2022/2023 Explorations

biochimiques en
enzymologie clinique
Biochimie Clinique
4e Année de Pharmacie
Pr K. SEMRA

(12 Pages)
DEPARTEMENT DE PHARMACIE-FACULTE FACULTE DE
MEDECINE-UNIVERSITE CONSTANTINE 3
Explorations biochimiques en enzymologie clinique

Plan

1. Introduction

2. Mesure de l’activité enzymatique

2.1. Prélèvement
2.2. Méthodes d’analyse
2.2.1 Mesure de l’activité catalytique

2.2.2. Méthode cinétique en deux points

2.2.3. Méthode cinétique en continu
2.2.4. Méthode cinétique en point final
2.2.5. Expression de l’activité catalytique
2.2.6 Calcul
2.3. Dosage des isoenzymes
2.4. Identification des macroenzymes

3. Applications médicales
3.1. Aminotransférases
3.2. Lactate déshydrogénase (LDH)
3.3. Phosphatase alcaline (PAL)
3.4. Gammaglutamyltransférase (GGT)
3.5. Créatine kinase (CK)
3.6. Amylase et lipase

4. Conclusion

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1. Introduction
Les enzymes sont des protéines dotées d’activité catalytique, permettant l’accélération de la
vitesse de la réaction de transformation d’un substrat initial en un produit final. Cette
réaction sera très lente spontanément.

Figure 1. Schéma d'une réaction enzymatique

Les enzymes présentes dans le corps humain sont soit :

 activement sécrétées dans la circulation générale où elles assurent leurs fonctions
physiologiques (exp : Enzymes de la coagulation ; Rénine ; Lipoprotéine lipase (LPL) :
catabolisme des triglycérides de VLDL et chylomicrons)
 ont une localisation intracellulaire où elles assurent leurs fonctions métaboliques
dans différents compartiments subcellulaires et dans différents tissus. Certaines
réactions pouvant être catalysées, en fonction de leur localisation tissulaire, par des
isoformes différentes d’une même enzyme (exp : Aminotransférases, LDH, CK).
 elles proviennent des glandes exocrines du pancréas, des glandes salivaires.... (exp :
Phosphatase acide de la prostate ; Phosphatase alcaline du foie ; Amylase du
pancréas et de la salive; Lipase du pancréas.
Les enzymes assurent plusieurs fonctions biologiques:
 Catalyseurs de réactions métaboliques (glucidiques, lipidique, protidique, acides
aminés, nucléotides, ADN, ARN….) ;
 Régulateurs des voies métaboliques ;
 Agents de transduction du signal ;
 Contraction musculaire ;
 Coagulation sanguine ;
 Pompes ioniques.

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La détermination d’une ou de plusieurs enzymes dans le plasma peut donner une indication
du tissu ou du type cellulaire dont elles proviennent ce qui a un intérêt large en biochimie
clinique pour le diagnostic et le suivi évolutif de nombreuses pathologies (lésions tissulaires,
proliférations cellulaires, inductions enzymatiques et processus malins).

2. Mesure de l’activité enzymatique

2.1. Prélèvement
L’activité enzymatique est déterminée sur prélèvement sanguin associé ou pas à un
prélèvement urinaire. Le jeune n’est pas obligatoire. Les modalités de prélèvement (tube, la
température, délai de centrifugation, conditions de conservation….) dépendent de la nature
et de la stabilité de l’enzyme concernée.
2.2. Méthodes d’analyse

2.2.1 Mesure de l’activité catalytique

L’activité catalytique repose donc sur la détermination de la vitesse maximale (Vm) de la
réaction (cinétique enzymatique). La Vm est enzymatique est définie par la vitesse de la
réaction de transformation du substrat (S) en produit (P). La mesure de l'activité est fonction
de plusieurs facteurs: la nature et la concentration de l’enzyme; la nature du substrat; le pH
et de la température du milieu.

Figure 2. Vitesse de la réaction enzymatique en fonction du substrat

2.2.2. Méthode cinétique en deux points

L'enzyme et le substrat sont mis en contact pendant un temps t déterminé puis la réaction
est arrêtée à l’aide d’un réactif d’arrêt. Le substrat restant ou le produit formé est dosé par
une technique appropriée (spectrophotométrie UV ou visible).
Les deux points correspondent en général au t0 et au t1.

