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Cours de Biologie cellulaire 1

1. Généralités sur la cellule

Chapitre I : GÉNÉRALITÉS SUR LA CELLULE

1. Caractères fondamentaux
Les cellules de tous les êtres vivants, qu´elles se présentent en structure organisée
autonome ou en unité intégrée dans un ensemble communautaire, ont en commun certains
caractères fondamentaux.

1.1. Nombre de cellules dans un organisme

Mis à part les unicellulaires et les formes qui ont un nombre constant et spécifique de cellules
(ex: Rotifères: Epiphaneo senta: 959 noyaux cellulaires: Némathelminthes), le nombre de
cellules est fonction de la taille du corps. Ce nombre croît jusqu´à la maturité de l´organisme.

Toutes les cellules ne se multiplient pas à la même vitesse. Chez l´homme, toutes les cellules
nerveuses sont formées à la naissance, elles sont irremplaçables. Les cellules sanguines et
celles des téguments ont une vie courte: Elles sont produites et remplacées de façon continue
jusqu'à la mort de l'individu (chaque jour 2 x 1011 cellules sanguines sont formées chez
l'homme).

On estime que le corps humain contient 100000 à 1 million de milliards de cellules et que
chaque seconde près de 50 millions de cellules meurent, cependant qu'un même nombre de
cellules sont formées.

1.2. Formes

Très variable, cela tient à la diversité des fonctions:


- Arrondies: cellules en milieu liquide (ex : cellules sanguines) par suite de la tension
superficielle (exception : spermatozoïde)

- Polyédriques dans un groupement de cellules parce qu'elles s'écrasent mutuellement

- Certaines cellules peuvent changer leur forme par des modifications de leur surface : les
pseudopodes, grâce auxquelles elles peuvent se déplacer ou se nourrir. Ex: amibes,
leucocytes.

- Il existe des cellules à forme étoilée, cas particuliers: cellules nerveuses et certaines cellules
du tissu conjonctif.

1.3. Dimensions

Les cellules animales ont un diamètre qui varie en moyenne entre 7 et 20 μ. Virus, bactéries
->100 à 1000 Å, ovule de batraciens et des oiseaux ->1 mm à 7 cm (autruche).

Prof. Yeya T. Touré, FMOS, USTTB, Bamako, Mali


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Chez l'organisme pluricellulaire adulte, la taille de la cellule est indépendante de la


taille du corps (les amphibiens par exemple ont des cellules d´une taille surprenante), mais
dans l'organe isolé, elle est liée à la différenciation et à l'activité de la cellule en question.

2. Structure microscopique et fonctions cellulaires


La vie de la cellule se déroule suivant un cycle (cycle cellulaire) à deux phases:
l´interphase et la mitose. L'interphase correspond à la période fonctionnelle d'intenses
activités biochimiques. La mitose représente la phase de division cellulaire.
Pendant l'interphase on distingue dans une cellule: une membrane, un cytoplasme contenant
des organites et un noyau.

Définition de la cellule :
La cellule est un volume de cytoplasme entouré par une membrane cytoplasmique (doublée
elle-même, chez les végétaux d'une paroi de nature pectocellulosique). Elle renferme un
noyau et différentes structures (exception: bactéries et cyanophycées sans noyau individualisé,
algues et champignons à cellules polyénergides) et se présente isolée ou associée à d'autres
cellules.

Les cellules ayant un noyau différencié, limité par une enveloppe nucléaire sont dites:
eucaryotes, celles n'ayant pas de noyau bien différencié sont dites procaryotes.

2.1. Cellule eucaryote (voir schéma: archétype cellulaire)

Elle est formée d’une membrane plasmique (en moyenne 8,5 nm d’épaisseur) qui limite le
protoplasme formé par le noyau (enveloppe nucléaire, pores, chromatine et nucléole) et le
cytoplasme constitué du morphoplasme (ensemble des organites : réticulum endoplasmique et
ribosomes, mitochondries, appareil de Golgi, lysosomes, peroxysomes, centriole(s)) et du
hyaloplasme (solution aqueuse, homogène et transparente qui contient le cytosol et le
cytosquelette formé de microfilaments et de microtubules).

La cellule animale diffère de la cellule végétale par:

- La présence du centrosome, lequel existe seulement chez les végétaux inférieurs:


thallophytes (algues et champignons), bryophytes (mousses) et ptéridophytes (fougères).
- l'absence de plastes (présent chez chlamydomonas et euglènes)
- l'absence d'une membrane cellulosique
- la présence de vacuoles moins volumineuses
- présence d'enclaves de glycogène

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Figure : Ultrastructure d’un archétype de cellule animale (Source : Claude-Louis Gallien (1983). Biologie : 1.
Biologie cellulaire. Biomed. Presses Universitaires de France (PUF). Paris, France).

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2.2. Cellule procaryote

Ce sont des organismes toujours unicellulaires caractérisés par une structure simple (1 à 10 μ)
observable au M O (ex. bactéries). Absence de noyau bien différencié (ADN libre et
circulaire), de réticulum endoplasmique, d’appareil de Golgi, de lysosomes et de
mitochondries. Absence de mitose et de méiose (les bactéries se reproduisent par scissiparité).
Présence de nombreux ribosomes et d'un mésosome (digitations de la membrane plasmique à
fonction mitochondriale) sur lequel se fixe le nucléoïde (chromosome bactérien). Possibilité
de présence d’une paroi bactérienne constituée de peptidoglycanes.

Malgré cette organisation simplifiée, la bactérie présente les activités fondamentales du


vivant (dualité : noyau-cytoplasme).

On classe parmi les procaryotes : les bactéries, les cyanophycées, et les mycoplasmes.

Figures : Cellule bactérienne et virus (Source : Claude-Louis Gallien (1983). Biologie : 1. Biologie cellulaire.
Biomed. Presses Universitaires de France (PUF). Paris, France).

2.3. Les virus (Acaryotes =15-350 nm)

Ils ne présentent pas d´aspect cellulaire. Ils sont constitués par un matériel génétique (acide
nucléique : ADN ou ARN) enveloppé dans une capside (formée par l’assemblage de petites
molécules protéiques : les capsomères) et sont observables seulement au microscope
électronique. Ils présentent une structure à symétrie cubique ou hélicoïdale.

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Un virus isolé ne présente aucune manifestation de vie. Les virus peuvent néanmoins
présenter certaines fonctions vitales lorsqu´ils parasitent une cellule hôte.

Exemples de virus à ADN et de virus à ARN :


-herpès, varicelle, zona à ADN --> Taille 100-150 nm
-picornavirus (poliomyélite) à ARN --> 20- 30 nm
-orthomyxovirus (grippes) à ARN --> 90-120 nm
-virus amaryl (flavivirus) à ARN --> 40- 50 nm de diamètre
-virus du sida à ARN (+ transcriptase reverse).

On utilise en biologie des unités de longueur que l’on peut définir ainsi :
1 mètre (m) =103 millimètres (mm) = 106 microns (µ) = 109 nanomètres (nm égale au mµ) =
1010 angstroems (Å) = 1012 picomètres (pm) = 1015 femtomètres (fm).

Ou 1 Å = 10−10 mètre = 0,1 nanomètre = 100 picomètres = 100 000 femtomètres.


1nm =1mµ= 10 Å

2.4. Principales fonctions cellulaires (tableau récapitulatif)

Structures et fonctions cellulaires

Structure Fonctions

Noyau

Chromatine (interphase), Centre de contrôle de la croissance


chromosomes (division cellulaire) et de la reproduction cellulaire.
Support de l’information héréditaire.
Pendant l’interphase, règle
le fonctionnement cellulaire.

Enveloppe nucléaire Marque une discontinuité, mais autorise


des échanges entre le cytoplasme et le
noyau.

Cytoplasme

Membrane cytoplasmique Règle les échanges entre la cellule


et le milieu extérieur. Perméabilité
passive ou active sélective

Réticulum endoplasmique Sépare deux phases cellulaires,


surface membranaire active intra-
cytoplasmique, réseau de transport
et de stockage.

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Ribosomes Granulations du réticulum rugueux.


Siège des synthèses protéiques.

Appareil de golgi, Stockage, maturation et conditionnement


dictyosomes des substances élaborées par la cellule.

Lysosomes, Vésicules contenant les enzymes


Peroxysomes digestives de la cellule.

Mitochondries Organites membranaires, centrales


énergétiques de la cellule.

Hyaloplasme Substance fondamentale du cytoplasme.


Support des organites cellulaires.
Tous les éléments du métabolisme
cellulaire y transitent.
Microtubules, microfilaments.

3. Les constituants de la matière vivante


L’ensemble de la matière (vivante et non vivante) est constituée d’environ 92 éléments, dont
16 se retrouvent dans toutes les formes vivantes et une dizaine d’autres peuvent à l’occasion
y être observés. En fait, les organismes vivants sont constitués essentiellement d’hydrogène,
d’oxygène, de carbone et d’azote (99% du poids total de la matière vivante). La vingtaine
d’autres éléments indispensables à la vie (oligo-éléments : Ca, Mg, Na, K, P, Si, Fe, S, Zn,
Cu, Mn, …) n’existent qu’à l’état de traces et représentent moins de 5% de la matière vivante.
En moyenne une cellule de bactérie est composée de 15% de protides, 3% de glucides, 2% de
lipides, 7% de nucléotides, 70% d’eau, 1 % de sels minéraux et 2% d’autres constituants
organiques (pool des précurseurs).

3.1. Les constituants organiques

3.1.1. Les glucides


Appelés aussi « sucre », ils sont composés de carbone, d’hydrogène et d’oxygène et
dépourvus d’azote. Leur formule générale est Cn(H2O)n (hydrates de carbone).
Ils comprennent de petites unités moléculaires ou monomères, aussi appelées
monosaccharides ou oses (glucides simples). Ce sont des polyalcools (fonction alcool=
groupe hydroxyle –OH), dont l’une des fonctions alcool est oxydée soit en fonction aldéhyde
(aldoses), soit en fonction cétone (cétoses). La longueur de la chaine carbonée varie de 3-9.
Les oses peuvent exister sous une forme linéaire ou sous deux formes cycliques. Les plus
importants sont les pentoses (en C5. Ex: D-ribose et son dérivé le désoxyribose qui entrent
sous forme cyclique dans la constitution des nucléotides) et les hexoses (en C6. Ex d’aldoses:
D-glucose, mannose, galactose ; Ex de cétose : fructose). Les oses peuvent subir des
modifications enzymatiques comme la phosphorylation et l’acidification. Ils peuvent subir un
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remplacement du groupement hydroxyle –OH par un groupement amine –NH2 pour la


formation des osamines qui peuvent à leur tour être acétylés (groupement N-acétyl :
-NH-CO-CH3).

Les monomères peuvent s’associer pour former des polymères (2 à plusieurs milliers de
sucres associés ou non à des protéines ou à des lipides). Les polymères peuvent constituer à
leur tour des édifices complexes et volumineux de macromolécules. On y distingue les
oligosaccharides (ou oligoholosides) de 2 à 9 oses (Ex : maltose, lactose, saccharose à 2 oses
et les polysaccharides (polyholosides) de plus de 9 oses (Ex : glycogène avec environ 30.000
résidus de glucoses).

