D. 22

2.1. CHROMATOGRAPHIE À
ÉCHANGE D’IONS
Adsorption Desorption
NaCl
Anion exchanger
Même si un changement de tampon avec un pH

différent permettrait d’éluer la protéine d’intérêt, ceci
est rarement effectué car le changement de pH
pourrait dénaturer la protéine ou, pire, la faire
précipiter;
L’élution est faite en ajoutant un tampon contenant

une concentration de sel (NaCl) qui empêche la
protéine de lier la colonne;
Exemple de chromato.
à échange de cations L’élution peut être faite à l’aide d’un gradient linéaire
de concentration de sel, ou par étapes;
La chromatographie sur couche mince (CCM) :
Cette technique souvent vue pour la première fois en chimie est aussi souvent utilisée
en biotechnologie d’où l’intérêt d’expliquer son fonctionnement. Il s’agit d’une méthode
séparative permettant l’identification des différents composés d’un mélange. Elle
s’effectue sur une fine couche de silice qu’on appelle phase stationnaire et qui est
déposée dans une cuve contenant l’éluant. Ce dernier est un solvant utilisé pour la
séparation des substances absorbées sur un support. Avant de placer la plaque de silice
dans la cuve, le mélange à étudier est posé sur cette dernière. On obtient une migration
des molécules du mélange qui est due aux différences d’affinité des composés du
mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile (l’éluant). Leur vitesse de
migration dépend des forces électrostatiques retenant les composés sur la plaque et de
sa solubilité dans l’éluant. De manière générale, les substances de faible polarité
migrent plus rapidement que les composants polaires. La polarité est la caractéristique
d’une molécule dont les charges négatives et positives sont concentrées les unes à
l’opposé des autres, aux deux extrémités de la molécule. Pour plus d’informations sur la
réalisation de cette technique, il peut être intéressant de regarder l’animation suivante :
On peut citer de plus un exemple concret : la chromatographie des pigments des
végétaux chlorophylliens:. L’image ci-dessous est un schéma d’une CCM.
2.1. CHROMATOGRAPHIE À
ÉCHANGE D’IONS
Changement linéaire
de concentration de
NaCl
Ajoute tampon
Changement brusque
de concentration de NaCl
2.2. TAMISAGE MOLÉCULAIRE
Aussi appelé chromatographie par filtration sur gel ou

chromatographie d’exclusion;
Consiste en de petites billes contenant des pores d’une

taille spécifique:
 Les protéines plus grosses que les pores n’entrent pas dans
les billes, ont moins de volume à traverser et vont éluer en
premier;
 Les protéines plus petites que les pores vont entrer dans les
billes de leur élution sera retardée: elles élueront donc plus
tard.;
Les protéines sont séparées selon leur masse

moléculaire;
La disponibilité de différents types de billes possédant

des pores de différentes tailles permet la sélection du
matériel de chromatographie qui donnera le meilleur
résultat;
26
2.2. TAMISAGE MOLÉCULAIRE
La filtration sur gel a plusieurs applications:

 1) Purification des protéines
 2) Désalage
 PAS la même chose que le salting out;
 Les pores sont si petits que toues les protéines
éluent rapidement et seuls les sels voient leur
élution retardée;;
 3) Détermination de la masse moléculaire:

