Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
AZIZI
Figure3: Les pentoses qui rentrent dans la composition des acides nucléiques
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
Figure4: nucléoside
Figure5: Structure de la double hélice d'ADN (forme B). Le squelette de chaque brin est
formé de sucre et de phosphate. Les bases azotées sont projetées vers l'intérieur de la
molécule mais restent accessibles au solvant par les deux sillons (petit et grand sillon).
Figure 7:Structure général d'un gene eucaryote. (CRE [Cyclic AMP Responsive Element], TRE
[12-O-Tetradacanoylphorbol 13-acetate Responsive Element]: des éléments de réponse).
Figure 13: Terminaison de la transcription chez les bactéries par le facteur Rho
Fig.16: ARNm eucaryote mature prêt à être traduit. Coiffe ajoutée, La queue polyA ajoutée et
introns éliminés
.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
Chapitre 2: La Traduction
La traduction est parmi les événements les plus conservés chez tous les organismes, et les plus
coûteuses en énergie. Dans des bactéries en croissance rapide, jusqu'à 80% de l'énergie
cellulaire et 50% du poids sec de la cellule sont consacrés à la synthèse des protéines. En effet,
la synthèse d'une protéine nécessite environ 100 protéines et ARN.
Quatre composants principaux sont impliqués dans la traduction:
ARNm: Cette macromolécule fournit l'information qui doit être interprétée par la machinerie de
la traduction et constitue la matrice pour la traduction.
ARNt: Ils fournissent l'interface entre les acides aminés ajoutés à la chaine peptidique en
croissance et les codons d'ARNm.
Aminoacyl-ARNt synthétase: Ces enzymes couples des acides aminés avec des ARNt
spécifiques qui reconnaissent le codon approprié.
Ribosomes:Le ribosome coordonne la reconnaissance de l'ARNm par chaque ARNt et catalyse
la formation de la liaison peptidique entre la chaîne polypeptidique en croissance et l'acide
aminé chargé sur l'ARNt sélectionné.
2. Code génétique
Le code génétique établit une correspondance entre la matrice d'acides nucléiques et le
polypeptide produit (Un Aa correspond à un codon). Le code génétique est écris en ARNm
plutôt qu'avec l'ADN. L'aspect le plus intéressant du code génétique est que certains acides
aminés sont codés par plusieurs codons apparentés mais différents. Parmi un total de 64 codons,
4 sont dédiés à l'initiation et à l'arrêt de la traduction (tab. 1).
4. Ribosomes
Une cellule en phase active de croissance possède des milliers de ribosomes. Ce sont les sites de
synthèse protéique. Chaque ribosome est composé de deux sous unités 30S (unité Svedberg:
unité de coefficient de sédimentation) et 50S, l'ensemble donne des ribosomes 70S. La
machinerie de polymérisation des acides aminés est composée d'au moins 3 ARN et 50
protéines différentes. Les ARNm procaryotes possèdent un site de liaison au ribosome (RBS)
appelé séquence de Shine Dalgarno (S/D). Cet élément typiquement localisé 3 à 9 nucléotides
en amont du codon d'initiation, il s'apparie avec la séquence complémentaire localisée sur
l'ARNr 16S (fig.1).
Fig.1: Structure d'un ARNm procaryote polycistronique. Chaque site de liaison au ribosome est
indiqué RBS (Ribosome Binding Site).
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
La grande sous-unité contient le centre peptidyl-transférase qui est responsable de la formation
des liaisons peptidiques. La petite s/u contient le centre de décodage dans lequel les ARNt
chargés lisent ou décodent les codons de l'ARNm.
6.1. Initiation de la traduction: Pour que la traduction soit initiée avec succès,
trois événements doivent se produire:
- Le ribosome doit être recruté sur l'ARNm
- Un ARNt initiateur chargé par N-formyl-Met doit s'insérer dans le site P du ribosome
- Le ribosome doit être positionné de manière précise sur le codon d'initiation.
Chez les procaryotes trois facteurs d'initiation dirigent l'assemblage d'un complexe d'initiation.
1- Facteur d'initiation 3 : IF-3 se lie à la petite sous-unité et l'empêche de s'associer avec
la grande sous-unité libre, et favorise la liaison correcte de l'ARNm.
2- Facteur d'initiation 2 : IF-2 c'est une protéine liant et hydrolysant la GTP (GTPase), il
lie le GTP au fMet-ARNt initiateur pour faciliter sa liaison à la sous unité 30S et
empêche la fixation de d'autre ARNt chargé.
3- - Facteur d'initiation 1: IF-1 c'est un facteur semble nécessaire à la libération du IF-2
et du GDP. Il empêche la fixation d'ARNt sur la partie de la petite sous-unité qui fera
partie du site A. IF-1 peut aussi faciliter l'assemblage des deux sous-unités.
