Université des Sciences et de la Technologie

Houari Boumediene (USTHB)

Faculté des sciences biologiques (FSB)
Département BCM

Licence L3, spécialité: Biotechnologie et santé

Biologie moléculaire et Génie génétique

TD 01

EXTRACTION ET PURIFICATION DES ACIDES

NUCLÉIQUES
(ADN génomique, ADN plasmidique, ARN)
Enseignants :
Dr N. Behairi
Dr S. LOUAHCHI
Dr M. Messaoud khelifi
Dr N. Rebbah
 PLAN

Introduction
1. Intérêt de l’extraction des acides nucléiques (AN)
2. Les étapes d’extraction des AN
3. Extraction de l’ADN chromosomique
3.1. Lyse cellulaire
3.2. Extraction et purification de l’AN
3.3. Concentration de l’ADN par l’alcool
4. Extraction de l’ADN plasmidique
5. Extraction de l’ARN
6. Quantification et contrôle de qualité de l’AN
7. Conservation des AN
 Introduction

Toute étude de génétique moléculaire implique la disposition

d'échantillons d'acides nucléiques. Les techniques d'extraction des
acides nucléiques sont relativement simples. Il convient simplement
d'éviter toute destruction enzymatique ou mécanique. En effet, les
acides nucléiques qui sont stables dans la cellule intacte, deviennent
très vulnérables à la digestion par les nucléases endogènes une fois la
cellule lysée.

L’objectif est d’isoler l’acide nucléique (ADN ou ARN) et le séparer de

tous les autres constituants cellulaires, afin d’obtenir un échantillon
pur et en grande quantité.
 1. Intérêt de l’extraction des acides nucléiques

• L’extraction des acides nucléiques est le point de départ de différentes

techniques de biologie moléculaire : PCR (polymerase chain reaction),
séquençage, southern et northern blot, clonage moléculaire,
recombinaisons…etc

• Ces techniques sont utilisées tant bien en clinique dans le cadre du

diagnostic (recherche de gènes ou de mutations impliqués dans une
pathologie particulière), que dans le cadre de la recherche notamment
dans le suivie épidémiologique (création/identification/contrôle des
organismes génétiquement modifiés, affiliation phylogénétique … etc ).
 2. Les étapes d’extraction des AN

Il existe différents protocoles expérimentaux pour extraire les acides

nucléiques, qui suivent approximativement les mêmes étapes:
1- Lyse cellulaire
2- Extraction et purification des AN:
 Méthode organique
 Méthode non organique
 Méthodes basées sur la chromatographie (kits commerciaux)
 Méthodes basées sur la centrifugation

3- Concentration de l’AN
4- Quantification et contrôle de qualité de l’AN
3. Extraction de l’ADN chromosomique
3.1. Lyse cellulaire

• Broyage (manuel ou automatique)

Lyse mécanique • Choc thermique (cycles de congélation-
décongélation)
Cellules sans paroi
• Choc osmotique (afflux d’eau à l’intérieur
des cellules)

• ENZYMATIQUE: utilisation d’hydrolases

spécifiques:
Lyse enzymatique et • Lysozyme (Bactéries)
chimique • Chitinase (champignons)
Cellules avec paroi • Cellulase, Pectinase (cellules végétales)
• CHIMIQUE: utilisation de détergents (SDS
, Triton X100).
3.1. Lyse cellulaire

Rôle des détergents :

Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), Triton
X100, Sarcosyl

1- Solubilisation des lipides

membranaires sous forme de micelles:
création de pores membranaires
suffisamment larges pour libérer le
contenu du cytoplasme en dehors des
cellules.

2- Dénaturation des protéines

membranaires (contribue également à
la lyse de la cellule).

Mode d’action des détergents

 3.2. Extraction et purification des AN
 Méthode organique: phénol-Chloroforme

Principe de la technique
Cette technique repose sur la différence de solubilité des acides
nucléiques et des protéines dans une émulsion à deux phases: une
phase aqueuse et une phase organique.

• Le phénol entraine le déplacement des protéines qui sont

hydrophobes vers la phase organique. Les acides nucléiques quand à
eux, sont hautement chargés et se déplacent plutôt vers la phase
aqueuse.

• Le chloroforme, plus organique, permet d’éliminer les lipides, de

dénaturer plus de protéines, et se mélange moins à la phase aqueuse
ce qui rend l’extraction plus efficiente.
3.2. Extraction et purification des AN
 Méthode organique: Phénol-Chloroforme

a- Déprotéinisation et inactivation des nucléases

b- Utilisation des solvants organiques: phénol-chloroforme

Rnase
3.2. Extraction et purification des AN
 Méthode non organique: salting-out

Principe:
C’est une technique de relargage, qui utilise des solutions salines à forte
concentration.
En effet, les sels minéraux à forte concentration nécessitent d’être entourés
par des molécules de H2O, ceci se produisant au détriment des protéines qui
se retrouvent privées d’eau. Il en résulte une insolubilisation et une
agrégation de ces dernières alors que l’ADN reste soluble. Après
centrifugation, cet ADN est prélevé et précipité (Miller et al., 1988).
3.2. Extraction et purification des AN
 La chromatographie:
Différentes méthodes chromatographiques peuvent être utilisées pour la
séparation des acides nucléiques telles que la filtration sur gel, l’échangeuse
d’anions, l’adsorption sélective ou la liaison par affinité.

