Les méthodes d’exploration de la cellule

Introduction
Les organismes peuvent être :

- Composé de plusieurs cellules

- Composé d’une seule cellule

Les cellules peuvent être :

- Procaryotes
- Eucaryotes

Les eucaryotes peuvent être :

- Des globules rouges

- Des cellules vegétales
- Des neuones
- Des lymphocytes

La culture de cellules animales

 Les cellules adhérentes (tissus, organes…) : adhèrent sur la paroi au fond de la
boîte de culture. Elles ont une dépendance vis-à-vis de l’ancrage et une nécessité
d’être attachées entre elles et ancrées sur un support pour survire.

 Les cellules en suspension (moelle osseuse, sang…) : flottent dans le milieu et

prolifèrent en suspension.

Comment obtient-on des cellules ?

 Par centrifugation différentielle à partir d’un échantillon prélevé (de sang par
exemple) si les cellules sont circulantes.
 Par dissociation des tissus en éliminant la matrice extracellulaire avec libération des
cellules adhérentes (digestion enzymatique, action mécanique…).
Les cellules adhérentes (la plupart des cellules animales) : Après 50 divisions, les cellules
meurent.

Les lignées cellulaires

 Cellules ayant théoriquement une capacité illimitée de divisions : population

homogène de cellules stables après des mitoses successives.
 Il peut s’agir de :
o cellules souches ;
o cellules saines rendues immortelles (transformation = cancérisation) par
traitement mutagène ;
o cellules cancéreuses prélevées sur une tumeur au départ.

Cellules HeLa : l’incroyable destin d’une immortelle…

Henrietta Lacks : cancer fulgurant du col de l'utérus (octobre 1951 – 31 ans). Dès 1952, des
milliers de litres de milieu de culture sont produits.

Réaliser une culture cellulaire animale

 Conditions stériles
 Oxygène : indispensable pour la survie des cellules
 Température : doit correspondre à celle de l’organisme (généralement 37°C) ; les
embryons de poulet meurent lorsque la température dévie de seulement 1°C !
 Humidité : à 37°C, l’évaporation du milieu entraîne la concentration des sels ce qui
est toxique et provoque la mort cellulaire. Le corps humain est composé à 60% d’eau,
les organes ont 75-80% d’eau. Une humidité de 85-95% limite l’évaporation de l’eau.
 Taux de CO2 de 5% : le CO2 se dissout dans le milieu de culture et prévient son
alcalinisation spontanée, toxique pour les cellules. Il permet de maintenir un bon pH
(entre 7,2 et 7,4).
 Milieu de culture : Environnement contenant généralement :
o Eau
o Différents sels (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2…)
o Source de carbone et d’énergie comme le glucose (sucre)
o Acides aminés ne pouvant être synthétisés in vitro (certains servant de source
d’azote)
o Acides gras
o Parfois certains compléments :
 Vitamines
 Hormones
 Antibiotiques (pénicilline, streptomycine)
 Sérum (souvent de veau fœtal : facteurs de croissance, protéines pour
croissance cellulaire)
  Eventuellement un détecteur de pH (rouge de phénol)

acidification (contamination bactérienne, mort cellulaire,…) alcalinisation (problème CO2,

…)

Avantages et limites :
Avantages :

 Une cellule peut rapidement se développer, se multiplier et former des clones.

 Manipulation relativement facile.
 Pratique pour effectuer des criblages…

Limites :

 L’environnement des cellules en culture est radicalement différent de leur

environnement dans l’organisme : leurs propriétés peuvent donc être affectées.
 Immortalisation affecte le génotype et le phénotype (perte de certains
biomarqueurs)…
Les modèles en biologie :
a) Les bactéries (Escherichia coli)

Modèle unicellulaire procaryote.

 Très utilisé en biochimie, biologie moléculaire, génétique.

 Chaque colonie contient ∼ 10^8 cellules.
 Division rapide : environ toutes les 20 min.
 La sélection génétique de mutants est très rapide.
 Est utilisé aussi comme vecteur d’ADN.

b) La levure (Saccharomyces cerevisiae)

 Modèle facile et économique à manipuler.