Les glucides constituent la plus abondante source de l’énergie chimique nécessaire au


métabolisme cellulaire. Ils sont surtout d’origine végétale (par photosynthèse). Ils
interviennent également dans des processus complexes d’édification de macromolécules
(seuls ou associés à des protéines ou à des lipides) à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule.

3.1.2. Les lipides

On les appelle aussi des « corps gras ». Ce sont des substances qui contiennent dans leur
molécule des acides gras (en général l’acide gras estérifie un alcool, très souvent le glycérol).
Ils sont relativement insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques
apolaires (alcool, éther, chloroforme, toluène, acétone). On y distingue des lipides simples
composés de carbone, d’hydrogène et d’oxygène, des lipides complexes composés en plus
d’azote, de phosphore ou de soufre et enfin les stéroïdes qui appartiennent à la catégorie des
molécules liposolubles.

Les acides gras

Ce sont les constituants essentiels des lipides simples (formés par l’estérification d’alcools
par des acides gras). Leur formule générale est R-COOH. On distingue les acides aliphatiques
(ou acides gras saturés : (CH3-(CH2)n-COOH) supérieurs (n élevé et généralement pair),
monocarboxyliques (-COOH), saturés (-CH2-CH2-) ou non (présence de double liaison
-CH=CH-), linéaires ou cycliques. Ils réunissent au sein de la même molécule une extrémité
polaire hydrophile (avide d’eau) COOH, et une région apolaire hydrophobe présentant peu
d’affinité pour l’eau. Une telle molécule est dite bipolaire ou amphipatique.
Exemples d’acides gras saturés : Acide butyrique (C4), acide myristque (C14), acide
palmitique (C16), acide stéarique (C18), acide lignocérique (C24).

Les glycérides
Ce sont des esters d’un trialcool, le glycérol (CH2OH-CHOH-CH2OH) et d’acides gras
(R-COOH). Monoglycéride de formule : R-COO-CH2-CHOH-CH2OH. Ils sont très stables et
insolubles dans l’eau. Ils constituent 95% des lipides chez l’homme. Ils sont présents dans la
plupart des cellules et sont plus particulièrement localisés dans le tissu adipeux.

Les lipides complexes

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Les phospholipides : Ce sont des phosphoglycérides composés de : glycérol + 2 acides gras +


acide phosphorique + une molécule à fonction alcool généralement azotée qui permet de
différencier les phospholipides. Les plus importants phospholipides sont les lécithines
(estérifiées par la choline), les céphalines et les sphingomyélines. Ils sont surtout localisés au
niveau des membranes plasmiques et dans le tissu nerveux au niveau de la gaine de myéline

Les lipoprotéines : abondantes dans le sérum sanguin et dans le tissu nerveux, sont aussi
présentes dans les membranes cellulaires.

Les glycolipides : sont surtout représentés par les cérébrosides du tissu nerveux.
On y distingue le glycosyl-phosphatidyl-inositol (ou GPI) qui ancre certaines glycoprotéines
membranaires à la bicouche lipidique et les gangliosides présents dans les membranes
plasmiques dont certains sont des récepteurs membranaires de toxines bactériennes et
permettent leur entrée dans les cellules.

Les stéroïdes : sont des dérivés du cholestérol. Ils constituent un groupe très important
comprenant les hormones sexuelles, les hormones de la corticosurrénale, la vitamine D. Les
hormones stéroïdes sont synthétisées à partir du cholestérol par des cellules endocrines
spécialisées, en plusieurs étapes successives, dans la matrice mitochondriale, puis dans le
cytosol.

Rôles des lipides

Les lipides jouent plusieurs rôles : comme matériaux de « réserve » dans les cellules
(adipeuses), source d’énergie après dégradation, ancrage de protéines (auxquelles ils sont
couplés) aux feuillets cytosoliques ou extracellulaires de membranaires et dans la
communication intercellulaire (signaux de communication intercellulaire hydrosolubles ou
seconds messagers intracellulaires).

3.1.3. Les protides

Ce sont des dérivés azotés de constitution C-H-O-N (et S) : acides aminés, polypeptides et
protéines. Leur importance biologique est considérable ; les protéines représentent le
principal matériau cellulaire (protéines de structure), mais elles jouent aussi le rôle
fondamental de catalyseurs (protéines enzymatiques) et de régulateurs des activités
biologiques de la cellule.

Acides aminés
Les protéines sont des macromolécules composées de chaînes de molécules plus petites, les
acides aminés de formule générale :

R-CH-COOH (où R est un résidu variable).

NH2

Ces acides aminés sont unis par des liaisons peptidiques CO-NH. Il existe plusieurs acides
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aminés différents et vingt d’entre eux seulement (toujours les mêmes), peuvent entrer dans la
constitution d’une protéine.

Grâce à leurs groupements COOH (carboxyle) et NH2 (amine), les acides aminés sont
solubles dans les milieux aqueux. En milieu acide (riche en ions H+), un proton surnuméraire
est accepté par le groupement amine NH2. Il se forme alors un ion positif ou cation :
R

NH3+ C COOH.

En milieu plus alcalin (moins riche en ions H+), le groupement COOH se dissocie et perd un
ion H+, ce qui engendre la formation d’un ion double, neutre ou ion amphotère :
R

NH3+ C COO -.

H
Si le milieu est encore plus basique, le groupement chargé NH3+ perd à son tour un ion H+, et
l’acide aminé se comporte alors comme un ion négatif ou anion :
R

NH2 C COO -.

En solution, un acide aminé se présente exclusivement sous la forme d’un ion amphotère
neutre pour une certaine valeur du pH de la solution ; cette valeur correspond au point
isoélectrique. Le pHi est caractéristique d’un acide aminé donné. Le pHi des acides aminés
neutres est compris entre 5,5 et 6,3.

K: constante de dissociation. pK est le pH correspondant à la moitié de la dissociation de chacun


des deux groupements (COOH et NH2). pKCOOH est voisin de 2, le pKNH2 est compris entre 5,5
et 6,3. pHi est égal à :
pKCOOH + pKNH2
2

Les principaux acides aminés sont :


-Acides aminés monoacides monoamines simples : glycine ou glycocolle (Gly ; G), Alanine
(Ala ; A), Valine (Val ; V), Leucine (Leu ; L), Isoleucine (Ile ; I)
-Acides aminés monoacides monoamines alcools : Sérine (Ser, S), Thréonine (Thr ; T)
-Acides aminés monoacides monoamines soufrés : Cystéine (Cys ; C), Méthionine (Met ; M)
-Acides aminés diacides monoamines : Acide aspartique (Asp ; D), Acide glutamique (Glu ;
E)
-Acides aminés amides : Asparagine (Asn ; N), Glutamine (Gln ; Q)
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-Acides aminés diamines : Lysine (Lys ; K), Arginine (Arg ; R)


-Acides aminés cycliques : Phénylalanine (Phe ; F), Tyrosine (Tyr ; Y), Tryptophane (Trp ;
W), Histidine (His ; H), Proline (Pro ; P)

NB. Les abréviations des acides aminés en trois lettres et une lettre sont indiquées entre
parenthèses. Les neuf acides aminés essentiels (indispensables) qui ne peuvent être
synthétisés par l’homme et par conséquent doivent être apportés par l’alimentation sont
indiqués en gras.

Polypeptides et protéines

En général, on nomme polypeptides les « petites » protéines ne comprenant pas plus de 60


acides aminés au total, le terme de protéine étant plutôt réservé à des chaînes comportant au
moins une centaine d’acides aminés.

La séquence des acides aminés qui forment un polypeptide constitue sa structure primaire.
Cette séquence détermine la spiralisation de la chaîne, qui acquiert une forme spécifique par
établissement de liaisons hydrogènes (N-N, O-O, N-O) et des ponts disulfures (S-S) entre
certains acides aminés pour établir la structure secondaire du polypeptide (protéines
fibreuses). La spirale formée peut se reployer sur elle-même engendrant ainsi une structure
tertiaire ; la structure tridimensionnelle réalisée conditionne le rôle physiologique spécifique
du polypeptide (protéines globulaires). Enfin, pour certaines protéines, la molécule est
constituée par l’association de plusieurs chaînes polypeptidiques, l’ensemble formant la
structure quaternaire.

La classification des protéines est complexe. On distingue généralement les holoprotéines,


dont l’hydrolyse ne libère que des acides aminés, et les hétéroprotéines qui comportent en
plus des acides aminés, une fraction non protéique active dénommée groupement
prosthétique.

Classification des protéines :

Hormones et neurotransmetteurs peptidiques : vasopressine, ocytocine, insuline, glucagon..

Holoprotéines :
- Protéines globulaires : albumines, globulines, histones
- Protéines fibrillaires : Solubles (fibrinogène, myosine, actine) ; Insolubles
(collagène, kératine, fibroïne)

Hétéroprotéines :
- Chromoprotéines : hémoglobine
- Lipoprotéines
- Glycoprotéines
- Phosphoprotéines : caséine, protéines de chromatine, phosvitine
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3.1.4. Les acides nucléiques et les nucléotides

Les acides nucléiques

Les acides nucléiques sont des macromolécules de constitution C H O N et P dont la teneur


en phosphore (environ 10%) est caractéristique. Ils portent dans leur architecture moléculaire
l’information qui commande la synthèse des protéines, c’est-à-dire la séquence suivant
laquelle vont s’assembler des acides aminés pour former un polypeptide donné.

Les acides nucléiques sont des polymères (polynucléotides) résultant de l’association de


nombreux monomères, les nucléotides. Ceux-ci sont constitués par l’assemblage d’une base
azotée, d’un glucide en C5 (pentose : ribose ou désoxyribose) et d’un ou plusieurs
groupements phosphatés (à acide phosphorique). La combinaison de la base et du pentose
donne un nucléoside qui s’associe à l’acide phosphorique pour former un nucléotide (ester
nucléoside phosphate). La liaison inter-nucléotidique phospho-diester entre le carbone 3’ et le
carbone 5’ des pentoses successifs réalise la chaîne polynucléotidique. Les
polynucléotides (ADN et ARN) sont toujours associés à des protéines pour constituer des
complexes nucléoprotéiques.

L’acide désoxyribonucléique (ADN)


Son pentose est le désoxyribose. L’ADN contient 4 bases azotées différentes : deux bases
pyrimidiques : thymine (T), cytosine (C) et deux bases puriques : Adénine (A), Guanine (G).
On distingue donc 4 types de désoxyribonucléosides naturels (synthétisés par les cellules) :
désoxythymidine, désoxycytidine, désoxyadénosine et désoxyguanosine) et 4 types de
désoxyribonucléotides monophosphates : désoxythymidine-monophosphate ou dTMP,
désoxycytidine-monophosphate ou dCMP, désoxyadénosine-monophosphate ou dAMP, et
désoxyguanosine-monophosphate ou dGMP.
La polymérisation des désoxyribonucléotides (chaîne polynucléotidique) réalise la structure
primaire de l’ADN. L’ADN est formé par deux chaînes polydésoxyribonucléotidiques
associées (bicaténaire).