2.2.3. Méthode cinétique en continu

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L’apparition d’un produit ou la disparition d’un substrat en fonction du temps sont suivies
directement, en général à l’aide d’un spectrophotomètre (lorsque le produit ou le substrat
absorbent). La variation d’absorbance au cours du temps, à une longueur d’onde donnée,
est donc directement enregistrée. Les points correspondent en général au t0 , t1, t2, t3, t4, t5…..
tfinal.

2.2.4. Méthode cinétique en point final

Méthode applicable lorsque tout le substrat est transformé en produit. On utilise la plupart
du temps une méthode spectrophotométrique. La variation d’absorbance entre le temps
zéro (début de la réaction) et le temps t (réaction totale) est directement proportionnelle à
la quantité de substrat transformé.

- Ces méthodes cinétiques sont estimées spectrophotométriquement et sont soit :

 Colorimétriques : utilisant un chromogène ; molécule organique qui a la propriété
d'exister soit sous forme incolore, soit sous forme colorée. La forme colorée absorbe
dans le visible.
 Dans la majorité des cas, basées sur les propriétés d'absorption du coenzyme NADH
ou NADPH dans l'ultra-violet à 340 nm.

2.2.5. Expression de l’activité catalytique

- L’activité enzymatique est exprimée en unité internationale (UI) qui correspond à la
quantité d’enzyme catalysant la transformation d’une micromole de substrat par minute. La
concentration d’activité catalytique est calculée en unités internationales par litre (UI/L).

2.2.6. Calcul
Basé sur la loi de Beer-Lambert, par la mesure de l’absorbance (ΔA/min), correspondant soit
à la disparition d’un substrat, soit à l’apparition d’un produit de réaction. Il nécessite de
connaître le coefficient d’absorbance linéique molaire (ε) du constituant mesuré (substrat,
ou le plus souvent produit de réaction).
Le calcul doit prendre en compte la dilution du spécimen dans le milieu réactionnel:

où :
– ε est le coefficient d’absorbance linéique molaire du constituant mesuré à une longueur
d’onde donnée et est exprimé en L.mol–1.cm–1 ;
– l est la longueur du trajet optique, exprimée en cm ;
– le facteur de 106 permet de transformer les moles en micromoles ;
– Vt / Vs : corrige de la dilution du spécimen dans le milieu réactionnel (Vs : volume du
spécimen ; Vt : volume réactionnel total).

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Remarque
Le facteur de conversion (F) fourni dans la documentation technique d’un fournisseur de
réactifs pour le calcul d’une concentration d’activité enzymatique (U/L= F x ∆A) correspond à
:

2.3. Dosage des isoenzymes

Les isoenzymes sont des enzymes appartenant à une même famille, catalysant la même
réaction biochimique, mais ont des structures apparentées (sous-unités différentes) et ont
une spécificité tissulaire.
Les méthodes d'analyse employées incluent la séparation électrophorétique ou
chromatographique ou encore les méthodes immunochimiques spécifiques.
Exemples :
- Les isoenzymes de la créatine phosphokinase (CK : Musculaire= CK-MM ; Cardiaque=
CK-MB ; Cérébrale = CK-BB),
- Les isoenzymes de la LDH (LDH : Cœur/Reins= LDH1 (H4), Globule
rouge/Cerveau/Reins = LDH2 (H3M), Leucocytes/Cerveau/Muscle=LDH3 (H2M2),
Leucocytes= LDH4 (HM3) Muscle/Foie = LDH5 (M4).
- Les isoenzymes de la phosphatase alcaline (osseuse, placentaire, hépatique et rénale)

2.4. Identification des macroenzymes

Le terme de « macroenzyme » désigne un complexe de haut poids moléculaire, formé par
auto-polymérisation des molécules enzymatiques entre elles ou, plus fréquemment, par une
liaison de l’enzyme à un autre composé sérique (d’origine endogène : immunoglobuline lors
d’une maladie auto-immune ou exogène : médicament). Ces complexes ont une demi-vie
plus élevée que celle des enzymes correspondantes ce qui se traduit par l'augmentation de
l'activité enzymatique mesurée dans le plasma. Cliniquement, ces élévations sont
asymptomatiques et peuvent induire une erreur d'interprétation. Les plus fréquentes sont la
macro-CK et la macro-Amylase.
Le diagnostic de macroenzyme est évoqué devant une élévation chronique et stable de
l’activité enzymatique en l’absence de toute symptomatologie clinique.
Les méthodes analytiques utilisées sont:
- Ultrafiltation à travers une membrane,
- Précipitation par le polyéthylène glycol (PEG),
- Electrophorèse,
- Chromatographie par exclusion stérique,
- Immunoprécipitation.

