UE2 - Biologie Cellulaire - 12 – Méthodes d’études des cellules et des tissus

Pr. Oudar - ../../.. - ..H..

UE2 : BIOLOGIE CELLULAIRE

COURS 12 – MÉTHODES D’ÉTUDES

DES CELLULES ET DES TISSUS

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Méthodes d’études des cellules et des tissus

I. Introduction

II. Les techniques morphologiques

A) Les différents échantillons
B) Les techniques
C) La microscopie optique (ou photonique)
1. Le microscope optique (ou photonique) classique
2. Le microscope à contraste de phase (MO)
3. Le microscope à fluorescence (MO)
4. Le microscope confocal (MO)
D) La microscopie électronique
1. La microscopie électronique à transmission
2. La microscopie électronique à balayage

III. Études In Situ des constituants biochimiques

A) L’histochimie
B) L’histoenzymologie
C) L’immuno-histologie
D) L’hybridation in situ
E) L’autoradiographie

IV. Les techniques biochimiques (= non morphologiques)

A) La cytométrie en flux (FACS)
B) Le test ELISA
C) La chromatographie
D) L’électrophorèse

V. Autres techniques

A TOI DE JOUER
 ACC (Annales Classées Corrigées)
 ASTUCES, pour répondre rapidement & sans erreurs
 Correction détaillée

Abréviations fréquentes :

MO : Microscope optique ME : Microscope électronique AG : Antigène AC : Anticorps

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I. Introduction

Il est très vite apparu la nécessité d’avoir des outils suffisamment performants pour faire des observations
de cellules et de tissus, voire même de structures intracellulaires. C’est pour cela que le microscope photonique et
plus tard, les microscopes électroniques, ont été inventés.

II – Les techniques morphologiques 

Les techniques morphologiques permettent de faire des observations de cellules et de tissus dans des
conditions proches de celles du vivant.
Il faut noter que chaque microscope possède une limite. On parle de « pouvoir de résolution »

Pouvoir de résolution (D) d’un microscope

Il s’agit de la plus petite distance que l’on observe entre 2

Défini par la formule : points sans les confondre.

D = 0,61λ/N sinα Pour l’œil, ce pouvoir de résolution est de

Doeil = 0.2 mm

λ : la longueur d’onde du faisceau 

N : l’indice de réfraction (avec Nair= 1 et  L’indice de réfraction influe sur la résolution.

Nhuile=1.5)  Plus D est petit, plus le microscope est puissant.
α : la moitié de l’angle de diffusion du cône  Les cellules ne sont pas visibles à l’œil nu sauf les
de lumière ovocytes d’oursin.

Parallèlement au développement de ces outils, des techniques de préparation ont été créées. Par exemple, en
imagerie cellulaire, on dénombre 4 étapes :

 Description morphologique des structures : réalisation de coupes et observation au microscope

optique (MO) ou électronique (ME)
 Études In Situ des constituants biochimiques : localisation de sucres, lipides, enzymes, acides
nucléiques (par l’histochimie et l’histoenzymologie)
 Analyses moléculaires In Situ : répartition des composants dans une cellule, des protéines (par
l’immuno-histologie), des acides nucléiques (par l’hybridation in situ) et des macromolécules (par
l’autoradiographie)
 Analyse dynamique (suivi dans le temps) à l’intérieur d’une cellule avec des précurseurs radioactifs
(autoradiographie)

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A) Les différents échantillons

Elles peuvent être cultivées soit dans des boites de pétri, soit dans des tubes dans le
cas de cellules non adhérentes. La culture est effectuée dans des incubateurs.

*** Pour la culture de cellules des mammifères, des critères doivent être respectés:

 Incubateurs à 37°
 Atmosphère humidifiée
 Présence d’oxygène
Cellules vivantes  Présence de 5% de dioxyde de carbone
(ex vivo, in vivo)  Asepsie
 Dans des milieux de cultures spécifiques
à chaque type cellulaire (solide ou liquide)

On doit retrouver également tout ce qui est nécessaire au développement et à la

croissance cellulaire : sucres, acides aminés, facteurs de croissance,… chaque milieu
est adapté au type cellulaire qu’il contient. ***

Les cellules cultivées peuvent être issues de lignées de cellules (=culture primaire) ou
provenir d’organes (=culture secondaire)

Ils sont obtenus par les cliniciens et visualisés par microscopie après étalement
cellulaire (obtention d’une unique couche de cellules) entre lame et lamelle = frottis.
On y trouve :
 Liquides biologiques : sang, moelle hématopoïétique, LCR (liquide
Échantillons
céphalo-rachidien), urines
cellulaires
 Liquides pathologiques : épanchement pleural, du péritoine ou des
articulations
 Liquides d’exploration : lavage broncho-alvéolaire
 Brossage ou grattage : frottis buccaux ou vaginaux

Il s’agit de morceaux de biopsies réalisées lors d’opérations ou bien des biopsies

Échantillons
entières comme des ganglions entiers que l’on peut récupérer chirurgicalement.
tissulaires

B) Les techniques

Les photons ne pouvant traverser facilement les cellules et les tissus, on va réaliser des « objets » fins

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Le plus simple est de créer un étalement avec

un liquide, comme par exemple, lors d’un frottis
sanguin. On dépose une goutte de sang sur une lame,
puis, avec une lamelle de verre, on l’étale. On va ainsi
observer des cellules sanguines (essentiellement des
globules rouges).