L’ADN nucléaire (sous forme de chromosomes) détient dans son architecture moléculaire
toute l’information nécessaire à la synthèse protéique ; le code génétique est inscrit dans la
structure primaire de l’ADN. L’ADN nucléaire (et les protéines associées) contrôle, par
l’intermédiaire des différents ARN, le fonctionnement de l’ensemble de la cellule, ainsi que
sa morphologie générale. Par ailleurs, les mitochondries contiennent un ADN (ADNmt) qui
leur est propre, d’origine maternelle et qui code pour les ARN mitochondriaux et 13 protéines
mitochondriales localisées dans la membrane interne.

Les acides ribonucléiques (ARN)


Leur pentose est le ribose et leur base pyrimidique est l’uracile (U) qui remplace la thymine
de l’ADN. Les monomères des ARN sont des ribonucléotides : cytidine-monophosphate ou
CMP, adénosine-monophosphate ou AMP, guanosine-monophosphate ou GMP et
uridine-monophosphate ou UMP. Les ARN sont monocaténaires (constitués par une seule
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chaîne polyribonucléotidique). Les différents types d’ARN sont associés à des protéines
spécialisées pour constituer des complexes de ribonucléoprotéines (ou RNP).

On distingue 3 grandes familles d’ARN :

-Les ARN ribosomaux (ARNr) : avec 4 types différents dont le nombre de nucléotides
(130-5000) et la composition sont constants pour une espèce donnée. Ils sont transcrits
essentiellement au niveau du nucléole
-Les ARN messagers (ARNm). Ils sont transcrits au niveau du nucléoplasme et apportent au
cytoplasme l’information génétique. Leur association dans le cytosol avec plusieurs
ribosomes (pour former les polysomes) est nécessaire à la traduction, c’est-à-dire la synthèse
protéique.
-Les ARN de transfert (ARNt). Sont synthétisés dans le nucléoplasme. Ils sont de petite taille
(75 à 85 nucléotides), solubles et ont la capacité de s’associer aux acides aminés, chaque type
d’ARNt étant spécifique d’un seul acide aminé. Les ARNt apportent aux ribosomes les acides
aminés qui seront polymérisés en protéine, selon une séquence définie par celle des bases de
l’ARNm.

En plus des trois grandes familles d’ARN précitées, il existe d’autres ARN de plus petite
taille (les petits ARN, les très petits ARN, les micro-ARN, les petits ARN interférents). Ils
jouent un rôle dans la maturation des ARNm, ARNr et ARNt, la synthèse protéique, la
reconnaissance de signal, et la régulation de l’expression des gènes.

Les nucléotides

Un nucléotide est composé de trois molécules : une base azotée, un glucide à 5 carbones
(pentose) et un ou plusieurs groupements phosphatés. Les nucléotides jouent des rôles
importants dans de très nombreuses voies métaboliques, en particulier lors des phénomènes
de transfert d’énergie chimique, de transport de sucre..

Précurseurs des acides nucléiques


-Désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) indispensables à la
synthèse et à la réparation de l’ADN
-Ribonucléotides triphosphates (ATP, UTP, CTP, GTP aussi écrits rATP, rUTP, rCTP, rGTP)
utilisés pour la synthèse des différents ARN.

Forme de stockage de l’énergie produite par la cellule


L’adénosine diphosphate (ADP), l’adénosine triphosphate (ATP) et la guanosine triphosphate
(GTP) sont des mononucléotides constitués par la combinaison d’une base (adénine ou
guanine), d’un sucre (ribose) et de deux ou trois molécules d’acide phosphorique (deux pour
ADP et trois pour ATP et GTP). L’hydrolyse de l’ATP ou du GTP suite au clivage des deux
liaisons phosphoryl (riches en énergie) par les enzymes ATPase ou GTPase permet la
libération de quantités importantes d’énergie. ATP et GTP interviennent dans les échanges
d’énergie au sein de la cellule. Ils sont aussi utilisés par certaines protéines (actine, tubuline,
protéine G) comme régulateurs de leur conformation spatiale.

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Certains nucléotides sont synthétisés sous forme cyclique

-L’AMP cyclique (AMPc) est un second messager synthétisé à partir de l’ATP par une
enzyme de la membrane plasmique, l’adeényl-cyclase (ou adénylate cyclase).
- Le GMP cyclique (GMPc) est synthétisé par une guanylate cyclase activé par le monoxyde
d’azote (NO). Il joue un rôle de signal chimique. Il contrôle aussi l’ouverture et la fermeture
de canaux ioniques (Na+, Ca++) dans les cellules photoréceptrices de la rétine.
-AMPc et GMPc sont dégradés en AMP et GMP par les enzymes phosphodiestérases

Les transports d’électrons ou de protons


La Nicotinamide Adénine dinucléotide (forme oxydée : NAD, forme réduite : NADH), la
Nicotinamide Adénine dinucléotide 3’-Phosphate (NADP) et la Flavine Adénine dinucléotide
(FAD) sont des dinucléotides responsables du transport d’électrons (de protons) en relation
avec les phénomènes de production d’énergie dans la cellule (respiration cellulaire).

Transports de molécules élémentaires (sucres et lipides) vers le lieu de leur utilisation pour
la biosynthèse des macromolécules
L’Uridine diphosphate (UDP) est synthétisé dans le cytosol et utilisé comme transporteur du
galactose (UDP-galactose) au moment de la synthèse d’une arborisation sucrée lors de la
glycosylation des protéines.

3.1.5. Associations entre différents composants organiques

Nucléoprotéines : Les acides nucléiques sont très souvent associés à des protéines, basiques
(protamines ou histones) ou acides, pour former des complexes appelés nucléoprotéines.

Glycoprotéines : Ce sont des composés résultant d’association protéines-glucides. Au sens


strict, le terme glycoprotéine s’applique à des molécules ramifiées, alors que les assemblages
linéaires longs et répétitifs sont décrits plus spécifiquement comme des mucoprotéines ou
protéoglycannes.

Lipoprotéines : Ce sont des composés complexes résultant d’associations entre lipides et


protéines.

Glycolipides : Complexes de lipides et de polysaccharides.

3.2. Les constituants minéraux

3.2.1. L’eau

L’eau est le constituant le plus abondant de la matière vivante. Elle représente 60-95% de la
masse d’une cellule active et 63-65% du poids corporel de l’homme. Au sein de la cellule,
elle sert de solvant et de milieu de dispersion. C’est aussi un fournisseur de liaisons
hydrogène, à ce titre, elle joue un rôle primordial dans l’établissement et le maintien de
l’architecture macromoléculaire de la cellule, ainsi que dans le fonctionnement de la matière
vivante. Enfin, l’eau intervient en tant que régulateur thermique.
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1. Généralités sur la cellule

3.2.2. Les sels minéraux

Ils se rencontrent généralement en solution dans le milieu cellulaire dissociés en ions


(particules chargées électriquement) :
Cations : Na+, Mg+, K+, Ca+, à charges positives
Anions : Cl-, So4--, Co3--, No3-, Po4---, à charges négatives.

L’équilibre de la balance ionique du milieu est essentiel au maintien de la vie cellulaire. Il


conditionne de nombreux phénomènes physiologiques : perméabilité, irritabilité, contractilité,
division cellulaire.

Les sels minéraux peuvent aussi être mobilisés pour former différentes structures ou
sécrétions particulières de la cellule (sels de calcium et de magnésium sécrétés par les cellules
osseuses).

4. Activités cellulaires
L’activité cellulaire consiste essentiellement en un ensemble de transformations moléculaires
et de transferts d’énergie qui constituent le métabolisme de la cellule. Cette activité est
rigoureusement programmée à partir d’une « mémoire » cellulaire, d’une information que la
cellule est capable de stocker, d’utiliser et de transmettre.

4.1. Le métabolisme cellulaire

Les organismes animaux sont hétérotrophes. Ils utilisent les aliments (glucides, protides, et
lipides) du milieu extérieur. Ces aliments pénètrent dans la cellule où ils servent de matériaux
propres à l’édification de molécules nouvelles, et de combustibles permettant la libération de
l’énergie nécessaire au fonctionnement cellulaire.

4.1.1. Catabolisme
Le catabolisme est le métabolisme de dégradation des aliments qui permet la libération
d’énergie (ex : respiration cellulaire). Cette énergie est mise en réserve par phosphorylation
de l’ADP en ATP, puis convertie en travail au niveau des diverses structures cellulaires
(notamment échanges cellulaires, mouvements et métabolisme de synthèse ou anabolisme).

4.1.2. Anabolisme
Des substances nouvelles, nécessaires à la vie de la cellule (ou de l’organisme dans son
ensemble) sont synthétisées en permanence à partir des aliments absorbés. On appelle
anabolisme, ce métabolisme de synthèse qui permet à la cellule non seulement de se
régénérer, mais aussi de croître, de produire et de se multiplier.

4.2. L’information

4.2.1. Acides nucléiques

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1. Généralités sur la cellule

Le support de l’information cellulaire est constitué par le matériel héréditaire, l’ADN.


L’ADN est le point de départ du processus qui aboutit à la synthèse des différentes protéines
cellulaires. Suivant ce processus, l’information stockée dans la structure même de la molécule
d’ADN est transcrite dans la structure d’un ARNm, puis traduite grâce à l’intervention
d’autres types d’ARN (ARNr et ARNt) en une séquence donnée d’acides aminés formant un
polypeptide défini.
L’ADN est capable d’autoduplication, la transmission de l’information d’une génération
cellulaire à l’autre se trouve assurée par ce mécanisme.

4.2.2. Les enzymes

Le métabolisme cellulaire est entièrement contrôlé par le jeu de substances protéiques


(reflétant l’information fondamentale portée par l’ADN), les enzymes.
Les enzymes sont des catalyseurs qui facilitent et accélèrent les différentes réactions
métaboliques, sans participer à ces réactions. Elles agissent à faible concentration en
provoquant une modification du substrat, et se retrouvent inaltérées en fin de réaction.

Une enzyme active ou holoenzyme, peut être constituée par deux éléments :
- apoenzyme, protéine de poids moléculaire élevé impliquée dans la reconnaissance du
substrat et la liaison à ce substrat.
- coenzyme, substance organique de nature non protéique et de faible poids moléculaire, qui
favorise ou est indispensable à l’activité de l’apoenzyme. La coenzyme participe à la réaction
en jouant un rôle de transporteur vis-à-vis du substrat.

Il existe une douzaine de coenzymes possibles, en revanche l’information portée par l’ADN
permet la synthèse de plusieurs centaines d’apoenzymes différentes.

5. Méthodes d´étude de la cellule

5.1. Méthodes morphologiques

5.1.1. Microscopie photonique

Source lumineuse visible : lumière naturelle ou électrique (radiations électromagnétiques


lumineuses)
Longueur d'onde entre 0,4μ (violet) et 0,8μ (rouge)
Pouvoir séparateur : 0,4μ ou mieux 0,2μ
Grossissement courant : 1000 fois, 2500 pour les appareils les plus perfectionnés
fonctionnant aux UV.
On distingue : Microscope à fond clair, microscope à fond noir, microscope à fluorescence,
microscope à contraste de phase, microscope polarisant, microscope interférentiel,
microscope à miroirs..