 Nécessite d’abord la calibration de la colonne avec
des standards protéiques (un mélange de protéines
de Mr connu);
 Permet de déterminer si la protéine d’intérêt fait
parti d’un complexe multimérique. POURQUOI?
27
Interactions hydrophobes
En solution, les protéines à caractère hydrophobe cherchent davantage à s'associer entre elles qu'à s'hydrater
avec les molécules d'eau.
Des résines portant des groupements hydrophobiques (cycliques ou aliphatiques) permettent de retenir de telles
protéines sur une colonne. À l'inverse de ce qui se passe sur une colonne de chromatographie par échange
d'ions, une colonne de chromatographie d'interaction hydrophobe est chargée à haute force ionique (qui favorise
les interactions hydrophobes) et est éluée avec un gradient de sel à la baisse. Grâce à cela, on peut faire passer
un échantillon frais élué (avec une haute concentration en sel) d'une colonne d'échange d'ions directement sur
une colonne d'interaction hydrophobe, sans avoir à dialyser ou diluer.
Les résines les plus utilisées pour ce type de chromatographie sont l'octyl- et le phényl-sépharose.
http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_Prod~SelGuides~Media~GFSelG
29
2.3. CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITÉ
 Dans ce type de chromatographie, des billes sont couplées à une molécule appelée ligand qui a
la propriété de lier uniquement la protéine d’intérêt;
 Ligand: anticorps, substrat, métaux, autre macromolécule pouvant lier la protéine d’intérêt,
 Lorsqu’un mélange de protéines est filtré dans cette colonne, seule la protéine d’intérêt sera
retenue: les autres protéines contaminants seront éluées;
 La protéine d’intérêt est alors récupérée par l’ajout d’un excès du ligand libre à la colonne;
C‘est une méthode très puissante, mais avec des limites importantes:
 Le milieu de séparation est très dispendieux (pas approprié pour des
séparations à grande échelle)
 Disponibilité limité des billes liées au ligand d’intérêt;
 Nécessite la connaissance préalable du ligand pouvant lier spécifiquement la 30
protéine d’intérêt (ce qui est rarement le cas).
ANALYSE DES PROTÉINES
ÉLECTROPHORÈSE
L’électrophorèse sur gel est une méthode de séparation des macromolécules en
fonction de leur taille, de leur charge électrique et d’autres propriétés physiques. Le
terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence d’un
champ électrique. Le préfixe « électro » fait référence à l’électricité et la racine
«phorèse» vient du grec phoros, qui signifie « porter d’un côté à l’autre ».
L’électrophorèse sur gel fait référence à une technique où les molécules sont obligées
de traverser une couche de gel sous l’impulsion d’un courant électrique. L’énergie
motrice de l’électrophorèse est la tension qui est appliquée à des électrodes placées de
part et d’autre de la couche de gel. Les propriétés d’une molécule déterminent la
rapidité avec laquelle un champ électrique peut traverser un milieu gélatineux.
Diverses macromolécules biologiques importantes (ex.: acides aminés, peptides,
protéines, nucléotides et acides nucléiques) possèdent des groupes ionisables qui, à un
pH donné, se transforment en espèces chargées électriquement sous forme de cations
(+),ou d’anions (-). En fonction de la nature de la charge du réseau, les particules
chargées migreront soit vers la cathode, soit vers l’anode. À titre d’exemple, lorsqu’un
champ électrique traverse un gel de pH neutre, les groupes de phosphates chargés
négativement de l’ADN provoquent la migration de celui-ci vers l’anode (Westermeier,
1997).
L’électrophorèse à travers l’agarose est une méthode utilisée de façon standard pour
séparer, identifier et purifier des fragments d’ADN. La technique est simple et facile à
réaliser et peut dissoudre des fragments d’ADN que d’autres procédures
32
PRINCIPES
migration de molécules chargées (perte de neutralité
électrique) dissoutes ou en suspension dans un
solvant, sous l’effet d’un champ électrique
Principe :
Séparation des protéines et des acides nucléiques
biochimie et biologie moléculaire
Electro : énergie électrique
Phoresis : phoros (Grec) porter, avoir en soi

ÉLECTROPHORÈSE
1. ÉLECTROPHORÈSE PAGE-SDS
En PAGE-SDS(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), les
protéines sont tout d’abord placées dans un tampon
contenant le détergent docécyl sulfate de sodium
(SDS);
Le SDS recouvre toutes les protéines de façon similaire:

on retrouvera environ 1 molécule de SDS par 2
acides aminés;
Ceci a la conséquence importante de donner à chaque

protéine la même densité de charge négative,
indépendamment du pI de la protéine.
Le b-mercaptoéthanol (HS-CH2-CH2-OH) est aussi