Pour une concentration cellulaire pas trop élevée, il est possible de créer des suspensions cellulaires. On va
ensuite déposer une goutte de cette suspension et l’étaler avec une lamelle. En cas de concentration trop élevée, on
risque d’avoir plusieurs couches de cellules, ce qui rend les observations difficiles.

Dans le cas d’échantillons tissulaires, une biopsie par exemple, deux possibilités, pour réaliser des coupes
avec fixation des structures, sont envisageables:

→ La congélation est une technique rapide.

→ On procède soit à une congélation immédiate puis coupe avec cryostat
(enceinte réfrigérée) permettant d’avoir des coupes d’une dizaine de
micromètres.
→ Soit on plonge le tissu dans de l’azote liquide (-196°C) puis on le coupe avec
La congélation
un cryostat. Pour éviter une casse des cellules, on a recourt à l’utilisation de
cryoprotecteurs.
→ Les fines coupes (5 à 10µm d’épaisseur) obtenues seront ensuite fixées puis
colorées.
→ Les coupes seront ensuite observées au MO après fixation et coloration.

→ Il s’agit d’une technique plus longue.

→ Le but est de stabiliser les structures biologiques dans une organisation
La fixation chimique proche de celle du vivant, en utilisant des agents chimiques.
→ On utilise du formaldéhyde et/ou du glutaraldéhyde.
→ Permet de conserver plus longtemps les coupes et de réaliser des coupes plus
fines observables au ME

La fixation n’est pas toujours indispensable pour une observation au microscope photonique (ex : observation
de cellules vivantes)

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Quelque soit la microscopie, les

tissus seront déshydratés. On
effectuera ensuite des inclusions,
soit à partir de paraffine (MO), soit
grâce à des résines plastiques
(ME). Enfin on colorie les coupes.

Protocole de préparation avec fixation des échantillons en microscopie :

L’eau est remplacée

successivement (bains à FIXATION But : figer les structures
concentrations biologiques pour observer
progressives) par un des cellules proches de l’état
solvant organique (alcool) naturel.
car les produits d’inclusion
ne sont pas miscibles dans
DÉSHYDRATATION
l’eau.

INCLUSION MÉTALLISATION
On remplace par des bains
mM »DES
successifs (bains à HYDRATATION MEB
concentrations progressives) mM »DES
le solvant organique par le HYDRATATION
COUPE On refroidit ensuite le
matériel d’inclusion.
matériel d’inclusion : on
mM »DES
obtient un bloc dur qui va
HYDRATATION pouvoir être coupé par un
microtome (MO) ou un
COLORATION CONTRASTE ultra-microtome (ME)
mM »DES mM »DES
HYDRATATION HYDRATATION
MO MET
mM »DES mM »DES
On peut utiliser plusieurs microscopes, optiques ou électroniques :
HYDRATATION HYDRATATION

C) La microscopie optique (ou photonique)

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1. Le microscope optique classique (MO)

Dans le cas de la microscopie optique, c’est une source lumineuse, constituée de photons, qui est utilisée
pour éclairer la préparation. Le microscope comporte trois parties :
 Une partie mécanique qui fait varier les grossissements et supporte la lame,
 Une partie optique réunissant les lentilles nécessaires aux grossissements,
 Une source lumineuse.

La source lumineuse va émettre de la lumière qui passera par les lentilles de VERRE et la préparation,
pour finalement finir dans l’œil ou dans le système de capture d’image.
La première lentille traversée est le condenseur : il permet de concentrer la lumière émise en un faisceau.
On retrouve ensuite l’objectif, qui permet de jouer sur le grossissement (x25, x40 ou x100) (+ possibilité d’appareil de
capture d’image). Enfin, le faisceau traversera l’oculaire au travers duquel seront effectuées les observations et qui
permet un grossissement x10.

Récapitulatif Source Œil/Système de

Photon : Condenseur Échantillon Objectif Oculaire
lumineuse capture d’image

. Avec ce type de microscope, on peut obtenir des grossissements allant de 250 jusqu’à 1000. Son pouvoir
de résolution est de l’ordre de 0,2µm. Il permet de donner une bonne idée de la forme et de l’aspect des
cellules, voire l’allure du noyau ou d’une mitochondrie. Mais, autrement, de manière générale, l’ultrastructure
est peu observable.
Il est nécessaire d’utiliser une préparation fine et d’augmenter les contrastes par une coloration.