 La chromatographie échangeuse d’anions:

Cette méthode est basée sur l’interaction spécifique entre les groupements
phosphates chargés négativement de l’acide nucléique et les charges
positives du support de la colonne.
Echangeuse
d’anions

Purification de l’ADN par chromatographie échangeuse d’anions

 La chromatographie d’affinité

La classe la plus étudiée des ARN est celle des ARN messagers. Ils se
caractérisent par la présence d’une longue queue poly(A) en 3’-OH, générée
suite à des modifications post-transcriptionnelles.

Sur le support de la colonne sont greffés des fragments nucléotidiques

constitués de quelques dizaines d’oligo(dT) qui permettent de retenir
uniquement les ARNm à travers leur queue poly (A) .
Purification de l’ARNm à partir des ARN totaux par chromatographie d’affinité
3.2. . Extraction et purification des AN
 La centrifugation
La centrifugation sélective est une méthode de purification puissante. Elle est
souvent combinée à une ou plusieurs autres méthodes.
 Centrifugation en gradient de densité: Séparation ADN/ARN

Séparation des acides nucléiques par ultracentrifugation

sur gradient de densité de Chlorure de Césium
3.3. Concentration de l’ADN par l’alcool
 4. Extraction de l’ADN plasmidique

Rappels sur les plasmides

• Petites molécules d’ADN habituellement circulaires,

• Existent indépendamment des chromosomes de l’hôte,
• Présents chez plusieurs bactéries (quelques levures et mycètes),
• Portant un nombre de gènes réduits,
• A réplication autonome,
• A information génétique non essentielle pour la réplication et la
multiplication de l’hôte.
 4. Extraction de l’ADN plasmidique

Technique de la lyse alcaline

 Lyse des cellules (SDS, Soude

(NaOH) pH= 13
Dénaturation des ADN totaux
(ADN génomique + ADN
plasmidique)
 Neutralisation du milieu avec
l’acétate de potassium pH = 5
(Renaturation de l’ADN
plasmidique et non pas de l’ADN
génomique).
 Centrifugation
 Concentration de l’ADN
plasmidique par précipitation
à l’alcool suivie d’une
suspension ADN plasmidique
Tampon TE
 5. Extraction de l'ARN

• La plupart des protocoles d’extraction de l’ARN impliquent l’extraction au

phénol-chloroforme qui est similaire à celle de l’ADN, avec toutefois
quelques différences.
• De part la présence des RNases, des enzymes extrêmement stables et
actives, l’extraction de l’ARN est très sensible.

Précautions à prendre

 Les gants doivent être portés tout le temps et les ustensiles stériles en
plastique doivent être utilisés tant que possible durant la manipulation pour
éviter l’introduction des RNases exogènes à l’échantillon.
 Les ustensiles en verre et les tampons utilisés pour l’extraction doivent
être autoclavés pour inactiver les RNases.
 5. Extraction de l’ARN
5.1. Méthode organique: Phénol-chloroforme

Les étapes d’extraction de l’ARN par les solvants organiques:

phénol/chlorophorme
 6. Quantification et contrôle de qualité des AN

a- Spectrophotométrie

DO à 260 nm DO à 280 nm
Absorbance des bases puriques et Absorbance par les protéines
pyrimidiques des AN (recherche de contamination)

Estimation de la pureté de l’ADN

R= Rapport DO 260 nm/DO 280 nm

Qualité de l’ADN Quantité des AN

Pur: R= 1.8 – 2
Contamination par prots: R < 1.7 DO (260nm) = 1 correspond à:
Contamination par ARN: R > 2 50µg/ml d’ADN db
33µg/ml d’ADN sb
Qualité de l’ARN 40µg/ml d’ARN
Pur: R ≈ 2
 b- Migration sur gel (électrophorèse)

Afin de vérifier la qualité de l’AN après extraction, une migration sur gel suivie
d’une visualisation sous UV est effectuée.
Principe:
 Séparation des AN chargés (-) sous champs électrique. La séparation
s’effectue sur matrice de gel selon la taille des molécules.
 Le gel est constitué d’une matrice de polymères baignant dans un tampon
conducteur.
 Deux principaux polymères sont utilisés: l’agarose et le polyacrylamide.

Agarose
Polymère à base d’agar; Utilisé à des [] de 0.5% à 2% (poids/volume)
Séparation des molécules de très grandes tailles

Polyacrylamide
Polymères d’acrylamide; Utilisé à de grandes [] de 4% à 20% (poids/volume)
Séparation des molécules de très petites tailles (20 – 2000 pb)
b- La migration sur gel (électrophorèse):
 7. Conservation des AN

 Conservation de l’ADN

L'ADN peut être conservé dans un tampon (Tris 10mM, pH=8) additionné
d'EDTA (1mM) à 4°C.
L'ADN peut être également conservé à -20°C dans le même tampon mais des
cycles successifs de congélation/décongélation entraînent des cassures des
acides nucléiques de grande taille (>10kb). D’où la nécessité de réaliser des
fractions aliquotes pour la conservation si nécessaire.

 Conservation de l’ARN
L’eau pure Rnase-Free est couramment utilisée pour la conservation des ARN;
dans ces conditions, Il demeure stable à -80°C pendant au moins un an. La
solubilisation de l’ARN dans le Formamide permet de le conserver à -20°C
pendant un an.