Chacun des facteurs d'initiation se lie sur, ou à proximité, d'un des trois sites de liaison de
l'ARNt sur la s/u 30S. En accord avec son rôle de bloquer de l'accès d'ARNt chargé au site A,
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
IF-1 se lie directement à la zone de la petite sous-unité qui fera partie du site A. IF-2 se lie à IF-
1 et s'étend jusqu'au site P où il prend contacte avec le fMet-ARNtifMET. Enfin, IF-3 occupe la
zone de la s/u qui fera partie du site E. Ainsi, des trois sites de liaison d'ARNt potentiels sur la
petite s/u, seul le site P est disponible pour lier un ARNt en présence des facteurs d'initiation.
L'appariement de bases entre le fMet-ARNt et l'ARNm permet de positionner le codon
d'initiation au niveau du site P.
Quand le codon d'initiation et le fMet-ARNt s'apparient, la s/u 30S subit un changement de
conformation. Cette modification entraîne la libération de IF-3, en absence de cet facteur la
grande s/u peut se lier à la petite. Cette liaison stimule l'activité GTPase d'IF-2-GTP provoquant
l'hydrolyse du GTP et la libération d'IF-2-GDP à cause de la réduction de l'affinité au ribosome
et fMet-ARNtifMet.
Le résultat de l'initiation est la formation d'un ribosome complet (70S) un niveau du site
d'initiation de l'ARNm, avec le fMet-ARNtifMet occupant le site P, et un site A libre.
Les aminoglycosides comme la streptomycine sont des antibiotiques largement utilisés contre
les infections bactériennes comme la tuberculose. Ces antibiotiques inhibent la formation du
complexe d'initiation 70S en bloquant l'assemblage des deux sous unités.
6.2. Élongation: Une fois le ribosome 70S assemblé, avec l'ARNt initiateur chargé
au site P, la synthèse de polypeptide peut commencer. Trois événements clés
doivent se produire pour l'addition correcte des acides aminés.
1- La liaison de l'Aa-ARNt au niveau du site A en concordance avec le codon qui est exposé.
2- La réaction de transpeptidation.
3- La translocation vers le site P.
Après la translocation, le ribosome est prêt pour un autre cycle de polymérisation. Deux
protéines auxiliaires (facteurs d'élongation) contrôlent ces événements. Les deux facteurs
utilisent la GTP comme source d'énergie pour accroître la vitesse et la précision du
fonctionnement du ribosome. L'aminoacyl-ARNt est ramené au site A par le facteur
d'élongation EF-Tu, ce facteur est lié à une GTP. L’activité GTPase est activée juste après
l'établissement d'un appariement codon-anticodon correcte, et le EF-Tu-GDP sera libéré et
converti en EF-Tu-GTP de nouveau par l'intermédiaire d'un deuxième facteur d'élongation
appelé EF-Ts.
Après la réaction peptidyl-transférase, l'ARNt du site P est désacylé est l'acide aminé se lie à
l'ARNt chargé du site A. Au cours de cette réaction, le groupe α-aminé de l'acide aminé au site
A réalise une attaque nucléophilique du groupe α-carboxyle de l'acide aminé lié à l'ARNt du site
P (Position C-terminale). L'ARNr 23 S est le composant majeur de la peptidyl transférase, il
n'ya pas des protéines dans la région du site actif. Une adénine spécifique semble participer à la
catalyse de la formation de la liaison peptidique.
Le chloramphénicol c'est un antibiotique inhibant la synthèse des protéines chez les bactéries. Il
empêche le positionnement correcte de l'Amino-acyl-ARNt dans le site A pour la réaction
peptidyl transférase dans la grande sous-unité.
Pour qu'une nouvelle élongation puisse se produire l'ARNt du site P doit se déplacer vers le site
E et l'ARNt du site A doit ce déplacé au site P. En même temps l'ARNm doit se déplacer de
trois nucléotides pour présenter le codon suivant. Cette phase finale d'élongation nécessitel’EF-
G ou translocase et l'hydrolyse de GTP.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
7. Traduction chez les eucaryotes: Comme chez les procaryotes on distingue trois
étapes dans la synthèse protéique chez les eucaryotes (initiation, élongation et
terminaison).
7.1. Initiation: L'initiation est similaire à celle chez les procaryotes par plusieurs
aspects. Les deux utilisent un codon d'initiation et un ARNt initiateur, et les deux
font appel à des facteurs d'initiation pour former un complexe avec la petite s/u
ribosomique qui lie l'ARNm avant l'ajout de la grande s/u. Néanmoins, les
eucaryotes utilisent une méthode complètement différente pour reconnaître
l'ARNm et le codon d'initiation.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
Chez les eucaryotes, la petite s/u est déjà associée avec un ARNt initiateur. Au contraire des
procaryotes la liaison de l'ARNt initiateur (chargé par une méthionine non modifié) à la s/u 40S
précède toujours l'association avec l'ARNm. La reconnaissance de l'ARNm fait appel à
plusieurs facteurs auxiliaires. Le ribosome recruté au niveau de la coiffe 5' de l'ARNm scanne
l'ARNm dans le sens 5' jusqu'à atteindre la séquence de Kozak 5'CCAUGG3', cette séquence
permet de connaître le codon d'initiation (AUG). Enfin, la grande s/u du ribosome est recruté
Après l'appariement de bases de l'ARNt initiateur avec le codon d'initiation. A la fin d'un cycle
de traduction, le ribosome eucaryote se dissocie en ses sous-unités constitutives
7.2. Élongation
Une fois la le ribosome assemblé, avec l'ARNt initiateur chargé au site P, la synthèse du
polypeptide peut commencer.