 Préparation :

Fixation soit dans du formaldéhyde, glutaraldéhyde, acétone,...

Déshydratation et inclusion en paraffine (liquide 55-60°C).
Coupe (microtome) de 5 µm, dépôt sur lame de verre, réhydratation et coloration.


2. Le microscope à contraste de phase (MO)

Il s’agit d’un microscope optique permettant de visualiser des organismes vivants. Ce type de microscopie
a permis de fournir un certain nombre d’informations, essentiellement sur le déplacement et la division des
cellules, mais aussi sur les mouvements intracytoplasmiques (des vésicules et des organites).
Il se base sur la déviation des rayons lumineux = déphasage.
Le faisceau, constitué de photons, traverse l’objet, et les différentes structures présentes dévient
différemment les ondes lumineuses en fonction de leur nature : on obtient ainsi différentes zones.
Si la structure laisse passer la lumière en phase, il n’y a pas de déviation, la brillance augmente. En
revanche, la brillance diminue si la structure laisse passer la lumière en décalage. On obtient ainsi une image en
niveau de gris qui visualise tous les changements de milieu à l’intérieur de l’objet observé.

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Récapitulatif – Photons :

Pas de déviation des ondes lumineuses → Passage en phase→ Augmentation de la brillance

Déviation des ondes lumineuses → Passage en décalage → Diminution de la brillance

 Préparation :

Aucune fixation ou coupe n’est effectuée. Une simple coloration sera faite. Toutefois, les cellules
observées seront moins contrastées que celles observées au MO classique.

3. Le microscope à fluorescence (MO)

Encore une fois, il s’agit d’un microscope de type optique. Il est équipé d’une lampe UV, de filtres
d’excitations (λ1 ) pour choisir la longueur d’onde incidente et de filtres d’arrêt de λ1 pour sélectionner les
radiations émises par l’objet. Ce microscope détecte la lumière émise par des molécules fluorescentes (λ2 ) après
excitation à certaines longueurs d’onde.

On éclaire la préparation à l’aide de la lampe UV, qui va émettre une lumière d’une certaine longueur
d’onde. On sélectionne, grâce au filtre, une longueur d’onde que l’on nommera longueur d’onde d’excitation. Cette
dernière va passer à travers la préparation qui contient une molécule fluorescente. Elle sera excitée et émettra à
son tour une onde possédant une longueur d’onde supérieure à la première. Ainsi, on pourra observer les
molécules fluorescentes.
Récapitulatif – Photons

 Préparation :
Ce type de microscopie n écessite un marquage avec des anticorps couplés à des fluorochromes ou
protéine fusionnée à une molécule naturellement fluorescente (plus rare).
Exemple de fluorochromes que l’on peut utiliser :
 Fluorescéine : absorbe dans le bleu et émet dans le vert.
 Rhodamine : absorbe dans le vert et émet dans le rouge.

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Ce microscope est fréquemment utilisé pour observer des protéines spécifiques. Il permet de localiser les
molécules marquées sur fond noir. MAIS il s’agit de microscopes volumineux qui ne permettent pas une
observation détaillée des structures.

4. Le microscope confocal (MO)

Créé en 1988, il s’agit d’un microscope à fluorescence dont la lampe UV est remplacée par un laser. Encore
une fois, la longueur d’onde, émise par le laser, entrera en contact avec la préparation qui, à son tour, émettra une
nouvelle longueur d’onde. L’avantage du microscope confocal est que l’on peut jouer sur la pénétration du faisceau
du laser à l’intérieur de l’échantillon, qui peut aller en profondeur dans cet échantillon. Cela permet d’observer des
échantillons plus épais qu’avec un microscope classique. On parle de coupes optiques, qui seront réassociées par
ordinateur pour former des images 3D.

Il permet une localisation plus précise des molécules marquées par fluorescence (noyaux, cytoplasme,
surface de la cellule,...) + la reconstitution d’image en 3D.

D) La microscopie électronique

Ce type de microscopie permet d’observer des structures à l’intérieur même des cellules. Ce sont des
microscopes très performants. En revanche, ils ne permettent pas l’observation de tissus vivants.

1. Le microscope électronique à transmission (MET)

Contrairement à la MO, ce sont les électrons qui jouent le rôle de source. Ils sont produits par
échauffement de la cathode (échauffement d’un filament de tungstène qui émet ces électrons). Ainsi produits, ils
vont être attirés par l’anode localisée dans la partie supérieure de l’appareil. Il existe en effet une tension très
élevée de 40 à 100 kVolts qui attire les électrons. Ceux-ci arrivent dans toutes les directions et sont canalisés par
un condenseur pour donner un unique faisceau d’électrons. Celui-ci va passer à travers des lentilles ou bobines
électromagnétiques. L’image va ainsi apparaitre sur un écran recouvert de molécules fluorescentes. Ces
dernières seront alors excitées par les électrons et émettront, de ce fait, de la lumière (photons) : image (jaune-
vert) + capture d’image.