 Unicellulaire eucaryote : les levures sont le modèle le plus simple des cellules
eucaryotes.
 Se reproduit vite (∼ 2 heures) et remarquablement adapté à l’analyse génétique
(génome entièrement caractérisé).
 Presque la moitié de ses gènes ont des homologues chez les mammifères.

c) Le vers (Caenorhabditis elegans)

 Modèle animal pluricellulaire (nématode).

 Utilisé pour comprendre le développement des animaux et la différenciation
cellulaire.
 Organisme totalement transparent, ce qui permet de suivre le devenir de chaque
cellule tout au long de son développement.
 Reproduction en 3 jours.
 Manipulations génétiques faciles.

d) La drosophile (Drosophila melanogaster)

 Intérêt en biologie du développement.

 Utilisé pour comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent le
développement animal.
 Etude en laboratoire facile ; reproduction rapide (∼ 2 semaines).
 Concepts de génétique (relation gènes-chromosomes) découverts grâce à ce modèle.
e) Le poisson zèbre (Danio rerio)

 Très utilisé en biologie du développement.

 Embryon transparent ; développement hors de la mère.
 Capacité à réparer ses organes.
 Les embryons se développent dans l’eau

f) La souris (Mus musculus)

 Parmi les mammifères, la souris est celle qui se prête le mieux à l'analyse génétique.
 Les progrès de la biologie moléculaire permettent d’étudier la fonction de gènes à
l’échelle l’animal entier.
 98 % d’homologie avec l’homme

g) Les plantes (Arabidopsis thaliana)

 Une « mauvaise herbe ».

 Facile à cultiver.
 Modèle de référence en biologie végétale : possibilité de suivre génétiquement de 5
à 6 générations par an.
 Intérêt en biologie du développement végétal (fleurs).

h) Les cultures de cellules en 3 dimensions

è Les sphéroïdes : Une agrégation auto-organisée de cellules formant une entité

sphérique.
o Provenance : Peut être n'importe quel type de cellule (primaire, lignées, etc).
o Culture : Il peut s'agir d'un seul type de cellules ou une co-culture de plusieurs
types de cellules.
o Taille : 50-500 µm.
o Formation : 2-3 jours.

è Les organoïdes : Ensemble de types cellulaires spécifiques d'un organe qui se

développent de manière similaire à ce qui se passe in vivo
o Provenance : Cellules souches ou cellules progénitrices.
o Culture : La différenciation des cellules souches d'origine génère une co-
culture de plusieurs types de cellules spécifiques à un organe. Nécessité
d’être dans un milieu semi-solide (matrigel).
o Taille : 2-3 mm.
o Formation : 21-28 jours.
La microscopie photonique
Le pouvoir de résolution de notre œil est limité (environ 100 µm).

Résolution : distance minimale entre 2 points qui permet de les distinguer l’un de l’autre.
Lorsque 2 objets sont distants de moins de 100 µm, la lumière réfléchie par chacun d’eux
frappe la même cellule détectrice du fond de l’œil. Ce n’est que quand les objets sont
distants de plus de 100 µm que la lumière réfléchie par chacun d’eux atteint des cellules
différentes, ce qui permet à nos yeux de les

résoudre comme 2 objets plutôt qu’un seul.

Le fonctionnement du microscope photonique conventionnel :

Le microscope (grâce à son objectif) a un meilleur pouvoir de résolution par rapport à l’œil.
Le microscope grossit à l’aide de plusieurs lentilles. Le condenseur permet d’éclairer l’objet
de façon uniforme et de moduler grâce au diaphragme la quantité de lumière arrivant sur
l’objet. L’objectif fournit une image réelle renversée agrandie et l’oculaire fonctionne
comme une loupe

PROBLEME : Les cellules sont composées d’environ 70% d’eau, 15% de protéines, 6% d’ARN
et contiennent de plus petites quantités de lipides, d'ADN et de petites molécules ELLES
SONT TRANSPARENTES.
Pour les visualiser :
è Tirer profit de la lumière

La lumière se déplace plus lentement dans un milieu dont l'indice de réfraction est plus
élevé.
La microscopie à contraste de phase génère une image dans laquelle le degré d'obscurité ou
de luminosité d'une région d'un spécimen dépend de l'indice de réfraction de cette région.

