République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieure et de la Recherche Scientifique

Université 20 Août 1955 - Skikda

Faculté des Sciences

Les biocapteurs enzymatiques

Réalisé par : MS :D.SEKHANE

Lezghed Amira Meriem
BOUOUDEN meriem

2022/2023
 Le sommaire :

1.Introduction
2.Les biocapteurs
3.Les biocapteurs enzymatiques
a)Définition
b) Principe de fonctionnement
4.Les enzymes dans les biocaoteurs
5.L’activité enzymatique
6.
1.Introduction :
L’idée de biocapteur est née du besoin d’analyse en temps réel sans traitement
préalable de l’échantillon et sans manipulation de produits dangereux. Le
marché et les applications des biocapteurs sont très larges. Ils concernent non
seulement le domaine médical pour le diagnostic, mais aussi les analyses
environnementales et l’agroalimentaire. Le développement des biocapteurs a
débuté dans les années 1960 avec l’introduction des premières électrodes à
enzymes. Elles se sont étendues dans les années 1980 par la
commercialisation de biocapteurs ampérométriques pour la mesure du
glucose et en 1990 dans le domaine médical. Plus de 40 biocapteurs ont été
commercialisés pour le diagnostic médical, pour mesurer les paramètres aussi
divers que le taux de glucose, taux de cholestérol et certains analytes comme
l’urée, les lactates. Ces dernières années, le domaine des biocapteurs a connu
un développement remarquable sous la pression de plusieurs facteurs selon
les domaines d’applications.
2. Les biocapteurs (définition et principe de
fonctionnement ) :
Les biocapteurs sont des dispositifs analytique issu de l'association
d'un élément biologique appelé bio récepteur (ligand) , il peut être : enzyme,
anticorps, antigène, fragment d’ADN, d’ARN ou un
microorganisme………..,possédant une fonction de reconnaissance
spécifiquede l’analyte , et un élément transducteur qu’il peut étre un
électrode, microbalance à quartz, ou un fibre optique ;qui assure le transfert
de l'événement biologique «reconnaissance de l'analyte» et la transforme en
un signal exploitable (électrique ou lumineux).
La qualité du biorécepteur conditionne l’efficacité du dispositif en
termes de sélectivité, sensibilité, répétabilité et reproductibilité. La couche
bioréceptrice doit répondre à certains critères : une bonne conservation de
l’immunoréactivité, une quantité importante de molécules immobilisées avec
un faible taux de dénaturation et une bonne stabilité vis-à-vis des variations
de pH, de force ionique. Trois grands types de biomolécules sont
généralement utilisés comme éléments de reconnaissance. On distingue : les
enzymes, les immunoespèces (anticorps, antigènes), et les acides nucléiques.
Le deuxième élément constituant le biocapteur est un transducteur.
Son principe consiste à convertir en un signal électrique la détection
chimique du substrat. Les transducteurs étudiés sont principalement
électrochimiques. Toutefois, dans l’intention d’obtenir un signal plus précis,
sensible et exploitable, d’autres types de mode de détection apparaissent
comme les détections optiques, thermiques, piézo-électriques.
 Figure 1 : principe de fonctionnement du biocapteurs

Les biocapteurs sont généralement classées en fonction de :

 La nature du bio récepteur : bio récepteurs d’affinité , biorécepteurs
biométriques et bio récepteurs métaboliques .
 Le transducteur

Les biocapteurs enzymatiques sont regroupés dans la case des biorécepteurs

métaboliques catalysé .

3. Les biocapteurs enzymatiques :

a) Définition :
 Un capteur ou biocapteur enzymatique peut considéré comme la
combinaison de tout type de transducteur avec une fine couche enzymatique
destinée, en générale, à mesurer la concentration d'un substrat. La réaction
enzymatique assure la transformation du substrat en produit de réaction
détectable par le transducteur.
Les biocapteurs enzymatiques utilisent une variété de transducteurs,
Le premier biocapteur a été décrit dans la littérature par Clarck et Lyons en
1962 il se basait sur l’utilisation d’oxydase de glucose par détection
électrochimique. Ce principe a été depuis largement étendu pour le
développement de nouveaux biocapteurs en particulier basés sur les
oxydoréductases (comme la tyrosinase, la peroxydase et la lactase) et les
hydrolases (cholinestérases). Généralement ces biocapteurs ont été classés en
deux catégories:
 Ceux qui mesurent l’inhibition d’une enzyme spécifique due à la présence
d’analytes cibles.
 Ceux qui mesurent la transformation catalytique d’analytes cibles par une
enzyme spécifique.