7.3. Terminaison de la traduction
Tous comme l'initiation et l'élongation, la terminaison de la traduction est contrôlée par une
série d'attachement-relâchement de facteurs dans un ordre précis.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
Introduction : L’expression d’un gène est une suite de réactions chimiques aboutissant à la
production d’un acide ribonucléique ou d’une protéine.
• Dans un premier temps, la séquence de l’acide ribonucléique; ARNm est identique à celle du
brin sens de l'ADN et orientée dans le même sens. Elle se construit de 5’ vers 3’ en
complémentarité de celle qui est « lue » sur le brin anti sens.
• Après des réactions de maturation le transcrit primaire ARN devient ARN messager mature et
sort du noyau vers le cytoplasme, chez les eucaryotes.
• Dans le second temps, l'ARNm est « lu » par groupe de trois nucléotides (lettres) grâce à un
RNA complémentaire qui porte l’acide aminé correspondant (ARNt).
• Après des réactions de maturation, la protéine « mature » est prête à remplir sa fonction dans
la cellule. La régulation de toute voie métabolique se fait principalement à la première réaction
pour ne pas synthétiser d’intermédiaires inutiles.
1. lors de la transcription
3. lors de la traduction
Figure 01: Les différents niveaux de la régulation de l'expression génétique [I: Absence de
contrôle, II: Contrôle de l'activité enzymatique (post traductionnel). III: Contrôle traductionnel
(pas de synthèse de l'enzyme). IV: Contrôle transcriptionnelle
La spécialisation phénotypique de nos quelques 10 000 milliards de cellules est en partie due à
la transcription d’un répertoire de gènes particulier à chaque type cellulaire. C’est la régulation
de ce transcriptome qui permet à une cellule d’adapter son comportement de manière appropriée
à un stimulus, stress, électrique dans le cas d’un neurone, hormonal ou environnemental
À chaque étape de sa vie (croissance, différenciation ou réponse à des stimuli), une cellule doit
réguler de façon précise l'expression de son information génétique.
La régulation de l'expression génétique c'est un processus d'intérêt majeur pour toutes les
cellules, elle permet d'économiser l'énergie et les ressources. Il y a deux modes majeurs de
régulation dans les cellules:
2- Le contrôle de l'activité enzymatique qui peut être directement modifiée par des
modifications covalentes et conformationnelles, ou par des modifications non covalentes en
modulant l'affinité des enzymes au substrat par des molécules ou sous-unités protéiques
régulatrices.
1-1- Retro-inhibition (Feed Back or end-product inhibition): Avant de parler sur la rétro-
inhibition on doit savoir la notion des termes suivant:
- Enzyme allostérique: Une enzyme qui possède deux sites de fixation, le site actif (sur
lequel se fixe le substrat) et le site allostérique ou modulateur (sur lequel se fixe l'effecteur).
- Allostérie: C'est un mécanisme d'inhibition enzymatique par un effecteur allostérique,
lorsque l'effecteur se fixe de façon non-covalente au niveau du site allostérique, la
conformation spatiale de l'enzyme est modifiée et le substrat ne plus se fixer au site actif. La
rétro-inhibition c'est un mécanisme majeur du contrôle de l'activité enzymatique. Elle assure
essentiellement la régulation des voies de biosynthèse complètes. Comme la synthèse des
acides aminés et les nucleotides.
- Phosphorylation (Ser, Thr, ou Tyr: important dans la transduction de signaux à travers les
membranes.
- L'élimination du f-mét ou méthionine par une enzyme spécifique (Met-aminopeptidase) se
fait chez plus de 50% des protéines des deux types de cellules. Le N-formyl de la première
méthionine est enlevé chez E. coli par une deformylase.
- Clivage de chaine polypeptidique (Ex. L'insuline)
- Glycosylation
- Addition des lipides
- Formation des ponts disulfures ou pont covalents (élastine, collagène).
- Acétylation (≈ 100 protéines cytoplasmique ont un N-terminal acétylé), la réaction est
catalysée par N-α- acétyle transférase (exemple: acétylation des histones).
- Hydroxylation (hydroxylation des prolines et lysine)
- Biotinylation: Addition de la biotine [vit B8] (coenzyme d'enzymes de carboxylation).
- Élimination des séquences surnuméraires au niveau protéique, ce processus est appelé
l'épissage protéique
Les gènes de l'opéron lac ont un fort niveau d'expression seulement en présence du lactose, et
en absence du glucose. Deux protéines régulatrices sont impliquées:
- Un activateur appelé CAP (Catabolite Activator Protein). Le gène codant CAP au contraire du
ce codant le répresseur est localisé sur un autre endroit sur le chromosome. Il se fixe sur le site
CAP.
- Le répresseur lac (codé par le gène lac I), il se fixe sur l'opérateur.