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3. Applications médicales
3.1. Aminotransférases

 Origines et fonctions
Les aminotransférases (anciennement dénommées transaminases) sont des enzymes qui
interviennent dans le métabolisme des acides aminés en catalysant l’interconversion entre
un acide aminé et un acide α-cétonique par transfert d’un groupement aminé en présence
d’un coenzyme : le phosphate de pyridoxal (vitamine B6).
Deux aminotransférases ont un intérêt clinique :
- L’aspartate aminotransférase (AST, EC 2.6.1.1), anciennement nommée transaminase
glutamique oxaloacétique (TGO) qui catalyse la réaction réversible de transfert du
groupement aminé du L-aspartate sur le 2-oxoglutarate. L’AST a une localisation
cytosolique et mitochondriale, elle est présente en particulier dans le cœur, le foie, le
rein, le muscle squelettique, le pancréas, la rate, le poumon et les érythrocytes,
- L’alanine aminotransférase (ALT, EC 2.6.1.2) anciennement transaminase glutamique
pyruvique (TGP) qui catalyse la réaction réversible de transfert du groupement aminé
de la L-alanine sur le pyruvate. L’ALT a une localisation quasiment cytosolique et est
présente en grandes quantités au niveau des hépatocytes ; plus faiblement dans les
autres tissus.

 Dosage
Le prélèvement sanguin ne nécessite pas de jeune. Il est réalisé sur anticoagulant
héparinate.

Dans les deux réactions, la diminution de l’absorbance du NADH à 340 nm par unité de
temps (∆A/∆t) est proportionnelle à l’activité enzymatique des aminotransférases.
- AST : femmes : 31 U/L – hommes : 35 U/L
- ALT : femmes : 34 U/L – hommes : 45 U/L
 Intérêts cliniques
- L’AST: est libérée dans la circulation sanguine lors de lésions tissulaires.
 Lors d’atteintes tissulaires modérées (5-10 fois la valeur normale): l’AST qui
prédomine dans le plasma est d’origine cytosolique. Les principales pathologies sont
l’infarctus du myocarde ; une pathologie musculaire, un traumatisme, une hépatite

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chronique, une cholestase, un carcinome hépatocellulaire, une embolie pulmonaire

ou lors d’hémolyses.
 Lors d’atteintes sévères (pouvant atteindre plus de 100 fois), c’est la forme
mitochondriale qui est libérée. Les pathologies sont les hépatites aiguës, les lésions
par écrasement et l’hypoxie tissulaire.
- L’ALT: est libérée dans la circulation sanguine lors d’une cytolyse hépatocellulaire, la
concentration plasmatique en activité ALT est souvent supérieure à celle de l’AST, l’ALT étant
plus spécifiquement d’origine hépatique. Cependant, en cas de nécrose hépatocytaire, la
libération d’AST d’origine mitochondriale contribue à une diminution du rapport ALT/AST.

3.2. Lactate déshydrogénase (LDH)

 Origines et fonctions
La lactate déshydrogénase (LDH, EC 1.1.1.27) est une enzyme qui catalyse l’oxydation du
lactate en pyruvate en présence de NAD+ avec formation de NADH,H+ et réversiblement. Elle
catalyse la transformation de pyruvate en lactate dans la dernière étape de la glycolyse en
anaérobiose, et permet la formation de pyruvate à partir du lactate lors de la
gluconéogenèse. Il s’agit d’une enzyme ubiquitaire, puisqu’elle est présente dans toutes les
cellules de l’organisme, dans lesquelles elle n’est retrouvée que dans le cytosol.

 Dosage
Le prélèvement sanguin ne nécessite pas de jeune. Il est réalisé sur anticoagulant
héparinate.