Ce type des biocapteurs présent un grand nombres d’aventages notament la

reproductibilité des lot , par contre il peut y avoir une instabilité de leur
fonctionnement et la nécessité d’étulisé un cofacteur ou plusieurs enzymes
associés pour une même biocapteur , on parle ici des biocapteurs
multienzymatique .

b) Le principe de fonctionnement :

la surface sensible du transducteur est mise en contact avec la couche

enzymatique .On suppose qu'il n'existe pas de transfert de masse à travers
cette interface. La face externe de la couche enzymatique est trempée dans
une solution contenant le substrat à doser. Ce substrat va migrer vers
l'intérieur de cette couche et sera décomposé en produit de réaction
dès qu'il entrera en contact avec l'enzyme immobilisée. Pour assurer une
mise en équilibre rapide des concentrations, la membrane enzymatique doit
être aussi fine que possible et la solution bien agitée pour assurer un apport
constant en substrat.
les différentes étapes mises en jeu au cours du fonctionnement du capteur
enzymatique sont :
 Transport du substrat de la masse de la solution vers la couche
enzymatique.
 Diffusion du substrat dans cette couche, accompagnée de la
transformation enzymatique du substrat en produit de réaction.
 Migration du produit vers le transducteur.
 Conversion de la concentration du produit à cette interface, par le
transducteur, en signal électrique mesurable.

Figure 2 : Représentation schématique de la diffusion du substrat S et du

produit P dans une couche enzymatique fixée sur un transducteur

4. Les enzymes dans les bio capteurs

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques, des protéines
globulaires qui possède un site actif qui leurs lui donna la capacité
catalyque ;composées d'un nombre élevé d'acides aminés présentes dans les
cellules de tous les êtres vivants. Elles jouent un rôle très important dans la
catalyseet l’accélération des réactions se déroulant au sein des cellules; en
permettant d'augmenter la vitesse d'une réaction jusqu'à dix millions de fois
sans être consommées ou altérées .
Dans le cas du biocapteur, les enzymes jouent un rôle très important
dans la catalyse des réactions se déroulant au sein de la couche
chimiosélective .
Leurs propriétés fondamentales et leurs spécificités les rendent bien adaptées
à la conception de biocapteurs sélectifs.
La biodétection enzymatique est conditionnée par la nature de
l’analyte et la gamme de sa concentration dans le milieu à analyser. En effet,
l’analyte doit d’une part constituer un substrat dans une réaction
enzymatique et d’autre part être à une concentration comprise entre 10
puissance -1 et 10 puissance-7 M . Il existe plusieurs types d'enzymes
regroupées selon le type de la réaction de catalyse

5. L’activité enzymatique
Chaque enzyme « reconnaît » spécifiquement une ou plusieurs molécules
selon un principe de complémentarité de type clé-serrure, grâce à des sites de
reconnaissance et de fixation situés à sa surface. Ce sont des catalyseurs
spécifiques puisqu’elles ne peuvent participer qu’à des réactions bien
déterminées. A la fin du processus, l’enzyme retrouve sa structure. Il est à
noter que les enzymes participent aux réactions ayant lieu dans les
organismes vivants. De ce fait, l’enzyme fonctionne dans des conditions
douces de température, de pH et de pression. La réaction catalytique se
déroule au niveau du site catalytique dit site actif de l’enzyme, situé dans
la poche protéique, cavité aux caractéristiques structurales et chimiques
spécifiques. Le site actif de certaines protéines appelé apoenzyme ne peut être
efficace que par l’intermédiaire d’un cofacteur.
Ce dernier de type métallique (cuivre, zinc, manganèse) ou de type organique
(coenzyme) se fixe sur la région catalytique pour favoriser la réaction
chimique et aussi contribuer à la stabilité de l’enzyme. La réaction ne peut se
dérouler que par la combinaison de l’apoenzyme avec le cofacteur. La
substance chimique cible, nommée substrat (S), se fixe sur l’enzyme (E) au
niveau du site actif qui permet la réaction. Il se forme alors un complexe
intermédiaire ES. Pui cet intermédiaires dissocié pour donné un produit (P)
avec une régénération de l’enzyme. Ce processus s’effectue des milliers de
fois à la seconde
L’équation de l’activité enzymatique est sous le forme suivant :