ajouté fréquemment (mais pas toujours) afin de
briser les ponts disulfures.
SDS
Donc, en PAGE-SDS, la seule variable qui affectera la
migration des protéines dans le gel est leur taille;
www.biology.ucsd.edu/classes/bggn224.FA06/crash_2.ppt
ÉLECTROPHORÈSE
ÉLECTROPHORÈSE
Les protéines sont alors placées dans un puits du gel PAGE-SDS, et soumises à un
champ électrique;
Le protéines migreront alors vers l’anode positive: la distance migrée dépendra de la
taille des protéines;
Les protéines sont visualisées à même le gel grâce à un colorant bleu appelé Bleu de
Coomassie;
En plaçant, dans un puits adjacent, un mélange de protéines de masse moléculaire
connue (standard de protéines), on peut déterminer la masse moléculaire de la
protéine d’intérêt;
À noter: le traitement au SDS et b-ME dénature les protéines et brise toutes les
interactions entre protéines: la protéine migrera donc en tant que simple chaîne
polypeptidique.
En certaines occasions, un PAGE NATIF est effectué: dans cette situation, on n’inclus
pas le SDS ni le b-ME. Ceci permet d’étudier des protéines faisant parti de
complexes multimériques.
La structure native de la
protéine est donc
dénaturée, et une charge
apparente négative est
alors conférée à la
protéine.
En présence de SDS, les
protéines auront donc
toutes une charge
apparente négative, elles
migreront donc toutes
vers l’anode. Cela signifie
que seul le poids
moléculaire des protéines
sera le facteur de leur
séparation. Les protéines
ayant un petit poids
moléculaire, seront moins
retenues dans les pores du
gel de polyacrylamide et
migreront donc plus loin que
les grosses.
ÉLECTROPHORÈSE
ÉLECTROPHORÈSE
Log Mr
Distance migrée à partir du puits (cm)

Électrophorèse
2. Focalisation isoélectrique
Principe
L'électrofocalisation ou focalisation isoélectrique utilise avantageusement la
charge que possède chaque protéine à un pH donné.
Elle consiste en une migration, induite par un courant électrique, des protéines
dans un gradient de pH jusqu'à ce qu'elles atteignent un pH équivalent à leur
pI -moment auquel elles cessent de migrer, puisque leur charge nette est
nulle.
Cette technique, qui sépare les polypeptides en fonction de leur charge plutôt
que de leur masse, est très sensible: elle peut distinguer des protéines dont la
différence de pI est aussi faible que 0,01 unité de pH.
On génère le gradient en soumettant un mélange d'ampholytes à un courant
électrique. Des tampons d'électrophorèse contenant de grandes quantités
d'ampholytes sont disponibles commercialement, précisément pour utilisation
en électrofocalisation.
Les ampholytes sont de petites molécules à caractère amphotère; le mélange
utilisé en focalisation isoélectrique contient un très grand nombre de
molécules ayant des pI différents, ce qui leur permet de se distribuer entre 40
l'anode et la cathode et de maintenir entre elles un gradient de pH.
ÉLECTROPHORÈSE
2. FOCALISATION ISOÉLECTRIQUE
Ici, les protéines sont séparées selon leur pI;
Un mélange de protéines est placé dans les puits d’un gel
d’acrylamide contenant un gradient de pH sur toute sa longueur;
En soumettant les protéines à un champ électrique, elles migreront

dans le gel selon leur charge:
 Protéines chargée positivement migreront vers la cathode négative;
 Protéines chargées négativement migreront vers l’anode positive;
Lorsqu’une protéine atteint une zone du gel où pH = pI, elles sera

neutre et arrêtera de migrer;
Cette méthode permet donc de déterminer le pI de la protéine

d’intérêt;
ÉLECTROPHORÈSE
2. FOCALISATION ISOÉLECTRIQUE
Dans cet exemple, l'échantillon protéique est déposé dans un large puits au centre
du gel. Évidemment, peu importe où l'échantillon est déposé puisque les protéines
migreront dans une direction ou dans l'autre jusqu'à ce qu'elles rencontrent leur
point isoélectrique, point où elles cessent de migrer.
pH in gel = pI of proteins
ÉLECTROPHORÈSE
3. ÉLECTROPHORÈSE À DEUX DIMENSIONS
Après l'électrofocalisation, une bande
longitudinale contenant toutes les
protéines séparées est coupée du gel.
Cette bande ne doit pas être trop large
pour que les résultats de l'étape suivante
ne soient pas trop flous. Elle va servir de
"puits", si l'on peut dire, pour un gel SDS,
ainsi que décrit dans la figure ci-dessous.
Observez que chaque bande du gel
d'électrofocalisation peut contenir plusieurs
protéines de poids moléculaire différent. Si
on effectuait le processus à l'envers, c'est
à dire si on faisait courir un gel de SDS
avant de soumettre une de ses pistes à la
focalisation isoélectrique, on verrait que
plusieurs protéines de même poids
moléculaire ont des pI très différents.
Le gel 2D est très utilisé dans les analyses
protéomiques parce qu'il sépare les
protéines selon deux paramètres distincts
et permet l'étude d'un plus grand nombre
d'entre elles en même temps.
ÉLECTROPHORÈSE
3. ÉLECTROPHORÈSE À DEUX DIMENSIONS
Chaque tache
est une protéine