La microscopie photonique permet d'étudier la cellule vivante traitée ou non par un colorant
vital (rouge, neutre, vert, jaune, iode..). L'observation se fait directement entre lame et lamelle.
On peut pratiquer au cours de l'observation une microdissection à l'aide de
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1. Généralités sur la cellule

micromanipulateurs ou encore filmer les phénomènes qui se déroulent sous le microscope


(microcinématographie de la mitose, des mouvements de cyclose ou encore des contractions
de vacuoles). La microdissection renseigne sur la consistance cellulaire et permet l'ablation
de territoire cellulaire et des greffes de noyaux.

La microscopie photonique permet également l'étude de la cellule tuée et colorée. La


préparation du matériel se fait en deux phases :

- Fixation : c'est le procédé par lequel on tue la cellule tout en gardant sa structure intacte.
Elle consiste à l'immersion pendant un certain temps d'un petit fragment d'organe dans le
fixateur. On distingue des fixateurs physiques (chaleur, froid) et des fixateurs chimiques
(alcool, bichromate de K, sels d'argent, A. osmique..).

- Inclusion : Après la fixation, le fragment d'organe déshydraté est inclus dans de la paraffine
liquide. Après solidification de la paraffine par abaissement de la température, on obtient un
bloc d'inclusion que l'on découpe en coupes minces à l'aide d'un microtome (épaisseur 1 à 7μ).
Ces coupes sont collées sur une lame de verre, déparaffinées, réhydratées, colorées puis
recouvertes de baume du Canada. On les recouvre ensuite d'une lamelle et on les observe au
microscope.

5.1.2. Microscopie électronique

Mise au point pour la première fois en 1931 par De Broglie.


Source: électrons: Particules à charges négatives de longueur d’onde plus petite que celle des
radiations lumineuses. Flux d´électrons émis par la cathode: radiations électroniques.
Pouvoir séparateur 0,4 Å. DDP entre cathode et anode : 100.000V.
Vitesse des électrons = 164.000 Km/s
Grossissement x100.000 à x600.000.
Hauteur : 2m. Poids : 500kg.
Consommation : 2500W

La microscopie électronique ne permet pas l´étude de cellule vivante car les objets examinés
doivent être placés sous vide très élevé (10-5 mm de Hg), nécessaire au déplacement des
électrons.

Les préparations sont faites suivant les mêmes étapes (fixation et inclusion) qu´en
microscopie photonique. Les fixateurs utilisés sont: tétroxyde d´osmium(OsO4), le
formaldéhyde (H-CHO), glutaraldéhyde (CHO(CH2)3-CHO), le permanganate de potassium
(KMnO4).

Après la fixation, l´inclusion se fait dans une résine (épon, araldite, vestopal) ou un plastique
(métacrylate de butyle ou de méthyle). Puis, les blocs sont coupés à l´ultramicrotome (0,03μ)
et recueillis à la surface d´une solution acétonique. Les meilleures coupes de couleur jaune
claire (0,03μ) sont placées sur un tamis de bronze ou de cuivre que l´on dépose sur un
porte-objet. Ce dernier est inséré dans la colonne du M.E. Comme contrastant, on utilise des
sels de plomb, d´uranium ou de tungstène et la structure apparaît en noir sur un fond clair
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1. Généralités sur la cellule

(électron-dense). On observe en définitive la formation de l’image sur un écran de télévision.

Les observations en microscopie électronique peuvent être améliorées par des


techniques particulières comme:

- Ombrage métallique
On fait vaporiser sous vide sur les éléments à étudier (cellule entière, constituants cellulaires,
bactérie ou virus) un métal lourd (or), de la silice ou du carbone. Un effet d´ombrage se crée
en raison du relief des objets (étude du relief et des dimensions des objets).

-Coloration négative (Hall, 1955)


L´objet étudié (en réalité non coloré) est entouré d´un dépôt électron-dense de sel de l´acide
phosphotungstique. Cette suspension est déposée sur une grille recouverte d´un film de
collodion (solution de nitrocellulose dans un mélange d´alcool et d´éther-photographie). En
séchant, le phosphotungstate de Na crée un écran entre les structures qui seules laissent
passer les électrons. On obtient des images en négatif. Cette propriété est utilisée pour
visualiser les structures qui ne sont pas suffisamment denses.

- Cryodécapage (Steere, 1957)

L´objet étudié est congelé rapidement, puis fracturé sous vide par une lame refroidie. La
surface de fracture suit les reliefs membranaires. L´opération se poursuit par la technique de
l´ombrage métallique pour l´étude des reliefs.

- Balayage
La surface de l’objet étudié est métallisée sous vide puis balayée par un faisceau d’électrons.
Seuls les électrons secondaires, réémis par la surface de l’échantillon, sont utilisés pour la
formation de l’image sur un écran de télévision. Avec cette technique on étudie des
échantillons massifs dont la surface est observée en vue tridimensionnelle.

- Coupes épaisses

On étudie des coupes épaisses (plusieurs microns) pour reconstituer la disposition dans
l’espace des différentes structures cellulaires par l’utilisation d’n ME à haute tension (1-3
millions de volts).

5.2. Méthodes cytochimiques, biochimiques et cytophysiques

5.2.1. Coloration et méthodes cytochimiques

Divers colorants sont utilisés pour obtenir des indications sur les substances entrant dans la
composition des structures. Les colorants acides se fixent sur les structures basiques et les
colorants basiques ont une affinité pour les structures à caractère acide.
Les colorants d´oxydo-réduction mettent en évidence les régions oxydantes ou réductrices de
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1. Généralités sur la cellule

la cellule, leur couleur varie selon qu´ils sont réduits ou oxydés.


La coloration permet d’obtenir des indications topographiques.
Les méthodes cytochimiques fondées sur l’utilisation de réactifs spécifiques permettent
d’identifier (ou de doser) les constituants chimiques de la cellule.

5.2.2. Fractionnement par centrifugation

a) Principe de la centrifugation
La technique consiste à séparer les divers constituants de la cellule par centrifugation, afin de les
étudier isolément in vitro (dans un tube à essais). Le tissu à étudier est broyé dans un
homogénéiseur après avoir été mis en suspension dans une solution (de saccharose par exemple).
On obtient une suspension comprenant les particules qui sont séparées par centrifugation
différentielle.

Lorsque l’on centrifuge une suspension, les particules sont soumises à une force centrifuge G,
beaucoup plus élevée que celle due à l’accélération de la pesanteur (g : gravité : 9,81m/s2).

G = ω2 r = (N x 2𝜋/60)2 r

ω est la vitesse angulaire (angle, exprimé en radians parcourus par seconde). Cette vitesse est
égale au nombre de tours effectués par minute (Rpm), N multiplié par 2𝜋/60 ;
r en cm, est la distance entre l’axe et la particule soumise à la centrifugation.
Vitesse de centrifugation en g = 1,118 x 10-5(rpm)2 r = G/g.

On caractérise le comportement d’une particule par sa constante de sédimentation s.


dr 1
s = ----- x ------
dt G

Unité Svedberg (S): Constante de sédimentation est obtenu en tenant compte de la distance de
l’axe de rotation r, de la vitesse angulaire en radians par seconde ω, du temps en secondes t. S
a les dimensions d’un temps variant entre 0,25 x 10-13 et 500 x 10-13 S. Pour cette raison, on
utilise une unité de mesure appropriée, le Svedberg : S = 10-3 secondes. Une constante de
sédimentation de 30 x 10-3 secondes est désignée par 30 S.
S est fonction de la masse moléculaire, de la forme, de la rigidité de la particule, elle n’est
donc pas nécessairement proportionnelle à la masse moléculaire. La valeur de S d’une
particule complexe n’est pas toujours égale à la somme des constantes de sédimentation de
ses constituants.

b) Les différents types de centrifugation

Centrifugation simple

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1. Généralités sur la cellule

Broyage ménagé des cellules qui sont ensuite maintenues dans une solution isotonique: on
obtient ainsi un homogénat. Toutes les opérations se font à basse température (0oC) pour
empêcher d´éventuelles réactions biochimiques au sein du mélange. L´homogénat est centrifugé
une première fois à faible vitesse (700g) pendant un temps très court (10 mn). Le culot contenant
les particules lourdes (noyaux) est séparé du surnageant contenant les particules légères. Le
surnageant subit une nouvelle centrifugation à plus grande vitesse (10.000 g) pendant 10 mn, on
sépare un culot (mitochondries par exemple) du surnageant. Celui-ci est soumis à une nouvelle
centrifugation (100.000g pendant 30 mn) qui permet d’obtenir un dernier culot formé des
particules cellulaires les plus légères.

Centrifugation de zone

C´est un procédé de fractionnement qui utilise du saccharose de telle sorte que la


concentration varie linéairement entre 20% au fond du tube et 5% en haut. On dépose
l’homogénat ou la suspension de particules en couche mince au-dessus du saccharose. Après
centrifugation, les particules se répartissent en fonction de leur constante de sédimentation et
forment des bandes séparées. On identifie les particules d’après leur position tout le long du tube.
On prépare ainsi des fractions relativement pures qui peuvent être observées au microscope
électronique ou analysées par différentes méthodes biochimiques.

Centrifugation à équilibre de densité (isopycnique)

Cette méthode ressemble à la précédente par l’utilisation d’un liquide de support en gradient
de concentration, mais on utilise un liquide de très forte densité : peroxyde d'hydrogène,
communément appelé eau oxygénée ou eau lourde H2O2) ou saccharose très concentré. Les
particules sont fractionnées non pas en fonction de leur constante de sédimentation (comme dans
la centrifugation de zone), mais de leur densité. Il s’agit d’une centrifugation d’équilibre : la
particule se déplace jusqu’à ce qu’elle se trouve dans un liquide de même densité qu’elle-même.
Cette méthode permet de séparer mitochondries et lysosomes.

On peut aussi utiliser comme liquide de support une solution de chlorure de césium (CsCl), de
densité très élevé, dans laquelle on met en suspension ou dissout le mélange à fractionner. Cette
méthode est utilisée pour fractionner et caractériser l’ADN.

Tableau des fractions subcellulaires

Particules Obtention par centrifugation Constituants caractéristiques


Noyaux 10mn 700g ADN, protéines basiques et acides.
ARN, enzymes de synthèse

Lipides, protéines
Mitochondries 10mn 10.000g d'oxydation, ADN, ARN

Peroxysomes Enzymes d'oxydation


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1. Généralités sur la cellule

10mn 10.000g
Lysosomes Enzymes hydrolytiques
Microtubules Tubulines
Microfilaments 60mn 100.000g Actines
Ribosomes Ribonucléoprotéines

Réticulum
endoplasmique 60mn 100.000g Lipoprotéines
Appareil de Golgi Protéoglycanes
Surnageant après
Cytosol
60mn 100.000g Lipides, phospholipides, protéines,
Membranes glucides

5.2.3. Chromatographie

Les méthodes chromatographiques permettent de séparer les différents constituants d’un


mélange, soit pour les isoler soit pour les analyser.

a) Chromatographie sur colonne

Cette méthode permet le dosage des acides aminés d’un mélange. La colonne de verre
est remplie de poudre ou de gel (adsorbant) ou de résines échangeuses d'ions (ex: résine
sulfonique échangeuse de cations): phénol -SO3H-Na+, amine substituée échangeuse d'anions.