K1 K3
E+ S ↔ ES↔ E+ P
K2 K4
Pour déterminer la vitesse de réaction catalytique, on utilise l’équation de
Michaelis-Menten qui s’écrit comme suit :

Vmax∗[ S ]
V 0=
Km+¿ ¿
L’activité enzymatique à tendance
 à diminuer après immobilisation du fait de possibles gênes stériques et
de limitations dans l’accessibilité au site actif .

 à augmenter sa stabilité dans le temps.

6. Les differents classes des enzymes :

Les réactions catalytiques principales sont les suivantes :

 les oxydoréductases : Elles interviennent dans des réactions redox qui
mettent en jeu des transferts d’atomes d’hydrogène, d’oxygène ou
d’électrons entre les molécules.
Dans ce groupe, on différencie :
a- Les oxydases
b- Les peroxydases
c- Les déshydrogénases
ce groupe est le plus utilisé en biocapteurs .
 les transférases : Elles catalysent le transfert d’un atome ou d’un groupe
d’atomes entre deux molécules mais exclut les réactions redox.
 les hydrolases : Elles impliquent la coupure de liaisons du substrat avec
fixation des radicaux H et OH issus de l’eau.
 les lyases :Elles interviennent dans des réactions d’élimination d’un groupe
d’atomes du substrat.
 les isomérases :Elles favorisent le changement de conformation du substrat.
 les ligases :Elles interviennent lors de la formation de liaisons covalentes
entre deux molécules, en faisant intervenir l’énergie libérée lors de
l’hydrolyse d’un nucléoside triphosphate (ATP).

Le tableau ci-dessous montre des differents bio récepteur enzymatique ;

Classe enzymatique enzyme analyte Limite de détection

Hydrolase Hydrolase Paraoson 16nM
d'organophosphorés
Isomérase Protéine disulfide Vincristine //
 isomérase humaine
Transférase Glycérol kinase ATP 200nM
+ oxydoréductase Glycérol-3-
phosphate oxydase
Lyase +lyase Citrate lyase Acide citrique 15μM
+oxydoréductase Oxaloacétate
décarboxylase
Pyruvate oxydase
Tableau : Exemples de biorécepteurs enzymatiques .

7. les différents techniques d’immobilisation des

enzymes :
Une enzyme immobilisée est une enzyme liée par des moyens physico-
chimiques en surface ou à l’intérieur d’un support solide .On cherche
généralement à conserver son activité enzymatique. l’ultrafiltration est l’une
des méthodes qui permet la réutilisation d’enzyme, mais il semble que celle
qui a donné naissance aux plus grands développements consiste à rendre
l’enzyme insoluble par un traitement physique ou chimique convenable,
suffisamment doux et sélectif pour éviter une perte trop importante d’activité
biologique, On peut combiner les deux méthodes(physique et chimique )
pour assurer une meilleure fixation de lˈenzyme.
Le choix de la méthode dépend de :
o le type de l’enzyme utilisée
o du transducteur et l’environnement dans lequel le biocapteur
fonctionne
o de l’application finale donnée a l’enzyme
o des stabilités mécaniques et chimiquesde la matrice et de son coût

a- immobilisation d’enzyme par inclusion :