Chacune de ces protéines régulatrices répond à un signal de l'environnement et le communique
aux gènes lac. Le CAP transmet le signal de glucose, alors que le répresseur transmet le signal
du lactose.
Le blocage de l'expression de l'opéron lactose en présence du glucose ou autre source d'énergie
et de carbone facilement assimilable que le lactose est appelé la répression catabolique.
L'opéron lac ne possède pas un promoteur fort (faible séquences consensus surtout la région -
35) pour cette raison la fixation de l'ARN polymérase doivent être stimulée par une protéine
d'activation spécifique (contrôle positif), appelé protéine réceptrice d'AMPc (CRP) ou protéine
activatrice du catabolisme (CAP).
En absence du glucose, les niveaux d'AMPc (synthétisée à partir de l'ATP par l'adénylate
cyclase) augmentent, aboutissant à la fixation de la CRP à l'AMPc. Le complexe CRP-AMPc se
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
fixe sur le site CAP. L'ADN subit alors une inclinaison de 90°, qui stimule la fixation des
éléments trans de l'ARN polymérase aux éléments cis du promoteur pour augmenter le taux de
la transcription de 50 fois.
En absence du glucose et la présence du lactose, l'allolactose(β-D-galactopyranosyl–(1-6)- β-
glucopyranose), une molécule inductrice synthétisée à partir du lactose (β, 1-4) par un réaction
de transglycosylation se fixe sur le répresseur et l'inactive de sorte qu'il ne puisse plus se fixer à
la séquence de l'opérateur. L'ARN polymérase activée par le complexe CRP-AMPc peut initier
la synthèse de l'ARN avec un taux de transcription élevé.
2.2 Contrôle positif de la transcription: Dans ce type de contrôle, une protéine régulatrice
active la fixation de l'ARN polymérase d'où le terme positif. Un excellent exemple de ce type de
contrôle est l'opéron mal EFG (l'opéron du catabolisme du maltose) chez E. coli.
2-2-1- Régulation de l'expression de l'opéron malEFG
En absence d'inducteur, ni la protéine activatrice, ni l'ARN polymérase ne peuvent se lier à
l'ADN. La liaison d'une molécule inductrice dans ce cas là c'est le maltose à la protéine
activatrice provoque un changement de sa conformation (protéine allostérique), à son tour, se lie
au site de fixation de l'activateur. Ceci permet à l'ARN polymérase de ce fixer sur le promoteur
et commencer la transcription.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
Une séquence leader de 161 nucléotides localisés en amont du premier codon du gène trpE, elle
contient 4 régions (1, 2, 3, et 4) (fig.4). Cette séquence contient aussi deux codons pour le trp,
alors s'il ya manque de tryptophane la synthèse du peptide leader sera incomplet à cause du
manque des ARNt chargés par le Trp.
Si le trp est abondant, le ribosome traduira la séquence leader jusqu'au codon stop, le reste de
l'ARNm leader forme une structure secondaire entre les régions 3 et 4 suivi par une séquence
riche en uracile qui provoque finalement la terminaison.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
Si le trp est absent ou en faible quantité, la synthèse du peptide leader sera incomplet. Le
blocage du ribosome permet la formation d'une autre structure secondaire qui empêche la
formation du signal de terminaison. Ceci permet à l'ARN polymérase de transcrire tous les
gènes de structure.
La régulation par atténuation est observée aussi pour au moins six opérons qui codent pour la
biosynthèse des acides aminés par exemple: Thr, His, et le Phe. Les peptides leader des opérons
de synthèses des ces acides aminés contiennent dans leur séquences plusieurs monomères de
l'acide aminé concerné (8 Thr, 7 His, 7 Phe).
Génie génétique
Introduction
La génie génétique est principalement basée sur le clonage moléculaire qui permet la
recombinaison d'un fragment double brin d'ADN avec un vecteur et son introduction dans une
cellule hôte approprié.
Cette technologie a d’abord concerné les organismes les plus simples qui ont souvent des
génomes de petite taille comme les bactéries (E. coli, B. subtilus, Agrobacterium
tumefaciens…etc.), et les levures (S. cerivisae). Ce n'est que plus tard que la transgénèse stable
des cellules végétales et animales. Actuellement les OGM (végétaux, animaux transgéniques)
sont nombreux.
Le premier apport de cette technologie à la médecine fut de rendre des protéines thérapeutiques
telle: insuline, HGH (human growth hormone), disponibles en quantités suffisantes. La
médecine a retiré bien d'autres bénéfices de la technologie de l'ADN recombinant, vaccins (anti
hépatite, rage, …etc.), sondes (diagnostique, identification …etc.), agents thérapeutiques
(acides nucléiques anti sens, thérapie génique, …etc.).
Les différentes étapes successives à entreprendre en génie génétique sont les suivants:
1.Outils enzymatiques
1.1.Les enzymes de coupures: Nucléases: On distingue deux types de nucléases :
- Les Exonucléases: qui dégradent la séquence en détachant les nucléotides à partir d'une
extrémité. Les plus utilisées sont :
les Exonucléase III : attaque en 3', activité 3' phosphorylase, permet la formation d'ADN
simple brin et les délétions.