On verse le mélange à fractionner dans la colonne. Les substances se fixent sur la


colonne. L'éluant traverse la colonne et décroche successivement les constituants du mélange.
Ceux-ci sont recueillis séparément dans les tubes d'un collecteur de fractions (d'abord les
fractions légères ensuite les fractions lourdes: séparation suivant le poids).

Dans le cas de la chromatographie sur colonne de résines échangeuses d'ions (Moore et


Stein), la séparation se fait suivant le pH isoélectrique des acides aminés (résine échangeuse de
cations: on sépare AA acides, neutres, basiques).

Les AA à pH acide se comportent comme des bases et deviennent des cations (+) qui déplacent
Na+ et restent fixer à la colonne. On fait passer un éluant de pH croissant, au pHi, l'AA se
décroche et traverse la colonne. Etant donné que les AA ont des pHi différents, on peut les
recueillir séparément dans un collecteur de fraction et les caractériser par la réaction à la
ninhydrine à chaud et lecture au spectrophotomètre.

Ninhydrine :
-Coloration violette pour l´ensemble des acides aminés: lecture à 370 nm.
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1. Généralités sur la cellule

-Coloration jaune avec la proline: lecture à 440 nm.

On distingue dans la chromatographie sur colonne:


-Chromatographie d'adsorption : poudres ou gels fixant les composés organiques par
adsorption
-Chromatographie sur résine échangeuse d´ions : des résines permettent de fractionner
un mélange de composés ionisés
-Chromatographie d’affinité : utilisation de poudre inerte pour séparer les constituants
d’un mélange complexe
-Chromatographie par gel filtration : utilisation de dextranes, polymères de glucides

b) Chromatographie sur papier (Martin, Gordon et Synge)

C´est une chromatographie de partition qui repose sur les différences de solubilité
relative des molécules dans un solvant (aqueux ou organique). Elle est utilisée pour la séparation
des oses et celle des acides aminés.

Chromatographie à une dimension (1 seul solvant)

Pour réaliser une chromatographie sur papier, on dépose le mélange en solution sur une ligne sur
une bande de papier spécial. On fait pendre le papier d’une rigole située à l’intérieur d’une
enceinte hermétique. On dépose au fond de l’enceinte un récipient qui contient la phase aqueuse.
On verse la phase organique dans la rigole et on referme l’enceinte. Lorsque le liquide organique
a presque entièrement parcouru la feuille de papier par capillarité, on retire la feuille de papier,
on la fait sécher et on pulvérise un colorant spécifique (AgNO3 pour les oses, ninhydrine à chaud
pour les AA) pour matérialiser les taches. Les substances sont identifiées par la valeur de leur
RF (Retention factor en Anglais, Rapport Frontal en Français) qui est le rapport de la distance
parcourue par le composé (la tache) sur la feuille (X) divisé par la distance parcourue par
l’éluant (le solvant) (Y) (rapport des distances parcourues sur la feuille).
RF du composé A = Xa/Y et RF du composé B = Xb/Y.

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1. Généralités sur la cellule

Figure : Chromatographie sur papier (source : Jacques Kruh (1982). Biochimie : Etudes médicales et
biologiques. Volume 1. Biologie cellulaire et moléculaire. Hermann Editeurs, Paris, France).

Chromatographie à deux dimensions (deux solvants)

Elle est utilisée pour les mélanges complexes. On utilise une feuille carrée, on dépose la
substance en une tache dans un coin de la feuille et on opère comme dans la chromatographie
sur papier à une dimension, mais en deux temps. Le mélange migre dans une première
dimension, on fait alors sécher la feuille puis on la retourne de 90o et on recommence en
utilisant un autre système de solvant. Après avoir fait sécher le papier, on révèle les taches par
un colorant approprié. On identifie les composés en faisant une chromatographie avec des
composés connus.

c) Chromatographie en phase gazeuse

On utilise un gaz inerte (azote, argon ou hélium) entraineur et un liquide stationnaire (silicone,
polyéthylène glycol) qui imprègne une poudre. La colonne de chromatographie est souvent
capillaire (serpentin) et longue de plusieurs mètres. On opère à haute température (160 à 300oC).
Les corps rendus volatils (mélange d´acides gras) sortent d´autant plus lentement de la colonne
qu’ils ont plus de carbone ou de doubles liaisons.

5.2.4. Spectrophotométrie d´absorption (mesure de la densité optique)

Cette méthode permet d´identifier ou de doser (par utilisation de courbe étalon) un composé ou
d´étudier une réaction enzymatique (changement de coloration avant et après). Lorsque l’on fait
passer de la lumière à travers une solution colorée, celle-ci absorbe la couleur complémentaire.
Si on utilise un rayon monochromatique correspondant à cette couleur, il sera absorbé au moins
en partie. Si
Io est l’intensité de la lumière incidente et I l’intensité de la lumière transmise après traversée
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1. Généralités sur la cellule

d’une solution colorée, on a la relation suivante établie par Beer et Lambert : I = Io x 10-∈cl, où
∈ = constante liée à la nature de la substance et à la longueur d´onde, c’est le cœfficient
d´extinction, c : concentration de la substance en solution et l : distance parcourue par la lumière
dans la solution.

On lit directement sur un spectrophotomètre (possibilité de faire varier la longueur d’onde de la


lumière : en nm) la densité optique (E) ou absorbance (A) qui est proportionnelle à la
concentration de la solution :

D.O = E = A = ∈cl = log Io/I.

On indique en indice la longueur d’onde, ex. : A260

Exemples de spectres d’absorption:


- oxyhémoglobine, composé rouge absorbe radiations vertes à 540 et 578 nm
- protéines absorbent UV à 280 nm à cause des AA aromatiques (Tyr, Tryp, Phe, Pro, Hist)
-A. nucléiques absorbent UV à 260 nm.

5.2.5. Electrophorèse (Tiselius, 1937)

C´est la séparation des protéines suivant leur charge électrique et/ou leur poids moléculaire.
Les protéines sont des polyélectrolytes amphotères. Les radicaux NH2 et COOH proximaux
n´entrent pas en ligne de compte car, à l´exception de ceux des acides aminés terminaux, ils sont
engagés dans des liaisons peptidiques (CO-NH). N´interviennent que les groupements distaux
des AA polaires acides (Glu, Asp) et basiques (Lys, Arg, His).

-Dans un milieu basique, la protéine se comporte comme un anion (charge négative), elle migre
vers l´anode chargée positivement.
COO- Carboxyle -->H+ en devenant anion libère un proton et R - CH
NH2 (faible dissociation)

-En milieu acide, la protéine se comporte comme un cation (charge positive) et migrent vers la
cathode chargée négativement.
COOH (faible dissociation)
R - CH
NH3+ amine capte H+ en devenant un cation

- Au point isoélectrique (pHi): les deux dissociations sont égales, on obtient un ion mixte qui ne
migre pas dans un champ électrique car les deux charges sont égales (somme des charges est
nulle). Le pHi des protéines varie entre pHi=1 (pepsine) et pHi=10 (histone). La plupart des
protéines ont un pHi compris entre 4 et 7.

Il existe plusieurs types d´électrophorèse:

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1. Généralités sur la cellule

Electrophorèse sur papier

La solution de protéines est déposée en ligne transversale sur le papier. Celui-ci imprégné de
tampon, plonge dans deux bacs contenant ce tampon à ses deux extrémités. Les électrodes
plongent également dans les bacs. L'ensemble est placé dans une enceinte close avec un
système de réfrigération. A la fin de l'électrophorèse, le papier est séché, les protéines sont fixées
et colorées et on enlève l´excès de colorant.

Figure : Electrophorèse sur papier (source : Jacques Kruh (1982). Biochimie : Etudes médicales et biologiques.
Volume 1. Biologie cellulaire et moléculaire. Hermann Editeurs, Paris, France).

Electrophorèse sur papier des protéines du sérum (5 constituants : bandes)

- Sérumalbumine : la plus abondante et la plus rapide à pH basique (pH 8,6) car c’est la plus
acide, joue un rôle dans le maintien de la pression osmotique et le transport de petites molécules
-Sérumglobulines : classées par mobilité décroissante en ∝1, ∝2, β et γ. Les γ globulines ne
migrent pratiquement pas (immunoglobulines : anticorps).

Albumines (lactalbumine, ovalbumine) et globulines (immunoglobulines : anticorps) sont des


holoprotéines globulaires solubles dans l’eau et/ou dans les solutions salines.

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1. Généralités sur la cellule

Electrofocalisation

C'est une variante d'électrophorèse. On établit un gradient régulier de pH tout le long du support.
Lorsque l'on fait passer le courant, la protéine migre jusqu'à ce qu’elle se trouve dans la zone de
pH correspondant à son point isoélectrique.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS

Elle permet de déterminer le poids moléculaire des sous-unités protéiques. Lors de


l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, la migration des protéines dépend de leur charge, de
leur forme et de leur poids moléculaire. Si on traite les protéines par un détergent dénaturant, le
dodécyl sulfonate de sodium (SDS), les protéines sont dénaturées et elles perdent ainsi leur
configuration spécifique et acquièrent toutes une même charge négative par combinaison au
SDS. La dénaturation s’accompagne d’une dissociation des sous unités qui sont liées par des
liaisons hydrogènes. Si ces sous unités sont soumises à l’électrophorèse en gel de
polyacrylamide, la migration ne sera plus fonction que leur poids moléculaire, elle sera
inversement proportionnelle au logarithme de celui-ci. Si la protéine est formée de plusieurs
sous unités de poids moléculaires différents, on aura plusieurs bandes. On étalonne le gel de
polyacrylamide à l’aide de protéines dont on connaît le poids moléculaire des sous unités.

Exemples de poids moléculaire de protéines :

Protéines Poids moléculaire Nombre de sous unités


Créatine kinase 80.000 2
Galactokinase 100.000 4
Apoferritine 480.000 20
Protéine de virus de poliomyélite 5.500.000 130
Protéine de virus de mosaïque du tabac 40.000.000 2130

5.2.6. Méthodes de détermination du poids moléculaire des protéines

Les méthodes physiques peu précises sont basées sur:


-la pression osmotique
-la constante de diffusion: quantité de protéine qui diffuse par seconde à travers un
cm2 de surface
-la vitesse de sédimentation en unité Svedberg (S)
-la diffusion de la lumière par une solution de protéine (effet Tyndall)

Les méthodes physiques sont approximatives. Elles peuvent être complétées par des
méthodes chimiques (ex. électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS voir au 3.2.5).

On détermine un poids moléculaire minimum PMm. On évalue le % d´un élément ou d´un


acide aminé dans un corps puis, on calcule le PM de ce corps s´il ne contient qu´un atome de
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Cours de Biologie cellulaire 26
1. Généralités sur la cellule

cet élément d´AA.