Les molécules d’enzyme sont retenues dans le réseau tridimensionnel d’un

polymère insoluble dans l’eau « réseau tridimensionnel d’une matrice », ou
emprisonnées dans des microcapsules délimité par une membrane semi
perméable dont les pores sont suffisamment larges pour permettre le passage
des molécules du substrat ou des produits de la réaction.
On a : une inclusion dans une matrice , et une inclusion a l’aide de la matrice

b- immobilisation par absorption

C’est la méthode la plus simple et la plus rentable. Elle consiste à assurer la

rétention de la molécule enzymatique à la surface d’un support insoluble,
par interaction faible entre les groupes fonctionnels de l’enzyme et du
support. L’interaction enzyme-support pourra impliquer l’ensemble des
liaisons non covalentes ou secondaires de bas niveau énergétique tel que les
liaisons de Vander Waals, les liaisons hydrogène, les liaisons ioniques et le
transfert de charge.
NB : les supports utilisés peut être :
-des supports mécanique : comprennent des polymères et des polyosides
-des supports inorganique (minéraux ) : sont les plus stables résistent a l’usure
aux agents chimiques et aux bactéries mais la fixation est difficile
- Autres supports: le nylon, oxyde céramique, cellulose, collagène et charbon
actif
Cette méthode est influencé par : ma Tempeeta, le PH, la concentration des
enzymes ,la composition du milieu , et le temp de contact.

Figure : immobilisation par absorption

c- immobilisation par liaisons covalentes :

On peut diviser les méthodes d’immobilisation d’enzymes par liaison

covalente en deux groupes :
o Immobilisation par liaisons covalentes sur support : Elle est réalisée par
l’intermédiaire de liaisons irréversibles et covalentes entre les
groupements fonctionnels de l’enzyme et les groupes réactifs du support
o Immobilisation par réticulation ( sans support) : c'est un procédé
d'association des différentes unités biocatalytiques ou de protéines à
l'aide d'un agent réticulant .Elle peut être effectuée après inclusion ou
adsorption afin de stabiliser l’enzyme immobilisée et limiter les
phénomènes de fuites ou de désorption.
L’gent réticulaire le plus utilisé est le glutaldéhyde
 Figure : immobilisation par liaisons covalentes

Avantages et inconvénients de chaques méthode :

Méthode aventages Inconvénients

Absorbtion - Très grande facilité de - La fragilité de la
mise en œuvre fixation
- Fixation rapide du - L’orientation de
support et l’enzyme et mauvaise
immobilisation simple accessibilité au site actif
et non dénaturante
Inclution - Application à toutes - Problème de transfère
les enzymes de masse
- Obtention de supports - Risque de fuite de
de forma adaptables l’enzyme
Liaisons covalentes -protection du site actif - Risques de
- Stabilité accrue à modifications chimiques
cause de la liaison de l’enzyme
covalente - Mise en œuvre de
réactions chimiques
souvent complexes
LA CONCLUSION

Malgré le coût relativement important des enzymes, de nombreux

biocapteurs enzymatiques ont été développés en laboratoire et certains ont
été commercialisés. Chaque type de biocapteur comporte à la fois des points
forts et des points faibles. Le manque de stabilité durable dans le temps et la
difficulté de fabrication sont les problèmes les plus souvent cités. Le nombre
important d’enzymes commercialement disponibles a contribué au
développement des biocapteurs enzymatiques. Leur contribution permet
d’élargir l’application des biocapteurs dans des domaines différents .L’intérêt
d’une telle électrode réside dans la possibilité d’un dosage spécifique d’une
substance dans un milieu complexe avec une très faible consommation
d’enzyme, donc à moindre coût.
De plus, la mesure peut être effectuée rapidement et simplement, sans
nécessiter de prétraitements de l’échantillon. Enfin, la nature amplifiable du
signal électrique permet une haute sensibilité
de détection avec une bonne précision
Les biocapteurs enzymatiques permettront d'effectuer des
tests rapides, faciles à utiliser et rentables sur place. Bien que les
perspectives soient bonnes, le développement de ces types de
biocapteurs doit être approuvé par les organismes de
réglementation avant qu'ils ne soient largement appliqués. Cette
approbation nécessitera de nombreuses démonstrations
réussies, dans des conditions très diverses rencontrées sur le terrain.