Le microscope à contraste de phase permet de déphaser les rayons lumineux produisant

ainsi des différences de contraste et de luminosité lors de leur recombinaison. Très utilisé
pour visualiser des cellules vivantes en culture, mais pas possible d’observer des échantillons
épais

èColorer
Utilisation de colorants ayant une affinité sélective pour des structures intra et
extracellulaires.
Les colorants peuvent être artificiels (dérivés de l’aniline) ou naturels (d’origine végétale ou
animale). Les colorations topographiques La microscopie photonique
 Les colorants basiques se fixent de préférence sur la chromatine et les
nucléoprotéines du cytoplasme. Exemple (TP) : Coloration à l’hématoxyline (colorant
cationique ou basique).
 Les colorants acides ont une affinité particulière pour les cytoplasmes et les
substances fondamentales. Exemple (TP) : Coloration à l’éosine (colorant acide
(anionique) se fixant sur des structures

Comment peut-on détecter les protéines dans des cellules

Détecter des protéines : stratégies expérimentales

Echelle cellulaire :
- Microscopie
- Cytométrie en flux

Lysat total :
- Biochimie des protéines

On utilise dans la plupart des cas des anticorps : Ils peuvent se fixer sur une protéine
d’intérêt.
Immunofluorescence : détection d’une protéine avec un anticorps sur lequel est fixée une
molécule fluorescente.

Dans cet exemple, il s’agit d’une immunofluorescence indirecte et le marqueur est

fluorescent.

La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d’émettre de la lumière après
avoir absorbé des photons de plus haute énergie (inversement proportionnelle à la longueur
d’onde).
Détecter des protéines : la microscopie à fluorescence

Expériences de co-marquages (détection de plusieurs structures sur un même échantillon) :

on utilise des marqueurs couplés à des fluorochromes différents. Les filtres placés sur le
trajet du faisceau lumineux d’excitation et d’émission permettent de sélectionner la lumière
émise par chaque fluorochrome.

Détecter des protéines : la cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technique qui permet de mesurer différentes caractéristiques
sur une suspension de particules (cellules, bactéries, parasites…) de chaque particule telles
que la taille et la complexité (granularité).

Grâce à la fluorescence, le FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting – type spécialisé de

cytométrie) permet de trier des populations cellulaires.
Détecter des protéines : microscopie ou cytométrie ?
La cytométrie en flux fournit des informations quantitatives sur des milliers de cellules mais
ne permet pas de les visualiser.
En revanche, la microscopie en fluorescence fournit des informations visuelles, mais ne
permet pas de quantifier facilement de grandes populations cellulaires.

- La microscopie électronique est plus résolutive (0.2 nm) que la microscopie

photonique en raison de la plus petite longueur d’onde des électrons.
- Un faisceau d’électrons traverse le spécimen et sert à former une image. Les zones
de l’objet qui dispersent les électrons apparaissent sombres.

Détecter des protéines : la microscopie électronique à transmission

Il y a des similitudes de conception générale entre la microscopie photonique et
électronique. Mais il y a des différences importantes :
• Les lentilles du microscope optique sont en verre, celles du microscope
électronique sont magnétiques ;
• Il n’y a pas de lumière dans Il n’y a pas de lumière dans un ME.

Particule d’or

Détecter des protéines : la microscopie électronique à balayage

La surface du spécimen est balayée par un faisceau d’électrons qui sont réfléchis par elle. La
topographie de la surface détermine le contraste et le contenu de l’image.

Détecter des protéines : le CLEM

La microscopie corrélative "CLEM" allie la puissance des approches en microcopies

photonique et électronique en combinant les images obtenues sur un même échantillon. La
CLEM permet ainsi de corréler des informations structurales et d'identification sur une
même zone d'observation.

Détecter des protéines : le western blot

Après lyse d’un échantillon, une électrophorèse est réalisée.
L’électrophorèse permet de faire migrer (séparer) des molécules (par exemple : protéines,
ADN, ARN) en fonction de leur charge et de leur taille en utilisant un courant électrique.
Détecter des protéines : stratégies expérimentales
Le dot-blot (Voir TP) Technique de détection, d'analyse et d'identification des protéines,
similaire à la technique du western blot, mais qui diffère par le fait que les échantillons de
protéines ne sont pas séparés par électrophorèse, mais sont déposés directement sur la
membrane..