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 Préparation :

Comme pour le MO, on utilise un fixateur avec du formaldéhyde (bon pénétrant

mais fixateur moyen) et/ou glutaraldéhyde (moins pénétrant mais bon fixateur) ou
tétraoxyde d’osmium (bon fixateur de lipides). Puis, on effectue une déshydratation.
Récapitulatif– Électrons :Pour terminer, on fait une inclusion en résine plastique de
type époxy araldite (polymérise à 60°C). Les biopsies ainsi préparées seront placées dans
un ultramicrotome, au tranchant de diamant, qui effectuera des coupes extrêmement
fines (d’environ 50nm, <0.1 µm).
On procède alors à un dépôt sur grille de cuivre ou platine et utilisation d’agent
contrastants : métaux lourds (acétate d’uracile, citrate de plomb)

 Résultats/ limites :

On note qu’au sein du ME règne un vide extrêmement poussé. Il permet d’éviter

la déviation des électrons engendrés.
Le pouvoir de résolution d’un ME est théoriquement de 0.1 nm, mais en réalité,
il est de l’ordre de 2 nm. Le grossissement est de l’ordre de x30 000 à x100 000.
L’échantillon est obligatoirement fixé et mort. (car vide poussé dans la colonne
du microscope)

2. Le microscope électronique à balayage (MEB)

On trouve en son sein, des bobines électriques déflectrices (faisceaux d’électrons) susceptibles de balayer
la surface de l’échantillon (recouvert par un métal) et d’en donner une image en volume. Le faisceau d’électrons
va balayer la surface et cette dernière va, à son tour, émettre des électrons dits «secondaires» analysés par un
détecteur (tension de 1 à 40 kVolts)

Récapitulatif – Électrons

Émission d’électrons Système d’analyse

Surface
secondaires d’image
d’échantillon

 Préparation :

 Fixation et déshydratation.
 PAS DE COUPE.
 Métallisation : métaux (platine, carbone) d’un échantillon entier. Exemple : petits insectes.

Ce microscope permet donc, non pas des observations de l’intérieur de la cellule, mais de la surface des
échantillons = image en relief. Encore une fois, les tissus et les cellules observés sont non vivants. En revanche,
cette microscopie permet d’observer des petits organismes entiers (insectes).

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 Il existe aussi la microscopie quantitative : extraction de mesures quantitatives d’une image numérique.
Technique qui fait appel à des algorithmes de segmentation, de reconnaissance de forme dans le but de
réaliser un comptage

 Ces outils permettent principalement l’observation et la description morphologique des tissus. Cependant,
on peut avoir besoin de localiser plus précisément certaines structures. Pour cela, on va utiliser plusieurs
techniques d’études In situ pour mettre en évidence un certain nombre d’objets.

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

III – Études In Situ des constituants biochimiques 

A) L’histochimie

L’histochimie est basée sur l’ajout de réactifs à une préparation afin de créer une réaction chimique
permettant la coloration de la molécule d’intérêt.



Exemples : 

 On peut utiliser la technique de coloration PAS (= AC périodique-réactif de Schiff) qui permet de

mettre en évidence de façon spécifique les glucides : tout ce qui apparait en rose-fuschia correspond à
des lieux de stockage de résidus glucidiques dans les cellules.
 Mais aussi la coloration Feulgen-Rossenbeck : coloration en bleu foncé-noir des acides nucléiques, et
notamment de l’ADN.

La molécule d’interêt (lipides, protéines, sucres,.. dans une cellule ou un tissu) sera ensuite détectée au MO.

B) L’histoenzymologie

Elle permet de mettre en évidence des enzymes dans les cellules ou les tissus. Pour cela, on utilise
l’activité enzymatique naturelle présente dans les cellules : la présence de l’enzyme recherchée est décelée par
son action sur un substrat fourni au cours de l’expérience. Il suffit de choisir un substrat qui, une fois modifié, sera
visible en MO ou ME. L’action de l’enzyme est alors révélée par une réaction colorée (produit coloré)


Exemples : 
 Mise en évidence des activités peroxydase (enzymes, dans le foie par exemple) : peroxydase
(enzyme) + DAB (substrat incolore) + H202 (catalyseur) : précipité brun
 Autres exemples : mise en évidence des phosphatases acides dans les lysosomes, d’activité tyrosine
dans les mélanocytes, d’activité ATPasique dans les cellules musculaires,...

L’histoenzymologie nécessite d’adapter le substrat à chacune des enzymes que l’on souhaite étudier.
L’enzyme sera ensuite localisée par MO dans une cellule ou un tissu. Pour utiliser cette technique en ME, il suffit
que le produit obtenu soit dense aux électrons (comme, par ex, le DAB).