ÉLECTROPHORÈSE
4. ANALYSE WESTERN
Application très puissante du
PAGE-SDS; ou polyacrylamide
Permet la détection d’une seule

protéine présente dans un mélange
très complexe;
Basé sur la propriété des anticorps

de lier une seule molécule avec
une très grande affinité;
Anticorps:
 4 chaînes: 2 chaînes légères (25
kDa chacune) et 2 chaînes lourdes
(50 kDa chacune);
 Chaque anticorps possède deux Structure d’un anticorps

sites de liaison pour un même
antigène (antigène: la molécule
pouvant être liée spécifiquement
et uniquement par l’anticorps).
ÉLECTROPHORÈSE
4. ANALYSE WESTERN
EXEMPLE ET ANALYSE DES DONNÉES
À chaque étape, on prélève 3 échantillons:
 Un pour déterminer la quantité de protéines présentes;
 Un pour mesurer l’activité de la protéine;
 Un pour faire un gel PAGE-SDS
Le reste de la fraction est soumise à l’étape de purification suivante;
EXEMPLE ET ANALYSE DES DONNÉES
Gel de PAGE-SDS coloré

au Bleu de Coomassie
5-PURIFICATION DES PROTÉINES EXEMPLE ET ANALYSE DES
DONNÉES
Informations importantes à obtenir afin d’évaluer le succès de la purification

(surtout lorsqu’on met au point la méthode de purification):
 Activité spécifique (unités/mg): Activité totale (U)/ Protéine totale (mg)
 Rendement: (Activité totale à étape Y / Activité totale dans l’extrait brut) x 100;
 Niveau de purification: Activité spécifique à l’étape Y / Activité spécifique dans
l’extrait brut;

SÉQUENÇAGE DES PROTÉINES
Toutes les propriétés structurales et fonctionnelles des protéines dépendent
de l’ordre des acides aminés dans le polypeptide (sa séquence);
La structure 3-D d’une protéine est uniquement attribuable à la séquence

en acides aminés de la protéine;
Plusieurs maladies héréditaires sont causées par une changement

(insertion, délétion, substitution) d’un ou plusieurs acides aminés dans
une protéine;
Les acides aminés importants dans la structure/fonction d’une protéine ne

varient généralement pas toujours au cours de l’évolution.
 La comparaison de séquences en acides aminés de protéines provenant de
plusieurs espèces permet de révéler des fonctions/propriétés de la protéine
d’intérêt.
51
SÉQUENCE DES PROTÉINES
- ANÉMIE FALCIFORME
Globule rouge normal
L’hémoglobine est un tétramère fait de 2 copies chacun

de 2 polypeptides: HbA et HbB
L’anémie falciforme est causée par une mutation

héréditaire dans la chaîne HbB:
 Glu remplacé par Val
Crée une région hydrophobe (pourquoi?) qui mène à

l’agrégation de l’hémoglobine mutée (appelée HbS).
Cette HbS agrégée forme de longs filaments qui

changent la forme des érythrocytes. Ces érythrocytes
allongés bloquent le flot sanguin. Ces cellules allongées
sont aussi très fragiles et vont facilement éclater,
causant une anémie.
MAIS: parce que le parasite causant la malaria pousse

dans les érythrocytes, les gens souffrant d’anémie
falciforme sont plus résistant à la malaria. Globule rouge falciforme
DÉTERMINATION DE LA SÉQUENCE
1. CARTOGRAPHIE AVEC ENZYMES
Enzyme Acide aminé Site de Basé sur la propriété de réactifs
coupure chimiques/enzymes de couper le
Trypsine Arg/Lys C-ter lien peptidique à un endroit très
Chymotrypsine Phe/Trp/Tyr C-ter précis;
Protéase V8 Asp/Glu C-ter
Réactif Acide Site de
Pepsine Phe/Trp/Tyr N-ter
aminé coupure
Thermolysine Leu/Ile/Trp/Tyr/ N-ter
Val/Ala/Phe Bromure de cyanogène Met C-ter
Carboxypeptidase Tous les a.a. en - Libère b-mercaptoéthanol Cys Ponts disulfure

