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CHAPITRE 3:
DOSAGE DES MARQUEURS PAR TECHNIQUES
ENZYMOLOGIQUES
2 Enzymes:
 molécules biologiques qui possèdent une activité catalytique (augmentation des vitesses
réactionnelle) alors que celles-ci se dérouleraient lentement en l'absence d'enzyme(in vivo
et in vitro)
 Dans l'organisme: sont activement sécrétées dans la circulation générale où elles assurent
leurs fonctions phy­siologiques
 Peuvent aussi avoir une localisation intracellu­laire (fonctions métaboliques dans différents
compartiments subcellulaires)
 En fonction de leur localisation: plusieurs isoformes différentes d'une même enzyme
 Détermination d'une ou plusieurs enzymes dans le plasma peut donner une indication
du tissu ou du type cellulaire dont elles proviennent : intérêt pour le diagnostic et le suivi
évolutif de nombreu­ses pathologies
3 Enzymes: 2 groupes
Les enzymes spécifiquement plasmatiques:
 une fonction dans le plasma qui est leur lieu d'action normal.
 Ex: enzymes de la coagulation, de la rénine, de la lipoprotéine lipase: sont libérées
physiologiquement dans le plasma pour y assurer leurs rôles
Les enzymes non plasmatiques:
 pas de rôle physiologique
 leur concentration y est bien plus faible qu'au sein des tissus où elles exercent leur
activité
 leur présence en faible concentration dans la circulation générale résulte du
renouvellement cellulaire normal
 la concentration plasmatique de certaines d'entre elles est susceptible d'augmen­ter
dans certaines circonstances pathologiques
4 Les enzymes non plasmatiques: 2 sous-
groupes
Les enzymes de sécrétion:
 proviennent de glandes exocrines
 peuvent avoir un intérêt clinique lorsque leur concentration plas­matique augmente ou diminue
 activités enzymatiques éle­vées si leur mode d'excrétion usuel blo­qué ou si la quantité d'enzyme
produite est augmentée
 diminutions de ces enzymes si les tissus qui les produisent présentent des diminutions d'aptitude
fonction­nelle. (ex: amylase et la lipase pancréatiques)
5
Les enzymes non plasmatiques: 2 sous-
groupes
Les enzymes du métabolisme cellulaire :
 concentrations intratissulaires 100 à 1000 x plus élevées que celles retrouvées dans la
circulation générale.
 si dommages cellulaires (altération de la perméabilité membranaire = cytolyse) ou nécrose:
changement brutal de leurs concentra­tions dans le plasma
 Ex: CK, LDH, ALT, AST
 si augmentation d'une activité enzymatique dans le plasma: indicateur très sensible de
dommages cel­lulaires minimes (hypoxie tissulaire, infection, inflammation…)
 une enzyme localisée au niveau de la membrane plasmique ou dans le cytosol est un
indicateur plus sensible de dommages cellulaires qu'une enzyme localisée dans un compar­
timent subcellulaire (mitochondrie) qui sera libérée plus tardivement
 la présence dans le plasma d'enzymes mitochondriales est le reflet de lésions cellu­laires
plus importantes
6 Pourquoi enzyme = marqueur?

 dépend d'un certain nombre de facteurs

 distribution d'une enzyme donnée dans des tissus différents
 la masse que représente l'organe atteint associée à l'importance du gradient de
concentration entre les cellules et le plasma, influence de façon fondamentale le degré
d'augmentation de l'enzyme dans la circulation générale
 !!! souvent manque de spécificité vis-à-vis d'un tissu ou d'un type cellulaire mais présents
dans des proportions variables
Ex: aspar­tate aminotransférase et l'alanine aminotransférase : enzymes présentes dans
le muscle cardiaque, le muscle squelettique et les hépatocytes mais l'alanine ami­
notransférase n'est présente qu'en faible quantité dans les cellu­les musculaires mais plus
élevée dans les hépatocytes
7 Pourquoi enzyme = marqueur?