Nucléase Bal31 : attaque en 3' ou 5', donne des bouts franchement découpés, permet les
délétions.
- Les Endonucléases de restriction: qui coupent à l'intérieur de la séquence nucléotidique. Ces
endonucléases ne peuvent attaquer que les séquences d'ADN double brin. Il existe trois types
d'enzymes de restriction :
Type I : assurent la restriction, la méthylation, et coupent assez loin de la séquence
reconnue.
Type II : assurent la restriction, la méthylation, et coupent dans le site de
reconnaissance.
Type III : assurent la restriction, la méthylation, et coupent entre deux séquences
reconnues.
- Nomenclature des enzymes de restriction: Les trois premières lettres de chacune d’entre
elle concernent:
La première lettre du nom en majuscule du genre, par exemple E (Escherichia)
Les deux premières lettres en miniscule du nom de l’espèce, par exemple co (coli).
La quatrième concerne la souche bactérienne d’où est extraite l’enzyme en question.
Le chiffre romain: indique l’ordre de la caractérisation de l’enzyme chez la même
souche.(HindIII) signifie que la troisième (III) Enzyme de restriction isolée et caractérisée de la
souche bactérienne Haemophilus influenza Rd.
- Classification des enzymes de restriction: Les enzymes sont souvent des protéines
présentant des propriétés de catalyse spécifique d’une réaction chimique. Elles sont réparties
en 6 classes :
E.C. 1 Oxydoréductases: catalysent les réactions redox.
E.C. 2 Transférases: transfèrent d'un groupement fonctionnel.
E.C. 3 Hydrolases: catalysent l'hydrolyse de différentes liaisons.
E.C. 4 Lyases: Coupe des liaisons variées sans réaction d’hydrolyse ou de redox
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
E.C. 5 Isomérases: isomérisation au niveau de la même molécule
E.C. 6 Ligases: joins deux molécules par une liaison covalente.
- Les ARN polymerases: ont besoin d'un promoteur spécifique pour transcrire l'ADN en ARN. On les
utilise pour transcrire des ADN, pour les traduire, ou pour réaliser des sondes.
1.3.Les enzymes de Ligations: Les ligases catalysent la formation d'une liaison phosphodiester
entre une extrémité 3'-OH et 5'-P. On utilise principalement :
- ADN ligase d'E. Coli : lie les bouts collants. NAD comme cofacteur.
- ADN ligase du phage T4 : lie les bouts collants et les bouts francs. ATP comme cofacteur.
1.2.Les Hotes de clonage: destinée à recevoir l'ADN recombinant. Elle doit répondre à
certaines critères :
- Elle n'est pas pathogène pour l’homme et ne fassent pas apparaitre des substances toxiques
dans le milieu.
- Il faut utiliser des souches bactériennes dérivées qui synthétisent pas des enzymes de
Restriction.
- Elles doivent se cultiver facilement, être robustes et peu exigeantes.
- Elles doivent etre stable en culture.
- Pour les récepteurs procaryotes, les E. coli sont les bactéries les plus utilisées comme cellule
hote : cette espèce, parfaitement connue au point de vue génétique, permet l’utilisation d’un très
grand nombre de vecteurs, tant de bactériophages que plasmides. Elle convient parfaitement
pour les travaux fondamentaux, pour des applications industrielles.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
1.2.1.Méthodes d'introduction de l'ADN à cloner dans la cellule hôte: Il y’a plusieurs
méthodes qui sont largement utilisées pour introduire l’ADN dans les cellules hôtes. Chez les
bactéries on peut transférer l'ADN à cloner par trois méthodes: la transformation, la
transduction et la conjugaison.
- Un canon à Particules: La transfection des cellules cibles se fait par des billes métalliques
(tungstène) recouvertes d’acides nucléiques, en perçant parois et membranes plasmiques sans
provoquer de lyse cellulaire. Cette technique a été utilisée sur des levures, des algues, des
cellules de plantes et même des mitochondries et chloroplastes. De plus contrairement à
l’électroporation, cette technique peut être utilisée pour introduire de l’ADN dans des tissus
intacts comme des graines de plantes.
- Microinjection: Dans les cellules animales, l’ADN peut être injecté dans le noyau par
microinjection.
1.3.1.Définition: Les vecteurs sont des petites molécules d’ADN dans lesquels on insère le
fragment d’ADN à étudier. Ces petits ADN sont généralement des virus bactériens
(bactériophages) ou des plasmides. Ils possèdent dans leur génome les signaux nécessaires pour
leur autoréplication, mais ils ne savent pas se multiplier seuls. Ils doivent être introduits dans
des cellules hôtes (bactéries par exemple).
1.3.2.Types de vecteurs:
Les plasmides: Ce sont de petits fragments d’ADN circulaire double brin, que l’on
trouve dans certaines bactéries en dehors du chromosome. Ils se répliquent grâce à des
enzymes dans la bactérie. Selon les types de plasmide, le nombre de plasmides par
bactérie varie. Certains plasmides ne sont présents que sous forme d’une seule copie.