A C-ter., sauf Pro, l’acide aminé
Arg/Lys C-ter Iodoacétate Cys Prévient la
Carboxypeptidase Seulement - Ne coupe réduction des
B Arg/Lys quant C- pas si Pro est ponts disulfure
ter. l’avant
dernier acide 1) 1-Fluoro-2,4 Détruit tous les acides
aminé. dinitrobenzène (FDNB) aminés sauf ceux en N-ter.
2) Chlorure de dansyl
NOTE: Trypsine, Chymotrypsine, protéase V8, 3) Chlorure de dabsyl
pepsine et thermolysine ne COUPENT PAS si Pro Hydrazine Détruit tous les acides
fait partie du lien peptidique. C H M I 2 2 2 7 - E . R . aminés
G A U T Hsauf
I E R ,ceux D . C-ter.53
P H .en
1. CARTOGRAPHIE AVEC ENZYMES –
EXEMPLE 1

1. CARTOGRAPHIE AVEC ENZYMES – EXEMPLE
 Les données suivantes ont été obtenus après traitement d’un

octopeptide:
 HCl 6M: Ala, Gly2, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr

 Chymotrypsine: 2 peptides sont
obtenus:
 CNBr: 2 peptides sont obtenus:  Peptide 5: Gly, Tyr
 Peptide 1: Ala, Gly, Lys, Thr  Peptide 6: Ala, Gly, Lys, Met, Ser, Thr
 Peptide 2: Gly, Met, Ser, Tyr
 FDNB: donne Gly
 Trypsine: 2 peptides sont obtenus:
 Peptide 3: Ala, Gly  Carboxypeptidase A: donne Gly
 Peptide 4: Gly, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr
55
DÉTERMINATION DE LA
SÉQUENCE
2. DÉGRADATION D’EDMAN
Basé sur l’utilisation du phényl isothiocyanate
(aka PTC; réactif d’Edman);
Le PTC réagit avec et marque l’acide aminé en

N-terminal du peptide;
L’acide aminé marqué au PTC est libéré du

peptide et identifié par chromatographie;
Plusieurs cycles de marquage et libération

permettent de déterminer la séquence du
peptide.
56
SÉQUENCE
2. DÉGRADATION D’EDMAN
Identification
57
3. SPECTROMÉTRIE DE MASSE
Technique à la mode très puissante, permettant d’identifier et de

séquencer les protéines;
Les protéines sont vaporisées en fragments ionisés à l’aide d’un rayon

laser;
Même des protéines coupées d’une gel PAGE-SDS peuvent être

utilisées!!!
Les fragments sont séparés et leur masse moléculaire déterminée;
À partir de la masse moléculaire, le peptide peut être identifié;
En spectrométrie de masse en tandem (MS-MS), des fragments obtenus

après une première ronde de MS sont sélectionnés pour une deuxième
ronde de fragmentation et analyse: la masse de ces petits fragments
permet de séquencer les fragments peptidiques.
58
SÉQUENCE

EXEMPLE DE PURIFICATION DE
PROTÉINE
APOPTOSE: UN TYPE DE MORT
CELLULAIRE
Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:663–669

Normale Autophagie
Apoptose Nécrose
APOPTOSE –ASPECTS
MORPHOLOGIQUES
http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n3/extref/nrm2312-s1.mov
Shrinkage
Blebbing
Fragmentation
62
APOPTOSE –ASPECTS
MORPHOLOGIQUES
http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n
3/extref/nrm2312-s1.mov
63
EXEMPLE DE PURIFICATION PROTÉIQUE
ACINUS: UNE PROTÉINE IMPLIQUÉE DANS LA MORT
CELLULAIRE
NATURE |VOL 401 | 9 SEPTEMBER 1999