La diminution de l’absorbance du NADH à 340 nm par unité de temps (∆A/∆t) est

proportionnelle à l’activité enzymatique de la LDH.
- Femmes : 247 U/L – hommes 248 U/L.
 Intérêts cliniques
La LDH augmente lors de toute cytolyse, quelle qu’en soit l’origine, entraînant sa libération
en grandes quantités dans la circulation générale.
Cependant, étant peu spécifique, il doit être associé en cas d’augmentation, à d’autres
marqueurs biologiques pour orienter le diagnostic.
Des élévations importantes d’activité LDH sont observées au cours :
- d’un infarctus du myocarde (tardivement),
- des atteintes hépatiques s’accompagnant d’une cytolyse hépatocellulaire,
- d’anémies mégaloblastiques et hémolytiques,
- d’une atteinte pulmonaire sévère (infarctus pulmonaire, œdème aigu du poumon,
pneumopathie infectieuse),
- d’une nécrose musculaire (traumatique),

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- d’un infarctus rénal,

- de processus néoplasiques (particulièrement en onco-hématologie).
- Toute hémolyse, même légère, entraîne une augmentation de la concentration en
activité LDH dans le plasma. L’hémolyse in vitro représente la principale interférence
de ce dosage.

3.3. Phosphatase alcaline (PAL)

 Origines et fonctions
La phosphatase alcaline (PAL, EC 3.1.3.1) catalyse l’hydrolyse de liaisons ester phosphorique
d’une large variété de substrats. Ce sont des enzymes qui se trouvent dans la plupart
des tissus de l’organisme, en particulier les os, le foie, l’intestin, les reins, etc. Elles sont aussi
présentes dans le placenta en cours de grossesse.
 Dosage
Le prélèvement sanguin ne nécessite pas de jeune. Il est réalisé sur anticoagulant
héparinate.

La PAL catalyse l’hydrolyse du 4-nitrophénylphosphate, avec libération de 4-nitrophénol et

de phosphate. En milieu alcalin, le 4- nitrophénol est converti en 4-nitrophénoxide de
couleur jaune. AMP et H2O sont utilisés comme accepteurs de phosphate. La réaction se
déroule à pH 10,20 (37 °C) et l’activité de la PAL est mesurée en cinétique par le suivi de
l’augmentation d’absorbance à 405 nm.
Femmes : 98 U/L – Hommes 115 U/L – Enfants et femme enceinte 100 à 200 UI/l
 Intérêts cliniques
Les taux de phosphatases alcalines augmentent naturellement pendant la croissance et
pendant la grossesse. Une augmentation en dehors de ces périodes peut refléter la présence
d’une maladie hépatique (cholestases) ou osseuse (remodelages osseux, cancers et
métastases osseuses).
L’identification des isoformes de la PAL a pour objectif principal de différencier une
augmentation d’activité PAL d’origine hépatobiliaire d’une augmentation d’origine osseuse.

3.4. Gammaglutamyltransférase (GGT)

 Origines et fonctions
La Gamma-GT (γ-GT ou gamma glutamyl-transpeptidase) est une enzyme impliquée dans le
métabolisme des acides aminés. Sa fonction est de transférer les résidus gamma-glutamyl
sur des acides aminés ou des peptides. Elle est présente dans le cytosol, mais surtout

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localisée au niveau de la membrane cellulaire où elle joue un rôle dans le transport de

peptides. Elle intervient en particulier dans le métabolisme du glutathion. La gamma-
GT existe au niveau de nombreux organes comme l’intestin, les reins, les poumons, le
pancréas, le foie, la rate, la prostate et le cœur.

 Dosage
Le prélèvement sanguin ne nécessite pas de jeune. Il est réalisé sur anticoagulant
héparinate.

Femmes = (7-32) UI/L ; Hommes (11-50) UI/L

L’activité de la GGT est mesurée en cinétique par le suivi de l’augmentation d’absorbance à

405 nm.

 Intérêts cliniques
L’activité de la Gamma-GT sérique est essentiellement d’origine hépatique. Son taux
augmente en cas de:
- cholestase (5 à 30 fois la normale), son augmentation débute avant celle d’autres
enzymes telles que la PAL et persiste plus longtemps.
- cirrhose alcoolique, mais également chez des consommateurs abusifs de boissons
alcoolisées, par induction enzymatique et en dehors de lésions hépatiques,
- médicaments Inducteurs enzymatiques (phénobarbital, phénytoïne),
- cytolyse hépatocellulaire, carcinomes hépatocellulaires ou métastases hépatiques
atteintes pancréatiques (pancréatites aiguë ou chronique ; tumeur du pancréas),
tumeur de la prostate (modérément).