D’autres sont au contraire en plus grand nombre, 15 à 20. On utilise au laboratoire des
plasmides artificiels créés à partir de plasmides naturels auxquels certaines séquences
ont été ajoutées. La plupart des plasmides actuels sont issue des plasmides pBR322 et de
la série pUC.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
Les bactériophages: sont utilisés comme vecteur grâce à leur capacité de transferer leur
matériel génétique dans une cellule bactérienne (transduction). La taille des fragments à
inséré peut atteindre 20 Kb. L’efficacite de transfert de l’ADN est supérieure à celle des
plasmides. Deux phages sont très utilisés comme vecteurs. Ce sont le phage λ et le
phage M13:
Phage λ : est un phage à ADN double brin, lineaire, d’une longueur de 48.5 Kb. Il
comprend plusieurs dizaines de gènes. Les extrémités de ce génome est simple brin,
elles sont appelées « extrémités cohésives :Cos. On dinstingue deux parties :
- La tête contient le matériel génétique,
- La queue : permettra au virus de se fixer sur la cellule hôte.
Phage M13: est un bactériophage spécifique d’E. coli, à ADN simple brin, circulaire,
d’une longueur d’environ 6.4 kb, appelé brin (+) par convention. Cet ADN comprend 10
gènes et 2 parties (petites régions) non codantes. Le génome de M13 est recouvert de
protéines, donnant un phage en forme de bâtonnet, dit filamenteux
Les Cosmides : sont des vecteurs artificiels hybrides : plasmide –phage λ, l’avantage
des cosmides et qu’il est possible de cloner des genes s’etendent sur des longueurs de
30-40kb. Les cosmides sont donc des plasmides possedant des sites de restriction ou
l’on peut insérer un ADN étranger. Il renferme un gène de résistance à l’ampicilline et
des sites cos du phage λ inclus dans leur ADN circulaire. Ce site Cos servira à ce que le
cosmide puisse être empaqueté dans la tete d’un phage λ.
Phagémides : vecteurs artificiels hybrides : phage filamenteux-plasmide qui combine
l’avantage des phages types M13 (Récupération possible d’ADN sous forme simple
brin), et des plasmides.
BACs : Bacterial artificiel chromosomes , dérivés du plasmide sexuel F, les fragments
clonés pouvant atteindre 200 kb.
YACs : Yeast artificiel chromosomes . chromosome artificiel de levure comportant un
centromère, deux séquences télomériques et des origines de réplication.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
A. Méthode basée sur la fluorescence : Le principe est un fluorochrome qui se fixe sur le
DNA et dont le taux de fixation est directement lié à la quantité de DNA émettra une quantité
de fluorescence qui sera proportionnelle à la quantité de DNA présente. Les différents
fluorochromes ; Se fixant spécifiquement sur des paires de bases :Bases A-T: Hoechst 332 et
DAPI et Bases G-C: mithramycine
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
- Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui ont
l'avantage d'être moins chers )
2.1.Electrophorèse sur gel d’agarose: Les gels agarose permettent la separation de fragments d’ADN
relativement de grandes tailles. Les molecules d’ADN, chargées négativement, sont soumises à un
courant électrique qui les fait migrer dans le gel. En fonction de la concentration de celui-ci en agarose,
certaines tailles de fragment seront mieux séparées que d’autre. Alors qu’un gel à 0,5 % permet la
séparation de molécules de 30 kb à 1 kb, il faudra une concentration de 1,5 % pour séparer des fragments
de 3 kb à 200 pb . Les gels d’agarose sont utilisés pour l’analyse des ITS, des RFLP, des PCR aléatoires
et des REP-PCR.
2.2. Sur gel de polyacrylamide: Les gels de polyacrylamide (Poly- Acrylamide Gel Electrophoresis ou
PAGE) sont utilisés pour des fragments plus petits que les gels d’agarose, en général inférieurs à 1 kb. À
nouveau, les échantillons deposés sur le gel sont séparés en fonction de leur taille. Tout comme pour les
gels d’agarose, une concentration plus élevée permet une séparation plus nette des fragments de très
petites tailles. Ils sont utilisés pour séparer les PCR d’ITS, les fragments de RFLP ou les simples brins
des SSCP.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
2.3. En champ pulsé: L’électrophorèse en champ pulse (Pulsed Field Gel Electrophoresis ou PFGE) est
une électrophorèse sur gel d’agarose utilisant des champs électriques alternés. Les changements de
direction des molécules en fonction de leur structure tridimensionnelle Durant la migration font varier
leur distance totale de migration. La PFGE permet de séparer des fragments de très grande taille, jusqu’à
10 Mb, alors que les électrophorèses traditionnelles séparent des fragments de maximum 50 kb. La
PFGE peut être utilisée sur des génomes ou métagénomes entiers restreints avec des enzymes de
restrictions coupant peu fréquemment sur des PCR aléatoires ou des RFLP.