 différentes formes d'enzyme qui catalysent la même réaction peuvent présenter des
différences de propriétés physicochimiques mais également des différences de propriétés
catalytiques
 le diagnostic d'une pathologie est basé sur l'association d'un examen clinique à d'autres
examens complémentaires
 les résul­tats d'activités enzymatiques doivent être associés à ceux d'autres marqueurs
biologiques pour leurs interprétations
8 Mesure d’une activité enzymatique

 mesure d'une vitesse réactionnelle qui peut être suivie par la consommation de substrat par
unité de temps ou par la vitesse d'apparition d'un produit de réaction
 E+S -> ES-> E+P
 les méthodologies utilisées en enzymologie clinique permettent de suivre l'évolution de la
cinétique réactionnelle par des mesures de signaux analytiques effectuées à des intervalles
de temps définis
 réalisées le plus souvent en spectrophotométrie par un suivi de changement d'absorbance à
une longueur d'onde caractéristique du consti­tuant à mesurer
9 Mesure d’une activité enzymatique

 la vitesse réactionnelle, mesurée en excès de substrat, n'est pas constante en fonction du

temps.
 incubation préalable des réactifs à la température de mesure.
 phase linéaire au cours de laquelle le changement d'absor­bance par unité de temps est
maximal et constant, puis phase de déplétion de substrat au cours de laquelle on observe
une décroissance du signal analytique
 La mesure d'une activité enzymatique doit être réalisée pen­dant la phase linéaire car la
vitesse réaction­nelle est proportionnelle à la concentration en enzyme présente dans le
milieu réactionnel
10 Mesure d’une activité enzymatique
11 Mesure d’une activité enzymatique
 un certain nombre de réactions enzymatiques s'accompagnent de la conversion de NAD(P)
+ en NAD(P)H,H+, ou vice versa : propriétés spectrales différentes. La conversion d'une
forme en l'autre forme peuvent être aisément suivis à la longueur d'onde 340 nm (si
formation de NAD(P)H,H+: augmentation d'absorbance à 340 nm; si consommation de
NAD(P)H,+H : diminution d'absorbance à 340 nm)
 couplage de la réaction catalysée par l'enzyme à mesurer à une deuxième réaction cata­
lysée par une autre enzyme qui utilise le produit de la première réaction comme substrat: la
consommation d'un cosubstrat ou l'apparition d'un pro­duit est directement mesurable en
spectrophotométrie = réaction indicatrice (ex: réactions d'oxydo-réduc­tion utilisant le
système NAD+/NADH ou NADP+/NADPH,H+ sont fréquemment utilisées)
ex: dosage CK, aspartate aminotransférase, alanine aminotransférase
 certaines enzy­mes catalyse hydrolyse sont mesurées par le suivi de la libération de 4-
nitrophénol (ou de dérivé du 4-nitrophénol} comme produit de réaction (absorbance vers
405-4O nm)
ex: phosphatase alcaline, y-glutamyltransférase
12 Facteurs influençant les réactions
enzymatiques:
 la nature et la concentration du substrat
 le pH du substrat
 la nature du tam­pon
 la présence et la concentration de coenzymes et d'autres effecteurs
 la température de déroulement de la réaction
13 Facteurs influençant les réactions
enzymatiques:
 le diagnostic et le suivi d'affections aiguës ou chroniques peuvent être réalisés à n'importe
quel moment de la journée et ne dépen­dent que de la vitesse d'apparition de l'enzyme dans
le plasma, de la persistance de l'atteinte et de la demi-vie plasmatique de l'enzyme
 le moment où le prélèvement sanguin est réalisé par rapport à l'atteinte tissulaire. Un
prélèvement trop précoce peut avoir lieu avant que l'enzyme n'ait pu atteindre la circulation
sanguine ; s’il est trop tardif, l'enzyme peut avoir disparu de la circulation générale
 la qualité du prélèvement est importante: hémolyse
 la stabilité des enzymes habituellement peu critique (souvent stables 2 à 3 jours, voire,
dans certains cas 1 semaine à température ambiante après avoir décanté le plasma)
 L’âge (significatif suivant 3 périodes de la vie: enfant, adolescence, vieillissement)
 Sexe (masse musculaire , exercice physique)
 Origine ethnique
14 Activités enzymatiques fréquemment
déterminées:
 aminotranférases
 lactate déshydogénase
 créatine kinase
 la phosphatase alcaline
 la y-glutamyltransférase,
 α-amylase
 lipase
15 Activités enzymatiques fréquemment
déterminées: pq?
 présentent des spécificités tissulaires variables
 sont susceptibles d'être libérées dans le plasma dans différentes situations pathologiques
 augmentation de la concentration plasmatique d'une enzyme donnée peut être due à des
atteintes de tissus et d'organes différents
16 Créatine Kinase (CK):