C) L’immuno-histologie

Elle va permettre de localiser des antigènes grâce à l’interaction antigène (AG)/anticorps (AC). Il s’agit
en règle générale de protéines. On utilise soit des AC monoclonaux, soit des AC polyclonaux, qui vont être dirigés
contre l’AG que l’on recherche. On doit prendre soin de marquer ces AC de manière à pouvoir les observer en MO
ou MET dans une cellule ou un tissu. Il existe deux façons de procéder :
Basée sur une réaction AG-AC où l’anticorps peut être couplé à une enzyme (par
Façon réaction enzymatique, détection au MO), un fluorochrome (détection au MO à
directe fluorescence) ou des billes d’or denses aux électrons (de 1 à 20nm de diamètre,
détection au MET)

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Si un marquage simple ne suffit pas (1er signal insuffisant, par exemple si l’AC
primaire est très peu présent dans la cellule), on utilise la technique de révélation
Façon indirecte. Un AC primaire reconnaît l’AG puis plusieurs anticorps 2aires (espèce
indirecte animale différente de l’AC primaire) reconnaissent spécifiquement l’AC primaire
permettant ainsi d’amplifier le signal.
Ce sont ces AC 2aires qui sont marqués (fluorochrome, enzyme, billes d’or).
Cette technique est réalisée de préférence à partir de tissus congelés, plutôt qu’après fixation et une
inclusion en paraffine qui risqueraient de masquer les antigènes.

D) Hybridation in situ

On remplace le complexe AC/AG par la complémentarité des bases azotées. Il s’agit en effet d’une
hybridation (par des liaisons hydrogènes) de la séquence recherchée aves une sonde complémentaire d’acide
nucléique simple brin marquée : hybridation ADN/ADN, ARN/ARN ou ADN/ARN.
Exemple d’utilisation d’hybridation in situ : recherche d’ARNm viraux.

Les sondes utilisées peuvent être froides ou radioactives.

 Sonde froide : chaine d’acide nucléique marquée par la biotine-avidine, la digoxigénine ou un
fluorochrome.
 Sonde chaude : chaine d’acide nucléique radioactive.

La séquence nucléotidique (ADN ou ARN) sera ensuite localisée sur une coupe de tissus + on récupèrera des
informations sur l’expression des gènes dans les tissus.

E) Autoradiographie

On incube des cellules ou un tissu avec une molécule radioactive puis l’échantillon est plongé dans une émulsion
photographique et révélé à l’abri de la lumière. Les grains d’argents réduits, argent métallique, sont ensuite
observés sous la forme de points noirs.

 Isotopes (ou radioéléments) les plus utilisés : 14 C, 3H (tritié) 32P, 35S

 Exemple : recherche de récepteurs aux neuromédiateurs

La molécule (protéine, ADN) radioactive sera ensuite détectée dans les tissus.

IV – Techniques biochimiques = techniques non morphologiques

A) Cytométrie en flux
Elle permet la détection de molécules fluorescentes dans les cellules.
La cytométrie en flux permet de faire défiler à grande vitesse des cellules
Définition :
marquées avec des anticorps fluorescents dans une chambre d’observation et de
les différencier (ceux qui sont marqués ou non marqués) et de les compter.

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Fonctionnement

On utilise des anticorps marqués par fluorescence, qui reconnaissent

spécifiquement soit un antigène intracellulaire soit un antigène membranaire. Les
cellules sont mises en suspension au centre d’une gaine liquide d’entrainement.
Un laser excite le fluorochrome de la cellule marquée qui réémet une lumière. Un
dispositif permet de reconnaître les cellules fluorescentes (on affecte une charge
négative aux cellules fluorescentes), de les trier par rapport aux cellules non
fluorescentes.

Elle permet un certain nombre d’études, notamment du cycle cellulaire, via

l’utilisation de marqueurs fluorescents intercalants : on peut ainsi dénombrer le
nombre de cellules qui ont 1Q et 2Q. Ce type d’appareillage permet aussi une
numération de cellules possédant un certain antigène (intracellulaire ou de surface).
On peut y associer un trieur, permettant ainsi un tri des cellules, typage, en fonction
Résultats
de critères variables (ex : typage de leucémie ou de sous-population lymphocytaire).
La cytométrie en flux permet donc la quantification et tri cellulaire de molécules à
l’intérieur ou en surface de la cellule.
Elle ne permet cependant pas de localiser des molécules dans un tissu.

B) Le test ELISA (ENZYME LINKED IMMUNO-SORBENT ASSAY)

Il s’agit d’un test immuno-enzymatique qui permet de visualiser une réaction AG-
Définition : AC grâce à une réaction colorée produite par l’action sur un substrat d’une enzyme
préalablement fixée à un AC secondaire.

 Il existe l’ELISA indirect mais aussi l’ELISA sandwich. Dans les deux cas, les AC provient de 2 espèces
différentes.