Ex. Soit une macromolécule contenant X % de carbone. La masse atomique du carbone étant
de 12, le PM minimum du corps sera 100 x 12/X.
Si la macromolécule contient n atomes de carbone, son Pm = PMm =100 x 12/X x n.

Le poids moléculaire s´exprime en daltons (d) ou kd (kilodalton)


d = 1,65 10-24 grammes (soit la masse de l´atome d’hydrogène).

La confrontation des diverses méthodes a permis d´obtenir le poids moléculaire de toutes les
protéines étudiées :
-Insuline: 6000
-Protéines virales: plusieurs millions
-Sérum albumine: 69.000 (0,60% tryptophane: PM=204 pour 2 résidus de
tryptophane).
-Hémoglobine: 66.800 (0.335% fer: 56 pour 4 atomes de fer).

5.2.7. Marquage par radioéléments : Autoradiographie

On met à la disposition de la cellule des précurseurs radioactifs (3H, 14C, 131-125I, 32P, 35S) qui
seront métabolisés. L’autoradiographie permet de localiser les structures sur lesquelles sont
incorporés les précurseurs radioactifs (sites de synthèse) et de suivre par exemple le
déroulement d´un processus métabolique ou les déplacements dans la cellule d´un composé
marqué (isotopes lourds ou stables 15N, 2H, 18O).

5.3. Méthodes physiologiques et expérimentales

5.3.1. Microchirurgie

Un appareillage miniaturisé permet toute une série d’interventions directes sur la cellule. On
opère sous le microscope, sur des cellules d’assez grande taille, par l’intermédiaire d’un
micromanipulateur et d’une micropompe par exemple. Les instruments sont le plus souvent
confectionnés en verre à la microforge : microscalpels, micropipettes qui permettent la
dissection de la cellule, l’ablation ou la greffe d’organites, l’injection de différentes substances.
On étudie ensuite le devenir des cellules ainsi modifiées.

5.3.2. La culture « in vitro »

Mise au point par Harrison et Carrrel vers 1910, cette technique permet d’isoler un tissu vivant
et d’étudier son comportement dans des conditions expérimentales que l’on peut choisir et
modifier à volonté.

Dans la technique dite en « goutte pendante », le fragment de tissu est disposé sur une lame de
verre dans une goutte de solution physiologique nutritive. La lamelle est retournée contre une
lame de verre pourvue d’une cavité. La goutte pend dans cette chambre qui est hermétiquement
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Cours de Biologie cellulaire 27
1. Généralités sur la cellule

close par luttage à la paraffine. Ces opérations sont réalisées dans des conditions de stérilité
absolue. L’ensemble est placé dans un incubateur à 38oC (tissu d’un animal à sang chaud).

Au microscope on peut constater, si le milieu est favorable, la multiplication des cellules, qui
forment un mince feuillet disposé en couronne autour de l’explant. En repiquant la cellule
régulièrement, on peut lui assurer une survie pratiquement illimitée.

D’autres méthodes permettent également de pratiquer des cultures clonales, à partir d’une seule
cellule initiale.

En faisant varier le milieu de culture et en utilisant des techniques de microcinématographie et


de vidéomicroscopie, il est possible d’étudier de nombreux problèmes concernant la nutrition, le
métabolisme des cellules, mouvements cellulaires et leur différenciation. La nature des
relations intercellulaires peut être analysée en associant des souches cellulaires distinctes. Ces
techniques sont aussi appliquées à l’étude in vitro du fonctionnement d’organites cellulaires
isolés.

Les progrès de la microscopie à fluorescence, la synthèse des protéines fluorescentes (ex. GFP :
Green Fluorescent Protein) permettent la visualisation en temps réel du devenir intracellulaire de
protéines marquées (possédant un « tag » en Anglais).

Tous ces phénomènes peuvent être étudiés aussi bien sur des cellules saines que sur des cellules
atypiques (cellules cancéreuses ou encore cellules ayant subi une irradiation par exemple).

5.3.3. Dosages immunologiques (dosage d´anticorps)

a) Dosage radio-immunologique (RIA)

- Antigène en solution saline incubé dans une plaque de microtitration est absorbé en
partie sur la surface plastique et l´antigène libre est éliminé par lavage.
- La plaque est ensuite bloquée par un excès de protéine étrangère pour prévenir toute
fixation non spécifique.
- L´anticorps à doser est ajouté et se fixe à l´antigène
- Les protéines libres sont éliminées par lavage
- L´anticorps est détecté par un ligand radio-marqué. Le ligand libre est éliminé par
lavage et la radioactivité de la plaque est comptée dans un compteur gamma ou un compteur à
scintillation liquide (β). Fixation spécifique 20 à 100 fois supérieure au bruit de fond. Par une
réaction inverse, on peut détecter la présence ou l´absence de l´antigène en utilisant un anticorps
spécifique.

b) Dosage immuno-enzymatique (ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

La plaque d´ELISA est préparée comme pour le RIA jusqu´à l´étape 4. Le ligand est une
molécule couplée à une enzyme telle que la peroxydase. Il se fixe à l´anticorps à doser et après
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Cours de Biologie cellulaire 28
1. Généralités sur la cellule

lavage est révélé par l´addition d´un substrat incolore activé par la portion enzymatique du
ligand pour donner un produit coloré. La quantité d´anticorps est déterminée à partir de la D.O
induite/apparition du produit coloré. Il faut toujours prendre soin de disposer de témoins positifs
et négatifs.

Ex: détection des sporozoïtes dans les moustiques à partir d´anticorps anti P. falciparum (par
RIA ou par ELISA).

5.3.4. Production d´anticorps monoclonaux (biotechnologie, découverte 1975).

Une application des techniques de cultures cellulaires est l’immunisation d’un animal qui permet
la production d’anticorps polyclonaux. L’obtention de cellules hybrides permet la production
d’anticorps monoclonaux. Les anticorps sont utilisés pour la détection de protéines en biochimie
(western blot) et pour leur visualisation dans/à la surface des cellules (immunocytochimie,
cytométrie en flux) ou de tissus (immunohistochimie).

Principe de la production d’anticorps monoclonaux :

-Animaux (souris ou rats) immunisés (par injection) avec l'antigène purifié. La réaction
immunitaire se développe dans l’un des organes lymphoïdes comme la rate.

-Les lymphocytes spléniques (de la rate) sont préparés et fusionnés avec les cellules d'une lignée
de myélome (tumeur de lymphocytes B) par addition de polyéthylène glycol (PEG) qui induit la
fusion membranaire. Seulement une petite portion des cellules fusionne avec succès (5%).

-Le mélange est ensuite mis en culture dans un milieu contenant HAT (Hypoxanthine
Aminopterine Thymidine). C'est un milieu de sélection pour empêcher la croissance des cellules
de myélome après la fusion avec les lymphocytes. Les cellules spléniques peuvent pousser en
milieu HAT mais les cellules de myélome ont un défaut métabolique (manque d'Hypoxanthine
Phosphoriboxyl Transférase HPRT) et ne peuvent utiliser le shunt, de sorte qu'elles meurent en
milieu HAT. La culture développée en milieu HAT, contient les cellules spléniques, les cellules
du myélome et les hybrides (hybridome). Les premières meurent naturellement après une à deux
semaines (milieu de culture pauvre), les secondes sont tuées par le HAT, mais les hybrides
survivent car ils ont l'immortalité des cellules du myélome et le shunt métabolique des cellules
spléniques. Certaines auront également la capacité de produire des anticorps comme les cellules
spléniques.

Tous les puits (de la plaque ELISA) contenant des cellules se multipliant sont testées pour la
production d'anticorps souhaité (par RIA ou par ELISA) et s'ils sont positifs, la culture est clonée
c’est-à-dire répartie dans des plaques de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits
(centrifugation dilution ou support semi-solide, transfert pipette Pasteur). Cela donne un clone
cellulaire provenant d'une seule souche qui est à la fois immortelle et productrice d'anticorps
(monoclonal).

5.4. Méthodologies de base en biologie et génétique moléculaires

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Cours de Biologie cellulaire 29
1. Généralités sur la cellule

Depuis les années 1970, de très nombreuses méthodes ont été développées pour l’analyse des
acides nucléiques présents dans les cellules : extraction, purification, détermination d’une
séquence nucléotidique, synthèse artificielle d’enchaînement de nucléotides (oligonucléotides).
Les outils utilisés sont des enzymes préparées à partir de bactéries ou de virus et dont le nombre
croît de jour en jour. L’informatique et internet sont devenus des outils de travail indispensables
en biologie. Les applications sont très nombreuses ont révolutionné la biologie cellulaire et ont
permis des avancées considérables en pathologie humaine. Elles permettent d’envisager le
traitement de certaines maladies génétiques chez l’homme.

5.4.1. Les outils : Sondes et hybrides

Les sondes (probe en Anglais) sont des fragments d’ADN ou d’ARN dont la séquence est
connue et qui sont utilisés dans la détection spécifique de séquences cibles. Les sondes servent à
identifier des fragments d’ADN ou d’ARN présents parmi des milliers d’autres en
confectionnant des hybrides spécifiques et quantifiables. Le concept de sonde repose sur le
principe selon lequel une séquence donnée de nucléotides s’apparie spécifiquement à la
séquence complémentaire. L’appariement se fait au moyen de liaisons hydrogènes qui peuvent
être rompues par des moyens physiques.

Principales sondes

Les sondes sont de deux types : génomiques (copie d’un gène ou partie non codante du génome)
ou complémentaires d’un ARN messager (ADNc en Français ou cDNA en Anglais).
Les oligonucléotides (fabriquées par synthèse) constituent une troisième catégorie de sonde.

Marquage des sondes

Les sondes ADN sont généralement marquées en incorporant du phosphore radioactif (32P) dans
une séquence nucléotidique.

Le marquage par nick-translation est utilisé lorsque la sonde à marquer est de grande taille. Il
consiste à couper de façon aléatoire les séquences ADN au moyen d’une ADNase, puis à
re-détruire et réparer les séquences détruites en utilisant un dNTP comportant un acide
phosphorique radioactif et une ADN polymérase (action à la fois nucléasique et polymèrasique).

Le marquage par random priming consiste après linéarisation de l’ADN par chauffage, à
re-synthétiser des séquences radioactives au moyen d’amorces fabriquées au hasard et en
nombre suffisant pour que l’on soit sûr qu’il y en ait plusieurs qui s’hybrideront et d’une ADN
polymérase. Le résultat est un dédoublement de l’ADN, alors que pour la nick-translation la
quantité finale n’est pas modifiée par la manipulation.

Hybridation (formation d’un hybride)

Elle est réalisée in vitro dans un tube, sur un fil de nitrocellulose (après transfert ou blot) ou in
vivo dans les cellules et les tissus (hybridation in situ) : c’est le phénomène de reconnaissance de
deux séquences nucléotidiques complémentaires et d’orientation opposée, avec établissement de
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Cours de Biologie cellulaire 30
1. Généralités sur la cellule

liaisons hydrogènes entre les bases complémentaires appariées.