 catalyse la phophorylation réversible de la créatine par l'ATP

 présente en quantité variable dans différents tissus
 dans le muscle squelettique (mise en réserve et la mobilisation d'énergie)>
 le cerveau > le tissu cardiaque > d'autres tissus
 association de sous-unités B (pour Brain) et de sous-unités M (pour Muscle)
 3 isoenzymes la CK-BB (CK-1), la CK-MB (CK-2) et la CK-MM (CK-3): diffèrent par
leurs répartitions tissulaires
17 Créatine Kinase (CK):
 La CK-1 prédomine en proportion d'activité CK totale dans le cerveau, la prostate, le
tractus digestif, la vessie, l'utérus, la thyroïde et le placenta
 La CK-3 prédomine dans le muscle squelettique et le muscle cardiaque
 La CK-2 est absente ou présente en faible proportion dans de nombreux tissus, en dehors
du muscle cardiaque (environ 20 % de l'activité CK totale)
 Dans le plasma de sujets sains, l'activité CK est principalement de type MM (CK3) et la
concentration d'activité CK totale varie en fonction de la masse musculaire des individus
(âge, sexe)+ augmente en cas d'exercice musculaire intense
 Dans des situations pathologiques, les activités CK plus élevées dans le plasma lors
d'atteintes du muscle squelettique (myopathies congénitales, rhabdomyolyses,
écrasements musculaires importants) pour CK1 ou du muscle cardiaque (infarctus du
myocarde) pour les activités CK 3 et 2
 Augmentation d'activité CK plasmatique également rencontrées chez des patients atteints
d'hypothyroïdie ou de pathologies néoplasiques
18 Créatine Kinase (CK):

 Seule la CK-2 (CK MB) est déterminée en enzymologie clinique de routine

 Sa mesure peut être réalisée par immunoinhibition en présence d'anticorps anti-M, en se
basant sur le fait que l'isoenzyme BB (CK-3) est présente en très faible concentration dans
le plasma

 En raison d'une meilleure sensibilité, on détermine l’isoenzyme CK-3 d'origine cardiaque

en concentration de masse par immunodosage
19 Lactate déshydrogénase (LDH):

 catalyse l'oxydation du lactate en pyruvate en présence de NAD+ avec formation de

NADH,H+ et réversiblement, l'équilibre réactionnel étant fonction du pH et des
isoenzymes présents
 enzyme composée de 4 sous­unités de deux types (M et H) donnant lieu à la formation de
cinq isoenzymes de mobilité électrophorétique différente LDH-1 (H4), DH-2 (H3M),
LDH-3 (H2M2), LDH-4 (HM) et LDH-5 (M4)
 enzyme ubiquitaire(présente dans toutes les cellules de l'organisme au niveau du cytosol)
 certains tissus contiennent une quantité importante d'activité LDH : le foie, le muscle
squelettique, le cœur, le rein et les érythrocytes.
 ces différents tissus présentent des différences de composition en isoenzymes
 Lactate déshydrogénase (LDH):
 toute cytolyse, quelle qu'en soit l'origine, entraîne une libération de cette enzyme dans la
20 circulation générale
 son élévation dans le plasma est un signe sensible et précoce d'une lésion tissulaire, même
modérée et cliniquement silencieuse
 peu spécifique, ce marqueur peut être déterminé en première intention à titre de dépistage,
mais il doit être associé en cas d'augmentation à d'autres marqueurs biologiques pour
orienter le diagnostic
 élévations importantes d'activité LDH sont observées suite à
 un infarctus du myocarde (tardivement)
 la plupart des atteintes hépatiques (les hépatites aiguës)
 Des anémies mégaloblastiques et hémolytiques
 une atteinte pulmonaire sévère (infarctus pulmonaire, œdème aigu du poumon,
pneumopathie infectieuse)
 une nécrose musculaire (traumatique)
 un infarctus rénal
 nombreux processus néoplasiques (malgré un manque de spécificité, souvent
utilisé comme marqueur de surveillance en onco-hématologie)
21 Phosphatase alcaline (PAL):
 catalyse l'hydrolyse de liaisons ester phosphorique d'une large variété de substrats
 localisée au niveau de la membrane cytoplasmique dans de nombreux tissus de l'organisme
 présente en grande quantité dans l'épithélium intestinal, les tubules rénaux, l'os
(ostéoblastes), le foie et le placenta
 codée par trois gènes différents: un gène intestinal, un gène placentaire et un gène non
intestinal non placentaire codant pour les isoformes osseuse, hépatique et rénale
 les isoformes qui prédominent dans le plasma de sujets sains sont principalement d'origine
hépatique et osseuse, avec une forte variabilité en fonction de l'âge pendant la période de
croissance osseuse
 le dernier trimestre de la grossesse s'accompagne d'une augmentation de la concentration
en activité PAL totale dans le plasma, du fait de la présence de l'isoforme placentaire
22 Phosphatase alcaline (PAL):

 augmentation de PAL dans le plasma dans les pathologies hépatobiliaires (obstruction

biliaire) et les pathologies osseuses
 détermination de l'activité PAL présente un intérêt certain dans l'exploration biologique des
ictères
 élévations plus modérées lors d'ostéomalacie ou d'hyperparathyroïdies (primaire ou
secondaire) +augmentations transitoires peuvent être retrouvées lors de la consolidation de
fractures osseuses
 peuvent être libérées dans la circulation générale lors de pathologies malignes autres que
hépatiques ou osseuses
23 Phosphatase alcaline (PAL):