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Un AG spécifique de l’AC recherché est absorbé au fond des puits d’une microplaque.
L’échantillon à doser contenant l’AC recherché est déposé dans les puits et si l’AC recherché est
ELISA indirect présent, il va se lier spécifiquement à l’AG.
= Recherche Un deuxième AC, couplé à une enzyme, capable de se lier à l’AC capturé est alors ajouté dans le
d’un AC puits et les AC secondaires non fixés sont éliminés par rinçage.
L’AC secondaire est couplé à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré. La
réaction peut ainsi être quantifiée par colorimétrie.

Un AC spécifique de l’antigène recherché est absorbé au fond des puits d’une microplaque.
L’échantillon à doser est ensuite déposé dans les puits et si l’AG recherché est présent il va se
ELISA sandwich lier spécifiquement à l’AC.
= Recherche Un deuxième AC, couplé à une enzyme, capable de se lier à l’AG capturé est alors ajouté dans le
d’un AG puits et les AC secondaires non fixés sont éliminés par rinçage.
L’AC secondaire est couplé à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré. La
réaction peut ainsi être quantifiée par colorimétrie.

Résultats :
 Dosage d’un antigène ou d’un anticorps dans un échantillon biologique
 Utiliser pour déterminer des concentrations sériques d’anticorps (ex HIV, ou principe du test de grossesse)

C) La chromatographie

Elle permet la séparation d’un mélange de molécules à travers une colonne

Définition : constituée de deux phases, obtenues après ajout du mélange : une mobile (liquide +
mélange de molécules) et une fixe (papier, gel, cellulose, ...). Il existe différents types
de chromatographie :

Chromatographie en gel (ou d’exclusion) :



= séparation des constituants du mélange sur une colonne remplie de billes poreuses formant un gel. Les
molécules sont entraînées par le solvant à des vitesses différentes selon leur taille. Les protéines de grande taille
seront ainsi piégées, alors que celles de petite taille migreront rapidement.

Chromatographie d’affinité:

= sur le support fixe est greffé un constituant ayant une affinité spécifique pour la molécule d’intérêt contenu dans
la phase mobile (ex : couplage antigène-anticorps)
Des anticorps sont fixés sur les billes de la colonne. Lors de leur passage, les protéines d’intérêt vont se fixer à ces
derniers. Le reste sera élué avec le solvant. Après utilisation d’un liquide de rinçage, on peut récupérer les protéines
qui se sont fixées.

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 Séparation des molécules en fonction de leur affinité avec la phase fixe.

Résultats :  Chromatographie sur gel : séparation en fonction de leur taille.
 Chromatographie d’affinité : séparation en fonction d’une affinité spécifique.

D) L’électrophorèse

Dénaturation des protéines puis migration sur un gel de SDS-PAGE (gel de

polyacrylamide)
Définition :
Elle s’applique aussi bien pour des protéines (gel d’acrylamide) que pour des
acides nucléiques (on utilise un autre gel, le gel d’agarose).

1. Dénaturation des protéines (perte de la structure 3D)

par chauffage en présence d’un détergent, le SDS (sodium
dodécyl sulfate) qui se fixe sur les protéines afin de les
charger négativement. Ajout possible d’un agent
réducteur pour rompre les pont-disulfures.
2. Dépôt des protéines en haut d’un gel de polyacrylamide
qui migrent vers le pôle positif sous l’action d’un
courant continu.
3. Migration selon leur poids moléculaire qui sera
déterminée par la présence d’un marqueur de poids
moléculaire déposée dans un des puits.
4. Coloration (bleu de Coomassie) pour rendre visible les
protéines présentes dans l’échantillon ou transfert sur une
feuille de nitrocellulose (technique de Western Blot)
sur laquelle on applique un anticorps marqué, spécifique
de l’antigène recherché. L’anticorps marqué permet de
détecter l’antigène ou la protéine d’intérêt uniquement.

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Séparation des molécules (protéines ou acides nucléiques) en fonction de leur poids

Résultats : moléculaires : les plus petites migrent le plus vite.

Estimation du poids/taille moléculaire grâce à un marqueur de poids moléculaire.

V. Autres techniques

 Utilisation de la radioactivité pour la détection et le suivi du devenir d’une molécule.

 Fractionnement subcellulaire
 Culture cellulaire :
o Culture primaire : Culture de cellules qui proviennent directement d’un tissu ou d’un organe. Il
faut dissocier les tissus pour obtenir une suspension cellulaire.
o Culture secondaire : Culture à partir d’un clone cellulaire et repiquage dans un autre
contenant.
 Techniques d’extraction, de purification et détermination de séquences protéiques et d’acides
nucléiques
 Outils informatique.

 Pour répondre aux questions posées en biologie cellulaire, il est nécessaire d’allier ces techniques à
la microscopie.

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A TOI DE JOUER
ACC: Méthodes d’étude des cellules et des tissus.

