UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE MASUKU CENTRE INTERNATIONAL DE

RECHERCHES MEDICALES DE
FRANCEVILLE

Mémoire de Master 1
Parcours : Biochimie biologie moléculaire et cellulaire

Activité des endonucléases de type II SUR L’ADN extrait par des méthodes
non organiques en comparaison à l'ADN extrait par phénol/chloroforme.

Présenté par: Sous la direction de:

POUNGOU Natacha Pr Jean Paul AKUE Maitre de Recherches CAMES

Dr NDONG ATOME Guy Roger Maitre-assistant CAMES

Année académique 2017 -2018

 PLAN

INTRODUCTION
I-OBJECTIFS
II-MATERIEL ET METHODES
III-RESULTATS
IV-DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSEPECTIVES
 INTRODUCTION

 ADN

• Substance autoreproductrice, et composante principale des chromosomes

• Support de l’information génétique transmise de génération en génération.

• En 1953, James D. Watson et Francis H.C.Crick proposaient une structure

tridimensionnelle en forme de double hélice pour la molécule d’ADN.

1
Figure 1 : La double hélice :modèle rubans (Housset and Raisonnier 2006)

2
 Méthodes d’extraction

• Une grande variété de méthodes d’extraction de l’ADN ont été décrites

( phénol/chloroforme décrite par Chomczynski et Sacchi en 1987; l’extraction
au méthanol, au CTAB,par les kits….).

• Fiabilité et sensibilité reposent sur des procédés d’extraction appropriés

aboutissant à une quantité suffisante d’ADN pur.

• L’isolement de l’ADN génomique est une étape primordiale dans différentes

applications en Biologie Moléculaire

3
Enzymes de restriction

• Il existe trois types d’enzymes d’endonucléase (I, II et III)

• L’activité des endonucléases de type II détermine l’intégrité de l’ ADN extrait.

Les méthodes d’extraction de l’ADN ont été évaluer sur la base de plusieurs
paramètres (Rendement , pureté et le temps de purification requis, les risques ,les
bénéfices, coût...)

4
 I-OBJECTIFS
Objectifs généraux

• Analyser qualitativement et quantitativement l’ADN par six méthodes distinctes;

• Etudier l’activité des enzymes de restriction sur l’ADN extrais.

Objectifs spécifiques

• Définir des méthodes simples mais efficaces d’extraction de l’ADN pour les laboratoires très
peu équipés (pays du Sud);

• Evaluer l’intégrité de l’ADN par usage des enzymes de restriction.

5
 II-MATERIEL ET METHODES
II-1.MATERIEL
 matériel de laboratoire:

Figure 2: microcentrifugeuses Figure 3: disposition du matériel sur paillasse

6
 matériel biologique: sang total prélever à l’URAM (Unité de Recherche et
d’Analyse Médical) au cirmf.

Figure 4:Prélevement du sang total

7
Dispositif pour la révélation de l’ADN
Dispositif pour la quantification de l’ADN
Dispositif pour la pureté de l ’ADN

Figure 5:electrophorèse

Figure7:Nano Vue Plus

Figure 6:Cubit 2.0

8
 II-2.METHODES
 Isolement des PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell.)

Centrifugation et
Dilution Ecoulement
récupération de
Prélèvement du sang de 7ml de
la phase
du sang de moitié sang dilué
blanchâtre
au PBS sur du ficoll
(3ml)

Phase contenant
les PBMC

Figure 8:depôt sur le ficoll Figure 9:séparation des phases

9
  Extraction au méthanol

 Extraction au Tris-EDTA

6 méthodes  Extraction par Salting-Out

d’extraction
 Extraction au CTAB

 Extraction phénol/chloroforme

 Extraction par les kits

10
 Préparation des échantillons pour Qubit 2.0

11
 Activité des endonucléases exemple
de EcoRI
Préparation des échantillons:
• 10XBuffer
• 1µl d’enzyme
• H2O
Figure10:Endonucléase de types II
 Calcule du rendement en ADN

Rendement (µg)= concentration de l’ADN (µg/ µl) x Volume total d’ADN extraits (µl)

12
 III-RESULTATS

 L’étude a permis de déterminer la quantité et la qualité des différents ADN extrais

 Evaluer l ’intégrité de l’ADN sous l’action de EcoRI

13
Figure11: Révélation des bandes d’ADN après électrophorèse sur
gel d’agarose à 0,8%.

PM Pc M12 T12 S12 C12 Q12

14
 Tableau 1: Différentes concentrations des ADN en ng/µl
Méthodes d’extraction Passage 1 Passage 2 Passage 3 Moyenne

S01 - - - 0
S02 - - - 0
PC1 ˃600 ˃600 ˃600 600
PC2 560 ˃600 ˃600 586,67
M1 238 272 266 258,67
M2 97,5 117 103 105,83
TE1 79 153 142 124,67
TE2 29,4 49,2 55,5 44,7
S1 7,17 9,42 7,99 8,19
S2 253 285 274 270,67
C1 19,2 22,6 20,5 20,77
C2 97,7 111 106 104,9
Q1 26,1 23,9 6,36 18,78
Q2 280 313 300 297,67 15
 Tableau 2:Rendement de l’ADN par le Qubit 2.0

