6.

Biocapteurs
6.1 Principe d’un biocapteur
Biocapteur = élément de reconnaissance moléculaire + transducteur

signal signal
analyte analyte

transducteur transducteur
élément de élément de
reconnaissance reconnaissance
moléculaire moléculaire

™ L’élément de reconnaissance moléculaire réagit spécifiquement avec le bio-

analyte d’intérêt.

™ Le transducteur agit en tant que détecteur, convertissant l’évènement de

reconnaissance moléculaire en un signal facilement mesurable. 240

™ L’élément de reconnaissance moléculaire et le transducteur sont

intégrés dans un seul dispositif (petit et portatif) permettant de doser
directement l’analyte d’intérêt sans l’ajout d’autres réactifs ou de
pré-traitement de l’échantillon.

241
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
™ L’élément de reconnaissance moléculaire:
¾ est immobilisé à/près de la surface du transducteur par physisorption,
chimisorption ou par piégeage dans une membrane inerte
¾ offre une spécificité et une sensibilité élevées pour l’analyte, ainsi qu’une
réponse rapide
¾ ex. enzymes, anticorps, ADN, cellules entières, micro-organismes

™ Le transducteur:
¾ est le composant d’un biocapteur qui détecte les changements
physiques se produisant dans l’élément de reconnaissance moléculaire
suite à la liaison de l’analyte et les convertit en un signal de sortie qui
peut être amplifié, affiché et sauvegardé
¾ peut convertir le signal provenant d’un évènement de reconnaissance
moléculaire soit directement ou par le biais d’un médiateur chimique
(ex. glycomètre)
Principe de fonctionnement
d’un biocapteur

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,

Bioanalytical Chemistry, 2004)

242

™ Modes de transduction:
¾ le type de reconnaissance moléculaire détermine le type de
transducteur utilisé
¾ ex. spectrophotométrie, électrochimie, calorimétrie et piézo-électricité

243
(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
 Combinaisons différentes

Élément biologique Transducteur Exemple

Électrochimie
- Enzyme potentiométrie Électrodes rédox et
- Micro-organisme sélectives aux ions
- Tissue (plante ou (ex. électrode de
animale) verre, électrodes
sélectives au CO2,
- Anticorps marqué avec NH3 et sulphide)
enzyme

- Enzyme ampérométrie Détection de H2O2/O2,

- Micro-organisme électrodes aux
- Tissue enzymes
- Anticorps marqué avec
enzyme 244

Élément biologique Transducteur Exemple

Électrochimie
- Enzyme Conductimétrie Électrodes de Pt ou Au
-Bicouche lipidique pour déterminer le
changement de
conductivité de la
solution due à la
production d’ions

Optique
- Anticorps fluorescence Photodiodes, fibre-
- Acide nucléique optiques, puces à ADN

- Anticorps résonance de BIAcore (avec surfaces

- Antigène plasmons de d’Au ou Ag)
- Enzyme surface (SPR)
- Acide nucléique
245
 Élément biologique Transducteur Exemple

- Anticorps Acoustique Dispositifs

- Antigène piezoélectriques,
- Enzyme microbalance à cristal
quartz
- Acide nucléique

- Enzyme Calorimétrie Thermisteur ou

- Micro-organisme thermopile
- Cellule

B.M. Paddle, « Biosensors for chemical and biological agents of defence interest »,
Biosensors & Bioelectronics 1996, 11, 1079-1113

246

6.2 Biocapteur à base d’enzyme

électrode électrode
™ Le 1er biocapteur (développé par auxiliaire
électrode
de travail
de référence
Clark et Lyons en 1962 pour la
détection du glucose) était
constitué de la glucose oxydase
(GO) piégée à la surface d’une
électrode de Pt par une
membrane à dialyse permettant
la diffusion des substrats et
produits à/de la couche enzyme piégée
enzymatique. dans une
membrane
S + O2 P + H2O2 semi-perméable
™ La conversion du D-glucose (S)
en gluconolactone (P) et H2O2
est détectée par électrochimie:
Capteur ampérométrique
H2O2 2H+ + O2 + 2e- i

Eappliqué = +0.70 V vs. E.C.S.