3.5. Créatine kinase (CK)

 Origines et fonctions
La créatine kinase (CK, EC 2.7.3.2), encore appelée créatine phosphokinase (CPK), est une
enzyme localisée dans le cytoplasme et les mitochondries des cellules, majoritairement au
niveau du muscle squelettique et du muscle cardiaque et faiblement au niveau du cerveau,
du rein et du tractus gastro-intestinal. Elle catalyse la réaction de phosphorylation réversible
de la créatine en créatine phosphate en utilisant de l'ATP.

 Dosage
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Le prélèvement sanguin ne nécessite pas de jeune. Il est réalisé sur anticoagulant

héparinate.

L’activité CK est mesurée en cinétique à pH 6,50 par le suivi de l’augmentation de

l’absorbance du NADPH à 340 nm.
Femmes : 145 U/L – Hommes 171 U/L.

 Intérêts cliniques

Dans le plasma de sujets sains, l’activité CK varie en fonction de la masse musculaire des
individus (âge, sexe) et augmente en cas d’exercice musculaire intense.
Dans des situations pathologiques, les activités CK les plus élevées dans le plasma (pouvant
atteindre plus de 10 × la normale) sont retrouvées lors :
- d’atteintes du muscle squelettique (myopathies congénitales, rhabdomyolyses,
écrasements musculaires importants),
- d’atteintes du muscle cardiaque (infarctus du myocarde),
- d’un traumatisme crânien ou certaines affections neurologiques,
- d’hypothyroïdie ou de pathologies néoplasiques.

3.6. Amylase et lipase

 Origines et fonctions
L’α-amylase est une enzyme qui joue un rôle essentiel dans la digestion des glucides,
puisqu’elle est capable d’hydrolyser des liaisons α-1,4-glucosidiques à l’intérieur de
polysaccharides composés d’α-D-glucose, tels le glycogène et l’amidon, pour donner lieu à la
libération de molécules plus petites : glucose, maltose et dextrines limites (contenant des
liaisons α-1,6-glucosidiques). Deux organes contiennent des quantités importantes
d’amylase, le pancréas et les glandes salivaires, avec différentes isoformes (P : Pancréatique et S :
Salivaire).
La lipase est une enzyme secrétée par le pancréas, elle joue un rôle fondamental dans la
digestion des triglycérides à chaînes longues, dont elle hydrolyse les liaisons ester en
position 1 et 3 pour libérer deux acides gras et un 2-monoglycéride qui sont absorbable.

 Dosage
Le prélèvement sanguin ne nécessite pas de jeune. Il est réalisé sur anticoagulant
héparinate. Le prélèvement urinaire a lieu sur des urines collectées sur 24h.

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Amylase

La réaction se déroule à pH 7,00 (37 °C) en présence d’ions Cl – (activateurs de l’amylase) et

l’activité enzymatique est mesurée en cinétique par le suivi de l’augmentation d’absorbance
à 405 nm (coloration jaune du 4-Nitrophénoxyde).

Amylase sérique = 20 – 110 UI/L Amylase urinaire = 20 – 360 UI/24h.

Lipase

L’activité de la lipase dans l’échantillon est proportionnelle à la production de méthyl-

résorufine dans la réaction et est déterminée par spectrophotométrie à 570 nm.

Lipase sérique < 60UI/L Lipase urinaire < 1 UI/24h

 Intérêts cliniques
La détermination de ces deux enzymes est le diagnostic d’une pancréatite aiguë, la
sensibilité et la spécificité cliniques de la mesure de la lipase sont supérieures à celles de
l’amylase et même à celles de l’amylase P. Une augmentation isolée de l’activité amylasique
dans le plasma peut orienter vers une atteinte de glandes salivaires, mais également vers
une cause néoplasique. Enfin, la prévalence d’une macroamylasémie est bien plus élevée
que celle d’une macrolipasémie, dont la découverte est exceptionnelle.

4. Conclusion
En pratique clinique, l’exploration biochimique des enzymes apporte, à côté d’autres
biomarqueurs, des informations qui aident au DGC de certaines pathologies. Cependant, les
enzymes ne peuvent être le marqueur de choix dans l’établissement d’un DGC et/ou d’un
DGC différentiel que si elles ont une spécificité tissulaire ou si elles-mêmes sont à l’origine de
la pathologie à explorer.

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