 En enzymologie clinique de routine, l'objectif principal est de différencier une

augmentation d'activité PAL d'origine hépatobiliaire d'une augmentation d'origine osseuse
 On associe la détermination de l'activité PAL à d'autres marqueurs de pathologies
hépatiques (GGT, bilirubines, aminotransférases)
 Seule l'isoenzyme osseuse est habituellement dosée, par méthode immunométrique,
comme marqueur de l'activité ostéoblastique
24 y-glutamyltransférase (GGT):

 catalyse le transfert d'un groupement y-glutamyl vers un accepteur d'acides aminés

 présente dans le cytosol, mais surtout localisée au niveau de la membrane cellulaire où elle
joue un rôle dans le transport de peptides
 elle intervient en particulier dans le métabolisme du glutathion
 Plusieurs isoformes mais sans spécificité tissulaire
 présente dans de nombreux tissus, excepté le muscle squelettique et le muscle cardiaque
 en forte quantité dans le foie, le rein, le pancréas et l'intestin
 l'activité GGT dans le plasma de sujets sains est principalement d'origine hépatobiliaire
25 y-glutamyltransférase (GGT):

 test sensible pour mettre en évidence une atteinte des capacités excrétrices ou de l'intégrité
structurale du foie
 son augmentation débute avant celle d'autres enzymes telles que la PAL et persiste plus
longtemps
 utile pour préciser l' origine d'une augmentation de l'activité plasmatique de la PAL, la
GGT restant normale lors de pathologies osseuses
 concentrations élevées de GGT présentes dans le plasma en cas de cirrhose alcoolique mais
également chez des consommateurs abusifs de boissons alcoolisées, par induction
enzymatique et en absence de dommages hépatiques
 la détermination de l' activité GGT présente une certaine utilité pour le suivi d'un sevrage
alcoolique
26 a - Amylase et lipase:

 enzymes digestives principalement mesurées dans le plasma pour l'investigation de

pathologies inflammatoires du pancréas exocrine
 a –amylase
 enzyme qui joue un rôle essentiel dans la digestion des glucides (hydrolyse des
liaisons a-1,4-glucosidiques à l'intérieur de polysaccharides tels le glycogène et
l'amidon, pour donner lieu à la libération de molécules plus petites comme glucose,
maltose et dextrines)
 quantités importantes le pancréas et les glandes salivaires, avec différentes isoformes
(Le pancréas exocrine synthétise l’amylase de type P qui est secrétée dans la lumière
intestinale; les glandes salivaires libèrent l’amylase de type S qui initie la digestion des
polysaccharides alors que les aliments se trouvent encore dans la bouche ou dans
l'œsophage)
27 a - Amylase et lipase:

 lipase
 enzyme secrétée par le pancréas qui joue un rôle fondamental dans la digestion des
triglycérides à chaînes longues, dont elle hydrolyse les liaisons ester en position 1 et 3
pour libérer deux acides gras et un 2-monoglycéride qui sont absorbables
 mesures d'activités amylasique et lipasique dans le plasma concernent principalement le
diagnostic d'une pancréatite aiguë, en présence d'un syndrome abdominal aigu
 par rapport à l'amylase, la lipase augmente plus précocement, de façon beaucoup plus
importante et persiste plus longtemps
28 a - Amylase et lipase:

 diverses autres causes d'augmentation d'activités plasmatiques concernent l'amylase et non

la lipase : les atteintes des glandes salivaires (oreillons, parotidites, trauma­tisme crânien...)
s'accompagnent d'une libération d'isoformes detype S de l'amylase dans la circulation
générale. Il en est de même lors de certaines atteintes gynécologiques (salpingite, grossesse
extra-utérine...)
 des élévations d'activité amylasique (le plus souvent de type S) sont observées au cours de
certains processus néoplasiques touchant par exemple l'ovaire, la prostate ou les bronches
 la détermination de ces deux enzymes est le diagnostic d'une pancréatite aiguë
 la sensibilité et la spécificité cliniques de la mesure de la lipase sont supérieures à celles de
l'amylase