Décembre 2016 : Néant ; Décembre 2015 : Néant

Questions type association

Décembre 2013
Parmi les techniques d'études de la cellule suivantes :
A. Cytométrie en flux
B. Chromatographie d'affinité
C. Electrophorèse sur gel
D. Microscopie électronique
E. Microscopie confocale

QUESTION N°34
Quelle est celle qui permet de localiser des molécules fluorescentes ?
QUESTION N°35
Quelle est celle qui permet de quantifier des antigènes membranaires ?
QUESTION N°36
Quelle est celle qui est utilisée pour purifier des protéines ?

Décembre 2006
A. Microscopie électronique
B. Cytométrie en flux
C. Électrophorèse
D. Microscopie confocale
E. Fractionnement subcellulaire

Parmi les techniques ci-dessus qu’elle est celle qui permet de :

QUESTION N°57
Séparer des protéines ?
QUESTION N°58
Séparer les différents compartiments cellulaires ?

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QUESTION N°59
Observer des molécules fluorescentes ?

Questions à choix multiples

Décembre 2014
QUESTION N°5

La photo ci-contre représente :

A. Des cellules en microscopie électronique à transmission

B. Des cellules en microscopie à contraste de phase
C. Des cellules en microscopie optique après immunofluorescence
D. Des cellules en microscopie électronique à balayage
E. Aucune de ces propositions

QUESTION N°8

A propos des méthodes d’études de la cellule, quelle(s) est (sont) la (les) réponse(s)
exacte(s) :

A. On utilise des métaux lourds pour obtenir un contraste en microscopie

électronique
B. On utilise des métaux pour la microscopie électronique à balayage
C. Dans le cas de la microscopie électronique à balayage la tension est de plus de 40
kVolts
D. La microscopie électronique à transmission ne permet d’observer que des tissus
fixés
E. La microscopie à contraste de phase est basée sur le changement de phase d’une
onde lumineuse

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QUESTION N°24

A propos des méthodes d’études de la cellule, quelle (s) est (sont) la (les) réponse(s)
exacte(s) :

A. Un frottis cellulaire peut être réalisé à partir d’un lavage broncho-alvéolaire

B. Des colorations peuvent être réalisées sur des coupes de tissus congelés
C. Une coupe au microtome est de l’ordre de 0,1 µm d’épaisseur
D. Les techniques de microscopie nécessitent toujours des étapes de
déshydratation
E. L’histoenzymologie est basée sur des réactions de transformation de substrats
en produits

Décembre 2013

QUESTION N°22

À propos des méthodes d'études de la cellule :

A. La cytométrie en flux permet d'étudier le cycle cellulaire

B. La congélation par le froid peut être considérée comme une technique de fixation
C. La paraffine, milieu d'enrobage, est utilisée en microscopie électronique
D. Le pouvoir de résolution d'un microscope optique est de l'ordre du millième de
micromètre
E. On peut observer des mitochondries avec un microscope optique

Décembre 2012

QUESTION N°4

A propos des techniques utilisées en biologie cellulaire, toutes les propositions sont
exactes, SAUF UNE, laquelle ?

A. La cytométrie en flux permet de quantifier des protéines intracytoplasmiques

B. La microscopie électronique a un pouvoir de résolution théorique de l’ordre de
quelques nanomètres.
C. Les microscopes électroniques d’aujourd’hui permettent d’observer des cellules
vivantes.
D. Un cryostat est un appareil qui permet de faire des coupes à partir de tissus
déjà fixés
E. Il n’est pas toujours nécessaire d’utiliser des fixateurs préalablement à des
observations au microscope

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Décembre 2011

QUESTION N°49

A propos des techniques utilisées en biologie cellulaire, toutes les propositions sont
exactes, SAUF UNE, laquelle ?

A. L’hybridation in situ peut se faire avec une sonde marquée d’ADN simple brin
B. Dans une électrophorèse, les protéines migrent en fonction de leur poids
moléculaire
C. En culture cellulaire, il faut respecter des conditions d’asepsie
D. La cytométrie en flux permet d’étudier des protéines soit membranaires soit
cytoplasmiques
E. Des chélateurs de calcium sont indispensables pour la culture de cellules

QUESTION N°74

A propos de la cytométrie en flux :

1. C’est un laser qui permet de détecter la fluorescence émise

2. Les cellules sont mises en suspension au centre d’une gaine liquide
d’entrainement
3. On affecte une charge négative à toute cellule non fluorescente
4. Cela permet de dénombrer différentes populations cellulaires identifiées par un
fluorochrome

QUESTION N°75

Pour faire une culture de cellules in vitro à partir d’échantillons tissulaires, il faut :

3. Prélever un fragment tissulaire sur un être vivant

4. Ajouter du milieu de culture
5. Mettre la culture à une température de 37°C
6. Fournir des facteurs de croissance

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Décembre 2010

QUESTION N°67

A propos des méthodes utilisées en microscopie, toutes les propositions suivantes sont
vraies, SAUF UNE, laquelle ?