Les hybrides formés entre la séquence d’intérêt et la sonde sont obtenus en faisant appel au
principe de l’appariement des bases homologues. La liaison hydrogène à l’origine de cette
hybridation n’est stable que dans certaines conditions particulières de température et de force
ionique qu’il faut connaître avec précision pour obtenir une liaison spécifique. A forte
température, les deux brins d’une molécule d’ADN se séparent, la température critique sera plus
faible si la force ionique du milieu est plus élevée. On définit ainsi des conditions de stringence
spécifiques d’un hybride. Ces conditions sont très reproductibles, mais souvent étroites. Elles
doivent être déterminées pour chaque type de sonde différente.

Exemple d’application : Emploi de sonde d'ADN pour le diagnostic du paludisme

-Prélèvement de sang sur sujet parasité


-Lyse des cellules sur plaque de microtitrage
-Transférer l'échantillon sur filtre de nitrocellulose à l'aide d'un appareil de microtransfert
(Technique de buvardage ou blotting)
-Incuber pendant 10 minutes dans NaOH, puis 10 minutes dans du tampon à température
ambiante
-Chauffer à l'étuve à 50°C pendant une heure
-Ajouter la sonde d'ADN marquée (32P) pendant au moins quatre heures à 42°C, afin de
l'hybrider avec l'ADN cible, laver puis couvrir avec une plaque d'autoradiographie
-Développer pendant 6 heures en chambre noire.

5.4.2. Enzymes de restriction

Principales enzymes
Elles permettent de couper des séquences d’ADN de manière sélective (enzymes de restriction),
de copier des séquences nucléotidiques (Ex : copier ARN en ADN par transcriptase
inverse/réverse), transcrire une séquence d’ADN en ARN, amplifier une séquence d’ADN
(polymérase) ou coller de séquences nucléotidiques bout à bout (ligases)

Tableau des principales enzymes

Enzymes Nature Utilisation courante


Enzyme de restriction Endonucléase Fractionnement de l’ADN

Transcriptase réverse Transcriptase + ARNase H Banque ADNc

ADN polymérase I Polymérase + exonucléase Synthèse de sondes très chaudes

*Taq polymérase ADN polymérase thermostable Polymerase Chain Reaction PCR

ARN polymérase T7 Polymérase Synthèse d’ARN complet

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1. Généralités sur la cellule

Ligases L ADN ou ARN ligase Liaison entre extrémités 3’ et 5’

S1 nucléase Nucléase des ARN ou ADN Dosage d’ARN messager


monobrin, assez labile

ARNase A ARNase thermo-résistante Digestion des ARN monobrins

*de Thermus aquaticus, le microrganisme dont est extraite la polymérase

Structure des enzymes de restriction


Les enzymes de restriction sont des endonucléases capables de couper des séquences
nucléotidiques à des emplacements reproductibles et définis de façon spécifique en termes de
bases.

Cartes de restriction
Le principe de ces cartes est double : (1) Il faut d’abord fragmenter l’ADN, qui est une énorme
molécule, et il faut que cette fragmentation se fasse à des endroits reproductibles, ce sera le fait
des enzymes de restriction. (2) Il faut ensuite savoir où l’on est. Etant donné qu’on ne peut pas
mesurer la distance séparant le locus d’intérêt du début de la séquence d’ADN, il faut donc
prendre des points de repère, c’est-à-dire des sondes marquées connues, ce qui permettra de se
situer.
La carte de restriction se fait à partir d’une technique d’électrophorèse appelée Southern blot
qui consiste à faire migrer en électrophorèse sur un gel de l’ADN préalablement fragmenté par
l’action d’une ou plusieurs enzymes de restriction. Les produits de cette migration sont
essentiellement séparés d’après leur poids moléculaire, les plus gros restent en haut du gel, les
plus petits migreront plus loin (étalonnage de la courbe par des marqueurs de poids moléculaire
connu comme les ARN ribosomaux). A la fin de la migration, les séquences nucléotidiques sont
transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon à laquelle elles sont attachées de
façon covalente par chauffage. Elles sont ensuite hybridées à la sonde radioactive spécifique.

5.4.3. Amplification enzymatique (Polymerase Chain Reaction : PCR)

L’un des progrès techniques les plus notables de ces dernières années a consisté à utiliser des
amorces (primer en Anglais) et à mettre en pratique le principe de la réplication de l’ADN pour
amplifier artificiellement in vitro des séquences et doser de petits fragments d’ADN. La réaction
se passe dans un appareil appelé thermocycler.

La PCR permet l’amplification exponentielle d’une séquence d’ADN double brin délimitée par
deux amorces (sens : 5’---3’ et antisens : 3’---5’), qui sont des oligonucléotides s’hybridant
chacun avec un des deux brins de l’ADN. Les amorces servent de point de départ à la synthèse
d’une copie d’un gène grâce à une enzyme appelée Taq polymérase qui est une ADN
polymérase thermostable (utilisée à trois températures différentes : 55, 72 et 95oC). La
multiplication des cycles d’amplification permet d’amplifier des quantités infimes d’ADN
jusqu’à ce qu’elles deviennent visibles en UV en électrophorèse.

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Cours de Biologie cellulaire 32
1. Généralités sur la cellule

L’utilisation d’une transcriptase inverse (reverse transcriptase ou RT en Anglais) permet de


copier un brin d’ARN en ADN, sur lequel il est possible de réaliser ensuite la PCR.
L’association des deux opérations constitue la RT-PCR.

La PCR et la RT-PCR sont devenues en quelques années des méthodes de routine tant en
recherche fondamentale que dans le domaine du diagnostic des maladies bactériennes et virales.

Figure : Principe d’une PCR (source : Bernard Swynghedauw (2000). 1er Cycle Biologie et génétique
moléculaires. Aide- mémoire. 2e édition. Dunod. Paris, France).

5.4.4. ARNA interférents

La méthode du « knok out » (KO) permet d’éliminer sélectivement ou d’inactiver un gène donné,
pour étudier son action au cours du développement ou chez l’animal adulte. La méthode du
« knock in » permet de créer des modèles animaux de certaines pathologies humaines.

L’utilisation de fragments de séquences antisens (de type ADN ou ARN) permet de modifier
temporairement l’expression d’un gène, in vitro et in vivo. Des vecteurs permettent l’expression
de petits ARN interférents (siRNA : small interferant RNA) utilisés pour détruire sélectivement

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Cours de Biologie cellulaire 33
1. Généralités sur la cellule

des ARNm ou bloquer leur lecture par le ribosome. Cette méthode est plus facile à mettre en
œuvre et plus rapide que la production d’animaux transgéniques KO.

L’utilisation de séquences nucléotidiques antisens comme médicaments est en cours


d’expérimentation.

5.4.5. Préparation et dosage des transcrits (ARNm : Profil de transcription)

Principes généraux
Le dosage des transcrits permet d’étudier l’expression des gènes et de localiser le niveau de la
régulation en amont de la traduction.
La quantification des ARNm est basée sur les techniques d’hybridation. On peut détecter un
ARNm parmi une multitude d’ARN grâce à des sondes spécifiques, marquées en général
radioactivement (en général séquences poly U ou poly T radioactifs qui s’hybrident avec
l’extrémité 3’ polyadénylée : Poly A de l’ARNm).

Préparation
A cause du fait que l’ARN se dégrade très rapidement après la mort cellulaire (libération
d’ARNases), il faut congeler instantanément les tissus avant d’en extraire l’ARN. Pour
l’extraction de l’ARN, il faut homogénéiser le tissu dans la guanidine pour inactiver les
ARNases, puis extraire les ARN dans le chloroforme/phénol acide pour enlever les protéines et
l’ADN. L’ARN est ensuite précipité par l’alcool et les restants d’ADN sont solubilisés à
concentration élevée de sel. Il y a environ 1 mg d’ARN par g de tissus comme le cœur ou les
vaisseaux.

Dosage des ARNm (Northern blot)


Le Northern blot est une technique similaire au Southern blot sauf que dans ce cas on sépare des
ARNm et on les hybride à des sondes ADN (généralement ADNc). Lorsque les conditions
d’hybridation et de deshybridation sont parfaitement mises au point, on peut se passer de
l’électrophorèse et hybrider directement le mélange d’ARN dans de petits puits circulaires ou
ovoïdes (dot ou slot blot). La mesure est alors remarquablement raide et quantifiable en chiffres
absolus si l’on utilise un étalon sens.

5.4.6. Vecteurs, clonage et techniques d’amplification

Le principe général d’amplification des sondes (pour en obtenir plus) consiste à transférer la
séquence d’intérêt dans un vecteur qui permettra de pénétrer dans les bactéries (ou dans des
cellules ou des organismes entiers) pour s’y multiplier et aussi pour bénéficier de nombreux
avantages de la génétique bactérienne.

Principaux vecteurs

-Plasmides : ADN circulaire extrachromosomique d’origine bactérienne qui se réplique dans les
bactéries indépendamment du fonctionnement bactérien. Taille : 2-5 kb, capacité : 8 kb. Le plus
utilisé est : pBR322.
-Bactériophages ou phages : ce sont des virus de bactéries qui ont la capacité de pénétrer dans
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Cours de Biologie cellulaire 34
1. Généralités sur la cellule

les bactéries, de s’y multiplier et de les détruire en s’y multipliant. Leur capacité de stockage est
plus grande que celle des plasmides. Le plus utilisé est le phage λ.
-Les vecteurs artificiels : comme vecteurs-navettes, cosmides, BAC (bacterial artificial
chromosome). Les YAC (yeast artificial chromosome : chromosome artificiel de levure)
permettent de transporter de très gros fragments d’ADN de 10 à 1.000 Kb.
-Les vecteurs naturels : rétrovirus, adénovirus, liposomes, cellules hépatiques et lymphocytes.

Exemple d’application : Génie génétique

Génie génétique est aussi appelé modification/manipulation/transformation génétique,


ingénierie génétique, transgénèse, technologie d’ADN recombinant.

C'est la formation de nouvelles combinaisons dans le matériel génétique, par insertion de


molécules d'acides nucléiques (isolées du reste de l'organisme) dans un système vectoriel
quelconque permettant l'incorporation dans un hôte capable d´assurer sa propagation continue.

Il comprend 5 étapes principales:


-l'isolement d'une séquence d'acide nucléique, idéalement un gène (par enzyme de restriction)

-l'insertion de ce gène dans un vecteur (plasmide ou phage)

-l'incorporation de ce vecteur dans un hôte (généralement E. coli, mais plus récemment les
cellules eucaryotes et même de mammifères): transfection

-L'hôte ainsi transformé peut assurer la propagation du vecteur à chaque cycle de réplication, et
par conséquent, de la séquence génétique qui y est insérée.
Dans la mesure où une telle séquence est conservée après chaque cycle de réplication, on aboutit
à la formation d'un clone (puisque par ce type de transmission se propage dans une lignée tout
un ensemble de cellules qui sont génétiquement identiques d'une génération à la suivante).
Initialement présente sous la forme d'un seul gène (ou plus exactement d'un petit nombre de
copies), la séquence insérée va ainsi être propagée à un grand nombre d'exemplaires: on dit
qu'elle est amplifiée.