Le test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) : Méthode pour détecter la présence

d’antigènes sur un support solide, très utilisée pour détecter des allergènes dans la
nourriture, détecter des anticorps dans le sang suite à l’exposition à une maladie (anticorps
anti-VIH par exemple…).

La spectrométrie de masse : Technique très puissante pour caractériser des protéines

(détermination de la masse d’une protéine ou d’un fragment de protéine, caractérisation
structure chimique…).

Comment peut-on détecter des acides nucléiques

Détecter des acides nucléiques

Electrophorèse sur gel d’agarose : Technique courante pour séparer les acides nucléiques.
Les molécules dʼADN et dʼARN sont chargées négativement à pH physiologique, elles migrent
en fonction de la taille vers l’anode. Les plus petites migrent le plus loin. Elles sont colorées
avec un agent fluorescent intercalant (ex : bromure d’éthidium ou BEt).
Il existe d’autres techniques pour détecter des acides nucléiques :

Le FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) : Méthode pour détecter des molécules d’ADN
ou d’ARN dans les cellules par hybridation avec des sondes fluorescentes.

Des micropuces à ADN : Méthode pour évaluer l’expression de plusieurs gènes en même
temps.
Comment localiser des protéines dans des cellules vivantes

Localiser des protéines sur des cellules vivantes :

La GFP (Green Fluorescent Protein) de la méduse peut être utilisée sur cellules vivantes.

La GFP (Green Fluorescent Protein) dans une cellule peut permettre de marquer et de suivre
une protéine d’intérêt.

La GFP (Green Fluorescent Protein) au niveau d’un organisme

La GFP (Green Fluorescent Protein) : de la cellule à l’organisme

Il existe de nombreuses protéines fluorescentes apparentées à la GFP

Comment savoir si une protéine est dynamique dans une cellule ?

Dynamique d’une protéine : le FRAP

Comment savoir si une protéine interagit avec une autre protéine ?
Interaction des protéines: stratégies expérimentales
Interaction des protéines : la co-immunoprécipitation

Immunoprécipitation de protéines = Capture d’une protéine à l’aide d’un anticorps

(immuno) et récupération par centrifugation ou à l’aide d’un aimant (précipitation).
Interaction des protéines : le FRET

Le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) permet de déterminer si deux protéines

(ou domaines protéiques) interagissent. Interaction des protéines : le FRET Protéine A
Protéine B L .

La microscopie confocale
Une limite majeure de la microscopie à fluorescence conventionnelle est que la fluorescence
émise ne vient pas que du plan focal (mais aussi des molécules au dessus et au dessous) :
l’image peut ne pas être suffisamment résolue.

Microscope confocal : un faisceau laser focalisé en un point balaye l’échantillon dans 2

directions, fournissant une image claire d’un plan de celui-ci, sans que les autres plans, situés
au-dessus ou audessous, ne « brouillent » l’image.
Quelle est la fonction d’un composant cellulaire ?
Fonction d’un composant cellulaire
Les techniques de microscopie permettent une visualisation plus ou moins détaillée de la
structure cellulaire mais elles ne sont pas suffisantes pour définir les fonctions des différents
composants des cellules eucaryotes. Pour répondre aux nombreuses questions concernant la
fonction des organites subcellulaires, il est nécessaire de les isoler sous une forme qui
permette de les étudier.

Comment isoler un organite en particulier pour pouvoir l’étudier ?

Fonction d’un composant cellulaire : le fractionnement cellulaire

Le fractionnement cellulaire est une technique puissante pour étudier le fonctionnement de
composants cellulaires :
- Elle peut être utilisée pour étudier le fonctionnement dʼun organite en particulier
(mitochondries, appareil de Golgi, chloroplastes...), pour préciser la localisation de
constituants cellulaires ou dʼactivités particulières.
- Elle est souvent un pré-requis à la purification ou à l’étude de constituants
cellulaires spécifiques (enzyme, facteur de transcription…).

Le fractionnement cellulaire fait appel aux techniques de centrifugation. Il existe deux types
de centrifugations :
- la centrifugation différentielle
- la centrifugation sur gradient de densité

La centrifugation différentielle sépare les constituants cellulaires en fonction de leur densité

et de leur taille.
rayon R et de sa densité rs.
Une particule de grande taille et de faible densité sédimentera à la
même vitesse qu’une particule de petite taille et de densité élevé