2.4. En gradient de dénaturant: Les molécules d’ADN de petites tailles (entre 80 et 500 pb) se
déplacent au sein du gel et subissent une dénaturation progressive durant l’électrophorèse en fonction de
leur température de fusion (Tm). Une fois les brins dénaturés, leur encombrement stérique est trop
important pour continuer la migration dans le gel. Ces techniques permettent donc de séparer des
fragments de même taille en fonction de leur Tm, c'est-à-dire de leur composition nucléotidique (GC).
Afin d’éviter la séparation complete des deux brins d’ADN, une sequence riche en GC est ajoutée à
l’une des amorces lors de la PCR. Cette pince GC permet de garder les deux brins d’ADN attachés par
cette extrémité grâce à la série de triples liaisons hydrogens entre les guanines et les cytosines. Le
nombre de cycles, temps d’appariement et la quantité d’ADN de départ peuvent être augmentée.
2.5.Sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE-2D): sont des électrophorèses en deux
temps. La première migration a lieu sur un gel non denaturant et permet de séparer les molecules en
fonction de leur taille. La colonne est excisée et déposée sur le second gel contenant un gradient de
dénaturant, tout comme dans la DGGE. La seconde migration permet donc de séparer les amplicons en
fonction de leur séquence. Une pince G-C est donc nécessaire dans cette technique. La PAGE-2D a été
employée sur les ITS de bactéries des sols.
3.1.Marquage et suivi des acides nucléiques: Le marquage est principalement employé dans
toutes les techniques qui utilisent une sonde (hybridation, northern, …..). On distingue le
marquage dit « chaud » utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages « froids » qui
utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes, luminescentes. Ces dernières sont les plus
employées car plus pratiques.
3.1.3. Marquage avec une ADN pol. : fragment de Klenow, T4 ADN pol., Taq pol.,
transcriptase reverse, avec une exonucléase ou avec une terminal transférase: L’ADN peut être
marqué à son extrémité 5’ à l’aide d’une kinase, par exemple, la T4 polynucléotide kinase
extraite d’E. coli infecté par le bactériophage T4. En présence d’ATP avec du 32P en position g
ou [32P]g-ATP, il est possible d’échanger le groupement 5’-phosphate présent sur le fragment
d’ADN avec le phosphate radio-actif en position g sur l’ATP. Cette méthode est générale. Elle
est plus efficace si les extrémités 5’- sont préalablement déphosphorylées, par exemple par
l’action d’une phosphatase alcaline.
3.1.4.Marquage par translation de coupure (Nick Translation) :
utilise 2 enzymes :
- DNAse I dans des conditions ménagées pour générer quelques coupures simple brin dans le
fragment d'intérêt.
- DNA pol.I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser en
présence d'un nucléotide chaud.
Nous avons vu dans les outils enzymatiques utilisés en biologie moléculaire que l’ADN double
brin traité par la Dnase I était clivé au hasard. La réparation des coupures réalisées par la Dnase
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
I nécessite l’action de l’ADN polymérase I en présence de désoxynucléosides triphosphates
marqués au phosphore radioactif (32P). Les désoxynucléosides triphosphates utilisés sont
marqués en position alpha au 32P. Cette technique est appelée "technique de nick translation ".
Cette technique est actuellement en retrait par rapport à la technique suivante.
Attention : Les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients :
- nécessité de se protéger du rayonnement émis, un maniement des sondes inconfortables.
- Décroissance rapide du P32, d’où un besoin de marquer les sondes fréquemment.
Pour pallier à ces inconvénients, on peut utiliser les sondes« froides ».
4.Hybridation moléculaire:
4.1. Principe: L’hybridation moléculaire désigne l’association qui peut avoir lieu entre deux
acides nucléiques simples brins de séquences complémentaires et qui conduit à la formation
d’un double brin ou duplex. Cette association s’effectue par l’établissement de liaisons
hydrogènes spécifiques : deux liaisons entre l’adénine (A) et la thymine (T) (ou l’uracile U) et
trois entre la cytosine (C) et la guanine (G). La formation et la stabilité des duplex dépendent de
nombreux facteurs en plus de la composition en bases : longueur des duplex, complexité de la
séquence.
L’hybridation est à la base de nombreuses techniques de biologie moléculaire impliquant la
mise en présence d’ au moins deux brins simples d’acides nucléiques dans des conditions
physico chimiques précises. Le brin, dont on connaît au moins une partie de la séquence est une
sonde de l’autre brin, celui que l’on souhaite caractériser constitue la cible. L’un des deux brins
est marqué par couplage chimique avec une molécule pouvant générer un signal.
4.2.Les sondes nucléotidiques: Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui
permet de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique que l’on désire
étudier. Cette réaction sonde-fragment correspond à une réaction d’hybridation moléculaire.
Une sonde nucléotidique peut être soit une séquence d’ADN ou d’ARN, mais obligatoirement
monobrin. Sa taille est très variable: oligonucléotide de 20-30 nucléotides ou à l’opposé de
plusieurs centaines de nucléotides. La sonde est complémentaire et antiparallèle du fragment
recherché. Dans un mélange complexe où s’effectue l’hybridation moléculaire, la sonde doit
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
être facilement repérable grâce à un marquage avec un radioisotope (marquage chaud), mais il
existe également des sondes appelées sondes froides sans marquage par un radioisotope.