64
CONDENSATION DE LA CHROMATINE ET
FRAGMENTATION DU NOYAU PENDANT L’APOPTOSE
Nature Reviews| molecular cell biology volume9 | march2008 | 231
65
EXEMPLE DE PURIFICATION
PROTÉIQUE
CELLULAIRE
66
Exemple de purification protéique
Acinus: une protéine impliquée dans la mort cellulaire
Lane 1, 100,000g supernatant
(3.4mg);
lane 2, HiTrap-Q(1.7mg);
lane 3, Heparin Sepharose after
passing the hydroxyapatite
column (150 ng);
lane 4, Phenyl Sepharose (70 ng);
lane 5, Superose 12 (50 ng); lane
6, Mono-Q (2.5 ng).
Arrowhead, position of purifed
Acinus p17 protein. 67
PROTÉIQUE
CELLULAIRE
68
PROTÉIQUE
CELLULAIRE
69

Purification Des Protéines

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1

PURIFICATION DES BIOMOLECULES

Alors que certaines protéines sont très abondantes (anticorps sanguins),

La première étape dans l’étude de la structure/fonction d’une protéine sera

À partir d’un échantillon biologique contenant la protéine d’intérêt, on

La purification d’une protéine est grandement facilitée si on connaît au

1.Isolement des protéines

3. Separation par chromatographie

1 ISOLEMENT DES PROTEINES

Certaines protéines représentent la substance principale

Les protéines qui assurent des fonctions identiques se

Mais, on peut trouver différentes variantes d’une même

Le choix doit tenir compte de critères tels que: possibilité de

On utilise souvent des tissus d’animaux tels que poulets,

Par clonage moléculaire, pratiquement n’importe quel gène

La protéine ainsi clonée et surexprimé peut représenter

Ceci facilite beaucoup l’isolement et la purification de la

Extrait protéique brut

Les cultures de cellulaire et de levures recombinantes sont très souvent

La pré-purification consiste à séparer le plus efficacement possible la protéine

L’idée de base est d’utiliser des conditions expérimentales qui feront

Ce qui Permet de nous débarrasser d’une bonne partie des «cochonneries »

 Si le solvant est non-polaire:

Ces interactions peuvent être modifiées en

 Ces deux évènements Ceci permet de nettoyer notre

Mélange de protéines Centrifugation:

L’intensité de la force centrifuge devant être

Note: 1 x g = force gravitationnelle terrestre au

Les substances particulaires vont atteindre le fond

Le liquide résiduel est appelé le surnageant.

Peut aussi être utilisé pour séparer des substances

Parce que le sel ajouté pour le « salting out »

Ceci est fait par dialyse;

La solution de protéine est simplement

Permet aussi de changer de tampon avant

Ceci est fait généralement en utilisant

Ceci est fait généralement en utilisant la

Pompes Collecteur de fractions21

Permet de séparer les protéines

Le mélange est ensuite déposé sur

CHMI 2227 - E.R. GAUTHIER, PH.D. 22

Même si un changement de tampon avec un pH

L’élution est faite en ajoutant un tampon contenant

Aussi appelé chromatographie par filtration sur gel ou

Consiste en de petites billes contenant des pores d’une

Les protéines sont séparées selon leur masse

La disponibilité de différents types de billes possédant

La filtration sur gel a plusieurs applications:

 3) Détermination de la masse moléculaire:

CHMI 2227 - E.R. GAUTHIER, PH.D. 33

Le SDS recouvre toutes les protéines de façon similaire:

Ceci a la conséquence importante de donner à chaque

Le b-mercaptoéthanol (HS-CH2-CH2-OH) est aussi

Distance migrée à partir du puits (cm)

En soumettant les protéines à un champ électrique, elles migreront

Lorsqu’une protéine atteint une zone du gel où pH = pI, elles sera

Cette méthode permet donc de déterminer le pI de la protéine

CHMI 2227 - E.R. GAUTHIER, PH.D. 44

Permet la détection d’une seule

Basé sur la propriété des anticorps

 Chaque anticorps possède deux Structure d’un anticorps

Gel de PAGE-SDS coloré

Informations importantes à obtenir afin d’évaluer le succès de la purification

CHMI 2227 - E.R. GAUTHIER, PH.D. 50