247
™ L’amplitude du courant mesuré (i) dépend de quatre facteurs:
™ cinétique de transfert de masse qui détermine les vitesses
auxquelles les substrats peuvent être fournis à et les produits
enlevés de la couche enzymatique
™ cinétique enzymatique qui détermine la vitesse à laquelle le
H2O2 est généré à l’intérieure de la couche enzymatique
™ cinétique de la réaction électrochimique qui détermine la vitesse
à laquelle le H2O2 produit dans la réaction enzymatique est
converti en O2
™ efficacité de conversion, i.e. fraction de H2O2 oxydée

™ Les réactions se produisent dans une mince couche à la surface du

transducteur; des concentrations stables des réactifs et des
produits existent dans cette couche lorsqu’un signal constant est
obtenu.
248

Glycomètre - biocapteur ampérométrique

Bandelette-test pour le glucose

électrode de
référence Ag/AgCl

zone
réactive

contacte électrode de
électrique travail/enzyme

Fe(CN)64- FAD C6H12O6 glucose

-
e
électrode

glucose
oxydase

Fe(CN)63- FADH2
C6H10O6 gluconolactone 249
 Courbes d’étalonnage enregistrées
™ L’accepteur physiologique (O2) pour le glucose avec le ferrocène
est remplacé par un médiateur comme médiateur
synthétique (1,1’-diméthyl-
ferrocène ou Fe(CN)63-/4-)
pouvant transporter les électrons
du centre rédox de l’enzyme à la
surface de l’électrode.

™ Due à l’utilisation d’un médiateur

artificiel, l’analyse devient
insensible à la fluctuation du taux
d’oxygène (i.e. N2 vs. air)

™ L’analyse peut aussi être

effectuée à des potentiels plus
bas (élimination d’espèces (D’après Mikkelsen & Cortòn,
interférentes). Bioanalytical Chemistry, 2004)

250

6.3 Microréseau à base d’ADN

™ Un microréseau à base d’ADN permet l’analyse en parallèle de plusieurs
gènes sur un seul dispositif. Des dizaines de milliers de réactions peuvent
être effectuées simultanément sur une seule puce à ADN.

™ Cette nouvelle technologie exploite l’appariement de deux oligonucléotides

complémentaires. Avec un microréseau d’ADN, il est possible d’identifier la
séquence d’un gène et de détecter des mutations génétiques.

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,

Bioanalytical Chemistry, 2004)

sonde moléculaire

251
 Fabrication de macro- ou microréseaux d’ADN

™ Une puce à ADN contient un arrangement ordonné d’oligonucléotides

immobilisés en forme de points sur un support solide miniaturisé
(généralement du verre). Chaque point d’une puce contient jusqu’à
~106 oligonucléotides identiques, mais la séquence nucléotidique
varie d’un point à l’autre.

252

™ Dans un macroréseau, la taille des points est ≥ 300 µm. Il y a 1,000 à 10,000
différents points par puce.

™ Les macroréseaux sont fabriqués avec un dispositif piezoélectrique

programmable (cf. imprimante à jet encre)

(1) (2) (3) (4) (5)

Étapes de fabrication d’un macroréseau

253
™ Modes d’immobilisation des oligonucléotides:

™ Couplage covalent d’un oligonucléotide

1- Modification de la surface de verre avec un silane fonctionnalisé

H3CO 95% acetone/ O

H3CO Si X 5% eau
OH + H3CO O Si X
O

ou

H3C
H3C
OH + H3C Si X O Si X
Cl H3C

(ou X= NH2, SH, CHO, )

O

254

2- Réaction avec oligonucléotide aminé, NH2-(CH2)6-O-(PO)2-oligo

1,4-phénylenediisothiocynate
H2

255
 CHO

CH=

- Attaque nucléophilique (-NH2, -SH, -OH) sur des époxydes

256

™ Couplage non-covalent (adsorption électrostatique)

groupements phosphate chargés négativement de l’ADN

– Surface modifiée avec un γ-amino propylsilane

– Surface modifiée avec une couche de poly-L-lysine

257
™ Dans un microréseau, la taille des points est de 20 à 50 µm
(ex. puce à ADN d’Affymetrix).

puce à ADN
d’Affymetrix

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,

Bioanalytical Chemistry, 2004)

258

Fabrication d’un microréseau par photolithographie

OH OH ClSi(CH3)2 H3C Si CH3 H3C Si CH3

O O
-HCl
plaque de verre

www.affymetrix.com 259
 Principe d’une puce à ADN

(marqueur
fluorescent)

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 260

Lecteur de microréseaux-
microscope confocal à fluorescence induite par laser

λexcitation: Vert (532 nm)

261
Rouge (633 nm)
 Séquençage de l’ADN avec un microréseau

Un microréseau constititué de 44 = 128 points

de tetranucléotides. Pour simplicité, seulement
une chaîne est illustré par point.

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,

Bioanalytical Chemistry, 2004)

Un microréseau après
réaction avec de l’ADN
partiellement digéré.
L’hybridation avec les
C
tetranucléotides
du réseau est indiquée
en rouge.
262

Marqueurs fluorescents:
rhodamine et fluorescein
ou Cy3 et Cy5
λexcitation: Vert (532 nm)
Rouge (633 nm)

263
Microréseaux et les couleurs des points

264