A. La paraffine est utilisée en microscopie optique pour permettre de faire des

coupes d’environ 5 µm d’épaisseur
B. L’huile dont l’indice de réfraction est de 1.5 permet d’augmenter le pouvoir de
résolution d’un microscope
C. La microscopie électronique à balayage permet d’observer des animaux entiers
vivants
D. Dans un microscope électronique, c’est grâce à la tension qui règne entre l’anode
et la cathode que les électrons émis par le filament sont attirés sous forme de
faisceau
E. L’histoenzymologie permet de localiser des enzymes dans des tissus

Décembre 2009

QUESTION N°1

A propos des méthodes utilisées en microscopie, toutes les propositions suivantes sont
vraies, SAUF UNE, laquelle ?

A. La chromatographie en gel permet de séparer des cellules selon leur taille

B. Le microscope confocal permet de localiser des molécules couplées à des billes
d’or colloïdal
C. La tension entre l’anode et la cathode dans un microscope électronique à
transmission est supérieure à la tension dans un microscope électronique à
balayage
D. L’hybridation in situ permet de visualiser des ARN viraux dans un organe
E. Le SDS (dodecyl sulfate de sodium) modifie la conformation tridimensionnelle
des protéines.

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Décembre 2007

QUESTION N°3

A propos des méthodes utilisées en microscopie, toutes les propositions suivantes sont
vraies, SAUF UNE, laquelle ?

A. La paraffine utilisée pour l’enrobage de biopsie est fluide à des températures

situées entre 55 et 60°C.
B. Le pouvoir de résolution d’un microscope dépend, entre autre, de l’indice de
réfraction du milieu.
C. C’est grâce au SDS que les protéines sont attirées par le pôle positif de
l’électrophorèse
D. La cytométrie en flux permet de localiser des molécules dans le noyau
E. Le microscope électronique à balayage permet d’observer des animaux entiers.

QUESTION N°42

A propos des ordres de grandeur en microscopie :

A. Avec un microscope optique de bonne qualité on peut obtenir un grossissement de

1000 fois au maximum
B. L’épaisseur d’une coupe de paraffine est de l’ordre de 5 µm
C. Le pouvoir de résolution d’un microscope électronique est de l’ordre de 2 nm voire
moins
D. L’épaisseur d’une coupe pour la microscopie électronique est de l’ordre de 50 nm

Décembre 2005

QUESTION N°21

A propos des différentes méthodes utilisées en biologie cellulaire :

1. La microscopie électronique à transmission permet de localiser des antigènes sur

des structures fines grâce à des anticorps couplés à des billes d’or
2. La microscopie à contraste de phase permet d’observer le déplacement
d’organites
3. L’électrophorèse permet de séparer des protéines selon leur poids moléculaire
4. L’hybridation in situ permet de localiser des ARN grâce à des hybridations
ADN/ARN

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Décembre 2004

QUESTION N°1

Parmi les propositions suivantes relatives à la microscopie, toutes sont vraies, SAUF
UNE, indiquez laquelle ?

A. La microscopie à contraste de phase permet d’observer des cellules vivantes

B. La microscopie électronique nécessite la « fixation » préalable des cellules
C. La microscopie électronique à balayage permet l’observation d’insectes entiers
D. Le pouvoir de résolution d’un microscope électronique à transmission est de
l’ordre de 0.2 pm
E. La microscopie confocale permet de faire des coupes optiques

QUESTION N°16

Parmi ces techniques employées en Biologie cellulaire ;

1. L’histoenzymologie permet de détecter des enzymes sur une coupe de tissu

2. L’électrophorèse permet de séparer des protéines grâce à des anticorps
3. L’hybridation « in situ » permet de localiser des acides nucléiques
4. La cytométrie en flux permet de localiser des antigènes de surface

QUESTION N°20

En ce qui concerne ces techniques utilisées en biologie cellulaire :

1. L’hybridation in situ est basée sur le principe de l’établissement de liaisons

hydrogènes entre 2 séquences nucléotidiques
2. La microscopie électronique à transmission ou à balayage ne permet d’observer
que des objets « non-vivant »
3. Le SDS est utilisé pour dénaturer les protéines lors de l’électrophorèse
4. L’immunocytochimie permet la détection de séquences nucléotidiques
déterminées.

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 CORRECTION

Questions type association

Décembre 2013 Décembre 2006

Q34 : E Q57 : C
Q35 : A Q58 : E
Q36 : B Q59 : D

Questions à choix multiples

Décembre 2014 Décembre 2013 Décembre 2012 Décembre 2011 Décembre 2010
Q5 : E Q22 : A B E Q4 : C Q49 : E Q67 : C
Q8 : A B D E Q74 : 2 4
Q24 : A B E Q 75 : 1234

Décembre 2009 Décembre 2007 Décembre 2005 Décembre 2004

Q1 : B Q3 : D Q24 : 1 2 3 4 Q1 : D
Q42 : 1 2 3 4 Q16 : 1 3
Q 20 : 1 2 3

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