ADN extrait Concentration x Volumes Rendement

PC1 600x100 60000µg
PC2 586,67x100 58667 µg
M1 286,67x125 32333,75 µg
M2 105,83x125 13228,75 µg
T1 124,67 x65 8103,55 µg
T2 44,7x65 2905,5 µg
S1 8,19x65 532,35 µg
S2 270,67x65 17593,55 µg
C1 20,77x100 2077 µg
C2 104,9x100 10490 µg
Q1 18,78x200 3756 µg
Q2 297,67x200 59534 µg
16
 Tableau 3: Quantité de l’ADN et lecture des densités optiques

Méthodes C A230n A260n A280nm A320nm A260 / A260/ A260/A230

d’extractions m m A280 A320
ng/ µl
S01 - - - - - - - -
S02 - - - - - - - -
PC1 65 0,49 1,47 0,94 0,175 1,688 4,154 4,11
PC2 65 0,49 1,47 0,94 0,175 1,688 4,154 4,11
M1 192,5 10,58 7 5,28 3,15 1,808 0,518 0,518
M2 125,5 20,19 19,23 18,23 16,72 1,609 0,723 0,723
TE1 619 80,18 65,06 59,70 52,68 1,764 0,450 0,450
TE2 202 28,66 20,23 18,58 16,19 1,690 0,324 0,323
S1 -8,1 -1,94 -1,76 -1,69 -1,60 1,731 0,474 0,470

S2 1,7 -0,63 -0,41 -0,42 -0,44 1,789 -0,178 -0,157

C1 -2,0 0,112 -0,037 -0,008 -0,003 3,636 -0,367 -0,295
C2 -3,8 -0,051 -0,032 0,003 0,043 1,875 0,798 0,797
Q1 0,2 0,73 0, 36 0,35 0,36 -0,5 0,01 0
17
 Tableau 4:Rendement pour le test au Nano vue plus

ADN extrait Concentration x Volumes Rendement

PC1 65x100 6500µg
PC2 65x100 6500 µg
M1 192,5x125 24062,5 µg
M2 125,5x125 15687,5 µg
T1 619 x65 40235 µg

T2 202x65 13130 µg
S1 -8,1x65 -526,5 µg
S2 -1,7x65 -110,5 µg
C1 -2,0x100 -200 µg
C2 -3,8x100 -380 µg
Q1 0,2x200 40µg
Q2 10,4x200 2080 µg

18
 Figure 12: Digestion totale et partielle des ADN

PM1 Pc M12 T12 S12 C12 Q12 Digestion-

Totale

PM2
Digestion-
partielle

19
IV-DISCUSSION
• Au cours de cette étude, on a revisiter six méthodes d’extraction de l’ADN.

Protocoles d’extraction:

• L’extraction au méthanol et au Tris-EDTA sont les plus simples à réaliser.

• Les méthodes au CTAB et au salting-out sont fiables avec de bon ratio A260/A280 .
(Rathanyaka 2011) ce qui corrobore avec l’analyse de Siew Lee Fong al., en 2009 la méthode
saline est plus efficace que celle des kits commerciaux d’extraction de l’ADN.

• Les coûts sont moindres par rapport à ceux du phénol /chloroforme ou des kits (Ameziane N. et
al.,2006).

20
• La méthodes au phénol/chloroforme est dite de référence

• la rentabilité de cette méthodes standard s’appuie sur l ’étude mené par Djurkin
Kušec, I. et al.(2015)

• Phénol/chloroforme est bien plus rentable, que les Kits commerciaux est une bonne
alternative.
Digestion enzymatique:

• L’efficacité de la digestion totale (2H) a été bien apprécié sur tous les échantillons
comparé à la digestion partielle (1H) (Nathans et Smith, 1975).

• Meselson et Yuan (1968) décrivent un protocole sur la digestion de l’ADN par les
enzymes issus de E.coli comparable à notre étude .

21
 CONCLUSION
• Un criblage de toutes les méthodes d’extraction de l’ADN a été effectué.

• La qualité de l’ADN pose toujours problème en ce qui concerne ses applications

ultérieures (PCR , clonages).

• Plusieurs paramètres sont à évaluer ( rendement ,risques, bénéfices, coût, temps)

• le temps est un facteur déterminant par exemple dans la mise en place des examens
cliniques.

• Les laboratoires du sud doivent adopter des méthodes simples et peu couteuses pour la
mise en place des diagnostiques de masse (détection de la microfilaire loa loa).

22
 PERSPECTIVES

• Revisiter les protocoles simples ( ajout de la protéinase K)

• Formation des techniciens de laboratoire au niveau des hôpitaux

• Etendre l’étude sur d’autres enzymes de restrictions de type II (BamH1)

• Mettre en place des diagnostiques médicaux de masse dans les laboratoires très
peu équipés ,une fois que l’intégrité de l’ADN a été vérifiée.

23
MERCIE POUR VOTRE ATTENTION