Obtention d’une sonde: Il existe plusieurs possibilités pour obtenir une sonde nucléotidique:
- Une sonde oligonucléotidique peut être fabriquée par synthèse chimique, si la séquence de
l’ADN à repérer est connue. Si elle est inconnue, on peut étudier la protéine correspondante et
remonter grâce au code génétique à la séquence d’ADN. Dans ce dernier cas, le travail est
particulièrement laborieux (nombre de codons élevé pour un même acide aminé).
- Une sonde peut être un ADNc. Une partie seulement du ADNc est utilisée.
- Une sonde peut être théoriquement du mARN.
5.Séquençage de l'ADN.
5.1.La méthode de Sanger : dans cette méthode, il faut un brin d'ADN à séquencer, une
amorce, des nucléotides (dNTP) et une ADN polymérase faisant un nouveau brin d'ADN
conforme à l'original. Chaque réaction comprend un nucléotide modifié différent (ddNTP) qui,
une fois incorporé dans le tube de la réaction (04 tubes= 04 ddNTP différents dans chaque
tube), constitue la fin d'une chaîne d'ADN, ce qui permet d'identifier la base finale.
Ces échantillons sont alors soumis à l'électrophorèse en gel, qui permet de séparer les nouveaux
brins d'ADN à l'aide de rayons X ou de lumière UV. Pour lire le gel, vous commencez par le
bas et regardez les bandes (tirets noirs) afin de déterminer le séquençage du fragment d'ADN.
Chaque colonne de gel a une base différente à l'extrémité. Par conséquent, chaque colonne
représente un brin d'ADN avec cette base à l'extrémité (Figure A). Des avancées ultérieures
dans cette méthode ont incorporé l'utilisation de fluorophores, qui sont de petits composés
chimiques dégageant des lumières colorées. En ajoutant un fluorophore coloré différent à
chaque nucléotide, le séquençage peut être effectué en une seule réaction avec une seule
colonne de gel pour représenter les brins d'ADN; la couleur de la bande indique la base située à
l'extrémité du fragment d'ADN (Figure B).
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
5.2 La méthode de Maxam et Gilbert: Des fragments de restriction (<200pb) sont purifiés à
partir d’un gel et marqués à leurs extrémités 5’ par une kinase et du γ-[32P]-ATP. Les deux
brins dont dénaturés à la chaleur, puis séparés en gel d’acrylamide. Chaque brin est soumis à
quatre réactions d’hydrolyse partielle qui vont cliver la molécule avant les A et les G, ou avant
les G, ou avant les C, ou avant les C et T. on va générer pour chaque réaction une famille de
molécules clivées à une position variable en 3’ de l’extrémité marquée. Les produits sont
séparés par l’électrophorèse en gel d’acrylamide contenant de l’urée. Ces gels sont très
résolutifs (deux fragments de longueur différant par 1 nucléotide sur 500 ou plus seront séparés.
Le gel est autoradiographié : on verra que les molécules ayant l’extrémité 5’ marquée. La
séquence est lue directement sur l’autoradiographie en comparant le résultat des 4 réactions.
La compilation des séquences chevauchantes sur les deux brins permet d’obtenir sans ambigüité
la séquence du gène entier. Utilisant les agents chimiques qui lèsent l’ADN, assez lourde à
mettre en pratique, cette méthode n’est plus utilisée que dans quelques cas particuliers.
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
6.1 principe: La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une
région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'obtenir une quantité suffisante pour le
détecter et l’étudier. Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice
d’ADN double brin est répétée en boucle.
Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de
matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle. Pour avoir la réplication
d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes :
6.2. Condition de PCR : Pour procéder à l’amplification d’une séquence d’ADN, Les PCR ont
été effectuées et optimisées sur l’ADN génomique préalablement dilué à 100 ng/μl en utilisant
des amorces spécifiques pour chaque région étudiée. Les réactions PCR ont été effectuées et
optimisées pour chaque région cible dans un volume final de 20μl pour le mélange réactionnel.
Et enfin, le mélange est déposé au niveau d’un thermocycleur selon un programme déterminé.
Pour chaque région cible, les amorces sens et antisens sont indiquées, ainsi que la taille attendue
pour chaque produit amplifié.
6.3. Témoins de la réaction PCR : Les témoins inclus pour chaque réaction PCR comprennent
- Témoins positif qui a pour fonction de s’assurer des bonnes conditions de la PCR, ce témoin
est représenté par l’ADN d’un sujet normal sain
Cours de BMGG 3°année licence Microbiologie Me.AZIZI
- Témoin négatif qui permet de s’assurer de l’absence de contamination, auquel il n’y a pas
d’ADN.
6.4. Contrôle des produits PCR : Les produits PCR sont contrôlés sur gel d’agarose 2 % en
présence d’un marqueur de taille, qui permet de vérifier la taille et la spécificité du produit
amplifié.