-Dans certains cas, il sera possible de faire traduire (s'exprimer) la séquence génétique insérée et
amplifiée qui sera donc fonctionnelle en dehors de l'organisme dont elle est initialement issue

-Les ensembles géniques insérés dans les clones constituent des banques génomiques ou
banques d'ADNc (ADN complémentaire) (librairies).

Application : Modification génétique des moustiques pour la lutte contre le paludisme et la


dengue

Application: Production d'antigènes d'agents pathogènes pouvant être utilisés dans la production
de vaccins.
Ex: Protéine du circumsporozoite NANP
(Asp-Ala-Asp-Pro) 3 fois ou 40 fois pour la production de vaccin antisporozoite.
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Cours de Biologie cellulaire 35
1. Généralités sur la cellule

5.4.7. Criblage d’une banque d’ADN

Le criblage d’une banque consiste à rechercher le gène d’intérêt dans un des spots. Au début la
technique utilisée (longue et délicate) consistait à hybrider chacun des spots d’ADN avec un
mélange d’ARN messager préparé à partir du tissu dans lequel la protéine d’intérêt était présente.
Les ARNm de chacun des spots étaient alors traduits in vitro et les produits de la traduction
analysés, généralement en électrophorèse à deux dimensions.

Principales techniques utilisées pour le criblage d’une banque d’ADN


- On possède un fragment de la protéine d’intérêt :
a) Fabrication d’un oligonucléotide de synthèse radioactif à partir de la
séquence en acides aminés ;
b) Fabrication d’un anticorps : on utilise des vecteurs d’expression (comme le
phage λgt11) qui vont fabriquer les protéines correspondant aux divers
fragments d’ADN, l’anticorps sera rendu radioactif.

- On ne possède pas la protéine d’intérêt :


a) Hybridation des spots ADN obtenus au moyen d’une purée d’ARNm
contenant au moins le messager d’intérêt, après lavage chaque spot va retenir
son messager spécifique qu’il conviendra ensuite de traduire in vitro ;
b) Banque différentielles : l’ADNc préparé à partir des ARNm d’un tissu A est
hybridé avec l’ARNm d’un tissu B, ce qui reste représentera le ou les gènes
exprimés dans A et pas dans B.

5.4.8. Séquençage des nucléotides

Le séquençage d’un fragment d’ADN ou d’ARN est actuellement facile, rapide et se fait en
pratique de façon automatique (avec des séquenceurs). Il est beaucoup plus facile que le
séquençage d’une protéine, ce qui fait que l’on a souvent eu la séquence d’un gène (ou au moins
de sa partie codante), bien avant celle de la protéine (cas de la myosine par exemple).

Exemple : Séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode chimique de Maxam et Gilbert.

Cette méthode consiste à détruire chimiquement une base G ou A par exemple. Comme le
rendement de la réaction est extrêmement faible la coupure n’a lieu qu’une seule fois en un
endroit donné en moyenne. Comme par ailleurs, on utilise beaucoup de copies, on aura des
fragments en moyenne en quantités égales. Il ne restera plus qu’à marquer l’extrémité 5’ du
fragment qui est phosphorylée par définition pour pouvoir aligner les fragments et avoir de facto
l’échelle des bases et la séquence.
Il existe d’autres techniques dont une nécessite le clonage préalable du fragment dans un vecteur.
Plusieurs appareils de séquençage automatique existent dont certains utilisent des marqueurs non
radioactifs et ne demandent pas de clonage préalable.
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1. Généralités sur la cellule

Figure : Séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode chimique de Maxam et Gilbert (source : Bernard
Swynghedauw (2000). 1er Cycle Biologie et génétique moléculaires. Aide- mémoire. 2e édition. Dunod. Paris,
France).

5.5. Génomique et bioinformatique

5.5.1. Génomique

Définition : Le terme “génomique” a été créé, en 1986 par Thomas Roderick pour désigner la
discipline scientifique centrée sur la cartographie, le séquençage de l’ADN et l’analyse des
génomes (pour l’identification des gènes).

Cette discipline a rapidement évolué pour couvrir trois domaines:


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Cours de Biologie cellulaire 37
1. Généralités sur la cellule

- Génomique structurale
- Génomique fonctionnelle
- Génomique comparative

Génomique structurale
Elle représente la phase initiale de l’analyse du génome et a pour but la construction de cartes
génétique, physique et transcriptionnelle de haute résolution d’un organisme
La séquence d’ADN complète représente l’ultime carte physique d’un organisme

Les étapes du séquençage :


- Construction d'une banque d'ADN
- Cartographie du génome
- Acquisition de la séquence (séquençage)
- Assemblage et finition de la séquence
- Annotation de la séquence

Les stratégies de séquençage :


Séquençage direct d’une banque de génome complet :
- Construction de la banque génomique et séquençage des fragments
- Assemblage des fragments séquencés

Etablissement de carte physique:


- Regrouper en les ordonnant un ensemble de fragments d’ADN chevauchants
provenant d’une banque génomique ou chromosomique à partir de repères spécifiques
(sequence-tagged sites: STS): cartes de restriction à faible ou haute résolution

Séquençage des ADN complémentaires (ADNc) correspondant aux ARN messagers


(ARNm) exprimés dans différents tissus (“gènes exprimés”):
- Séquences obtenues sont des EST: Expressed Sequenced Tags
- Identification de gènes spécifiquement exprimés dans les maladies génétiques ou
dans les tissus spécialisés

5.5.2. Bioinformatique

La bioinformatique est la science qui utilise la technologie de l’information pour assembler et


gérer les données provenant de l’analyse génomique en vue de mieux comprendre la biologie.
La bioinformatique est un sous-ensemble du vaste domaine de la biologie assistée par
ordinateur, qui est une application de techniques analytiques quantitatives pour la
modélisation des systèmes biologiques.

Analyse bioinformatique des génomes

• Génomique structurale est caractérisée par la gestion des données:


o Séquences nucléotidiques sont déposées dans des banques de données
accessibles par internet (EMBL en Europe, GenBank aux USA, DDBJ au
Japon)
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Cours de Biologie cellulaire 38
1. Généralités sur la cellule

o Séquences protéiniques (SwissProt)


o La génomique fonctionnelle est caractérisée par l'exploitation des données
pour rechercher une information d'un intérêt particulier
• Etude des génomes en tant que réservoirs d’information destinés à être lus (phases
codantes) ou à jouer un rôle structural
• Analyse de la syntaxe des séquences (comprendre la signification et les lois des
séquences)
• Comparaison des informations contenues dans différents génomes
• Génomique fonctionnelle qui cherche à comprendre les fonctions des gènes de façon à
réduire le fossé entre séquence et fonction et générer de nouvelles connaissances sur
le comportement des systèmes biologiques
• Reconnaissance de gènes et autres éléments du génome par des logiciels adaptés:
- L’identification des séquences d’ADN codant potentiellement des protéines est
simple chez les micro-organismes dont peu de gènes contiennent des introns
- Pour les génomes des eucaryotes supérieurs la présence d’introns rend la
reconnaissance des gènes beaucoup plus difficiles
- L’identification des séquences d’ADN codant des ARNr et ARNt est facilitée par la
grande conservation de ces séquences au cours de l’évolution
• Syntaxe des séquences à l’aide de méthodes statistiques complexes:
- L’analyse de la syntaxe des séquences vise à décripter leurs caractéristiques
(distribution des motifs nucléotidiques: normales, sur-représentés, sous-représentés)
-Recherche de variations dans la proportion relative des paires de bases G:C et A:T

Recherche de similarités

• Entre la séquence d’un génome nouvellement obtenue et l’ensemble des séquences


déjà répertoriées, présentes dans les banques de données
• Comparer la totalité des gènes d’un génome à ceux d’un autre génome pour faire un
bilan comparatif de deux espèces
• Principe général des différents programmes utilisés consiste à aligner une
séquence-test avec chacune des séquences présentes dans la banque de données
considérée, puis à fournir le résultat sous forme d’une série d’alignements de paires de
séquences présentant les meilleurs scores
• Critères: vitesse d’exécution, la sensibilité pour détecter des ressemblances même
éloignées et la sélectivité pour ne retenir que les résultats significatifs
• Programmes les plus courants: FASTA et BLAST. FASTA pour des protéines se
ressemblant même modérément sur toute leur longueur et BLAST pour trouver des
segments similaires même dans des protéines éloignées

D’autres programmes permettent de rechercher des sites de coupure de séquences nucléotidiques


par des enzymes de restriction, de choisir des amorces de PCR, de simuler des expérimentations
de PCR..

5.5.3. Exemples de génomes


Prof. Yeya T. Touré, FMOS, USTTB, Bamako, Mali
Cours de Biologie cellulaire 39
1. Généralités sur la cellule

1. Génome humain. Science et Nature, 2001.

Size (bp) 3.223.443.491


G+C content (%) 46
No. of genes 23.758
Percent coding genes (%) 1,1-1,4
Average gene size (bp) 1000
Genes of unknown function (%) 42
Chromosomes (n) 24

2. Génome de Plasmodium falciparum (parasite responsable du paludisme) : Nature, 2002.

Size (bp) 25.000.000


G+C content (%) 19,4
No. of genes 5.268
Percent coding genes (%) 52,6
Average gene size (bp) 2.283
Genes of unknown function (%) 60
Chromosomes (n) 14 (0,6-3,4 Mb)
Mitochondrial genome (kb) 6
Apicoplast circular DNA (kb) 35

3. Génome d’Anopheles gambiae (moustique vecteur du paludisme) : Science, 2002.


VectorBase Release VB-2013-12.

Size (bp) 278.253.050


G+C content (%) 35,2
No. of genes 13.465
Coding genes 12.810
Average gene size (bp) 4.542
Genes of unknown function (%) 40,4
Chromosomes (n) 3 (24,9-64,5 Mbp)

Prof. Yeya T. Touré, FMOS, USTTB, Bamako, Mali


Cours de Biologie cellulaire 40
1. Généralités sur la cellule

Bibliographie

1. Claude-Louis Gallien (1983). Biologie : 1. Biologie cellulaire. Biomed. Presses


Universitaires de France (PUF). Paris, France.
2. Marc Maillet (1995). Biologie cellulaire. 7e édition. Abrégés. Masson. Paris, France.
3. Bernard Swynghedauw (2000). 1er Cycle Biologie et génétique moléculaires. Aide-
mémoire. 2e édition. Dunod. Paris, France.
4. Alain Bernot (2000). L’analyse des génomes : Cartographie, séquençage,
identification des gènes. Masson Sciences. Dunod. Paris, France.
5. Pierre Cau et Raymond Seïte (2012). Cours de biologie cellulaire. UE2. 5e édition.
Collection PACES. Ellipses. Paris, France.
6. Jacques Kruh (1982). Biochimie : Etudes médicales et biologiques. Volume 1.
Biologie cellulaire et moléculaire. Hermann Editeurs, Paris, France.

Prof. Yeya T. Touré, FMOS, USTTB, Bamako, Mali