Université des Sciences et de la Technologie d’Oran "Mohamed Boudiaf"

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Génétique Moléculaire Appliquée

Unité d’enseignement Fondamentale 2 (UEF 3.1.2) : Biologie Moléculaire

Matière 1 : Biologie Moléculaire et Génie Génétique

Spécialité : Génétique

LMD 3ème année Licence

Dr. Nadjet BOUSHABA

24/09/2023 Année universitaire 2023-2024

 Programme
A. Biologie Moléculaire

Chapitre I. Méthodologie en Biologie Moléculaire

I. Méthodes de caractérisation et analyse de l’ADN
1. Définition
2. Extraction et purification de l’ADN
3. Quantification
4. Fragmentation
5. Séparation analytique et visualisation

6. Enzymes de restriction
7. Carte de restriction
8. Restriction et analyse du polymorphisme
8.1 Southern-blot
8.2 PCR et ses applications
B. Génie Génétique
Chapitre I. Sources et préparation de l’ADN à cloner

1. ADN génomique
2. ADN complémentaire
3. ADN synthétique

Chapitre II. Vecteurs de clonage

1. Vecteurs bactériens
1.1 Plasmides
1.2 Phages
1.3 Cosmides
1.4 PAC
1.5 BAC
2. Vecteurs de clonage dans la levure
2.1 Vecteurs intégratifs
2.2 Vecteurs autonomes dérivés du chromosome ou du plasmide 2μ
2.3 Chromosomes artificiels

3. Vecteurs eucaryotes (cellules animales)

3.1 Plasmides non réplicatifs
3.2 Plasmides réplicatifs
3.3 Virus

4. Vecteurs eucaryotes (cellules végétales) : Plasmide Ti et ADNT

Chapitre III. Procédés de ligation du vecteur et de l’ADN à cloner

1. Enzymes ligases
2. Procédés de ligation

Chapitre IV. Transfert de l’ADN dans les cellules

1. Transfert direct
1.1 Biolistique

2. Transformation/transfection
2.1 Méthodes chimiques : au chlorure de calcium (bactéries)
2.2 Co-précipitation de l’ADN et du phosphate de calcium
2.3 DAEA-dextran
2.4 Fusion des protoplastes
2.5 Electroporation
2.6 Transduction virale (encapsidation in vitro)
Chapitre V. Notion de banque d’ADN génomique et complémentaire

1. Banque d’ADN génomique

2. Banque d’ADNc

Chapitre VI. Sélection des transformants recombinants

Sélection par complémentation

Chapitre VII. Criblage pour la détection des clones d’intérêt

1. Hybridation des acides nucléiques

2. Détection des produits d’expression

Chapitre VIII. Notions de transgénèse animale et végétale

1. Transgénèse animale
2. Transgénèse végétale
Cours : 01 Chapitre I. Méthodologie en Biologie Moléculaire

Chapitre I.
Méthodologie en Biologie Moléculaire
A. Biologie Moléculaire
1. Définition

 Science qui étudie le fonctionnement d’une cellule vivante au niveau de ses

molécules (ADN, ARN et protéines).

 Elle fait appel à la Génétique, la Biochimie et la Physique.

2. Extraction et purification de l’ADN

 L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules

ou de tissus.

 L’ADN extrait peut être utilisé pour des recherches de Biologie Moléculaire
telles que la PCR (Plymerase Chain Reaction) le séquençage, le clonage…etc
 L’ADN peut être extrait à partir de :

- Tissus (organes, biopsie)

- Sang
- Muqueuse buccale
- Cellules en culture
- Sperme
- Urine, larmes, bulbe de cheveux ou de poils, ongles, …
- Sécrétions vaginales
- ADN de contact.
 Différentes méthodes d’extraction de l’ADN :

- Au phénol
Toxiques
- Chlorure de
guanidinium

- NaCl2 (Salting-Out) Non toxique, non coûteuse

Protocole expérimental (sang total) au NaCl2
Méduse
Conservation de l'ADN

 Stockage des acides nucléiques se fait au froid :

- Stockage à court terme, l'ADN est gardé à + 4°C

- Stockage à long terme, l'ADN est placé à - 20°C

 3. Quantification de l’ADN

 Dosage de l’ADN par spectrophotométrie

 Mesure de l’absorbance ou Densité Optique (DO) de l’ADN

dans l'ultra-violet à 260 nm

 Mesure de l’absorbance des protéines à 280 nm (éventuelle

contamination par les protéines)
Dilution de l’ADN Cuves en Quartz
(1/100)

Spectrophotomètre
Quantification et analyse d’ADN par spectrophotométrie.
 1 Unité de densité optique à 260 nm correspond à :

 Une solution d’ ADN double brin à 50 μg/ml,

 Une solution d’ADN simple brin ou ARN à 25μg/ml.

Pureté d'un échantillon ADN

Ratio Valeur Indication de pureté

Présence de
< 1,8
DO260/DO280 protéines
>2 Contamination ARN

1,8 - 2 ADN pur

Concentration de l’ADN = DO 260 nm x 50 x 100 = µg/ml ou
ng/µl
1 U DO 260 = 50 µg/ml d’ADN

Facteur de dilution de l’ADN = 100

4. Fragmentation

 Fragmentation de l’ADN correspond à des cassures dans le matériel

génétique à des sites spécifiques à l’aide d’enzyme de restriction

 Conditions d’incubation : tampon, température et temps

 1 Unité d’enzyme de restriction peut digérer 1 µg d’ADN dans des

conditions adéquates.
5. Séparation analytique et visualisation

 Electrophorèse en gel d’agarose est une technique qui permet de séparer des
fragments d’ADN en fonction de leur taille en utilisant un champ électrique

 Taille des fragments d’ADN est déterminée en présence d’un marqueur de

taille

 Bromure d’éthidium (BET) est un agent intercalant : colorer l’ADN sous

les ultra-violets

 Bleu de bromophénol est un colorant pour voir le front de migration

 Sucrose : alourdisseur de l’ADN.

 Mise en place du peigne et des joints de coulage
BET dans le gel d’agarose
Verser le tampon dans la cuve Dépôt des échantillons
d’électrophorèse
 Cathode
(-)
Sens de la
migration
Anode
(+)

Sortir le gel de la cuve

délicatement par glissement
 Echantillons

Marquer
de taille

Fragments
d’ADN

Visualisation des fragments d’ADN sous U.V.