1

Buts du cours
• Reconnaître les enzymes par leur rôle et fonction

• Reconnaître les différents mécanismes d’inhibition

• Étudier l’activité enzymatique

• Utilité

• Fonctionnement général

• Mesure et calcul en UI

2
Les enzymes
Une enzyme est une protéine qui a un rôle de catalyseur. Presque tous les processus
métaboliques de la cellule ont besoin d'enzymes pour se dérouler à une vitesse suffisante pour
maintenir la vie.

Une protéine est une macromolécule confectionnée de successions d’acides aminés,

liés ensembles par des liaisons peptidiques.

Un acide aminé est une molécule qui a cette

structure, où le groupement R est différent pour chaque
acide aminé.
Les enzymes: classification
Groupe Classe Type de réaction

1 Oxydo-réductase Transfert d’électrons

2 Transférase Transfert de groupements chimiques

3 Hydrolase Réaction d’hydrolyse

Ajout ou retrait de double liaison

4 Lyase

Transfert de groupements entre isomères

5 Isomérase

Réaction de synthèse (C-C, C-S, C-O, C-N)

6 Ligase
4
Les enzymes
En biochimie, plusieurs enzymes peuvent être analysées.
Enzyme (acronyme) Présence Lien / Indicateur Méthode d’analyse

Concentration proportionnelle
Alanine aminotransférase à un problème hépatique
(ALT) Dosage sanguin :
Lors du bilan hépatique
Foie, Cinétique sans
[ALT] > [AST] = Maladie du
reins, cœur, muscles PyrPO4 (multianalyseur)
Aspartate foie
aminotransférase [ALT] < [AST] = Maladie
(AST) des muscles
Haute concentration :
Créatine phosphokinase symptôme d’un infarctus du
Cerveau, cœur, muscles
(CPK) myocarde ou de dommage
musculaire Dosage sanguin :
Cinétique (multianalyseur)
Gamma-glutamyl
Concentration proportionnelle
transférase Tubules rénaux, foie
à l’ingestion d’alcool
(GGT)
Indicateur de plusieurs
Dosage sanguin :
Lactate déhydrogénase problèmes : Cancer du foie
Presque tous les tissus Néphélométrie
(LDH) métastasé, leucémie,
cinétique (multianalyseur)
hépatite, etc.
Les enzymes La α-glucosidase, qui
transforme le maltose en
Les enzymes comportent énormément d’acides aminés, ce qui glucose
en fait d’énormes molécules qui peuvent se replier sur elles-
mêmes afin d’avoir une forme 3D particulière.

Les enzymes sont très spécifiques : elles catalyseront la réaction

chimique de réactifs très précis. Cette sélectivité se base sur un
principe souvent appelé clé-serrure (lock and key). La forme de
l’enzyme étant si particulière (serrure), peu de réactifs peuvent
interagir avec l’enzyme (clé).
Les enzymes
Les études récentes ont plutôt montré qu’il y a un signal chimique à l’approche du réactif : l’enzyme
modifie sa forme 3D afin de réagir avec le réactif. Ce phénomène est l’

Ajustement induit

Également, un enzyme peut avoir plusieurs sites actifs (réagir avec plusieurs équivalents de réactif à la
fois).
Les enzymes
Certaines enzymes seront des protéines sans structure quaternaire. Ainsi, elles ne sont formées
que d’une seule unité et comportent généralement un seul site actif.

D’autres enzymes seront des protéines avec structure quaternaire. Formée de plusieurs unités,
elles comportent plusieurs sites actifs et généralement, des sites allostériques. Ces sites
accueillent un activateur allostérique qui rendent accessible le site actif au substrat.

Site actif
tordu

Activation allostérique
Les enzymes
Certains substrats, pour être traités par une enzyme, doivent être combinés à une coenzyme.
Une coenzyme participe à la réaction catalytique. Cette dernière peut se lier à l’enzyme de
manière durable (la coenzyme sera alors un groupement prosthétique) ou de manière
éphémère.

Les cofacteurs les plus courants sont des ions métalliques ou des métaux et ils interviennent dans les
réaction d’oxydoréduction. Par exemple, le Zn2+ est un cofacteur pour l’anhydrase carbonique, qui est
responsable du maintien du pH sanguin.
Les enzymes
Les enzymes
Chaque enzyme possède une température et un pH où son activité est optimale. Dans le corps
humain, les enzymes préfèrent majoritairement une température de 37°C et un pH de 7,4.
Cependant, certaines enzymes (phosphatases acides, pepsine) travaillent de manière optimale
à un pH acide alors que d’autres (arginase, phosphatases alcalines), à un pH basique.

Amylase

Activité enzymatique
Activité enzymatique

salivaire

Pepsine

Acide Basique
Les enzymes michaeliennes
Une enzyme michaelienne est une enzyme qui réagit selon cette
équation :

La cinétique de Michaelis-Menten est un modèle de cinétique des enzymes selon lequel la concentration
du substrat détermine l’activité de l’enzyme.

Une enzyme michaelienne est une enzyme dont la concentration en substrat détermine l’activité. Elles
ne peuvent avoir qu'une structure tertiaire, soit un seul site actif qui réagira avec un seul substrat. La
cinétique de cette enzyme aboutit à un état stationnaire avec une vitesse maximale.

Ainsi, les enzymes michaeliennes n’ont pas de structure quaternaire car constituées d’une seule unité,
portant un seul site actif (pas de site allostérique).
Les enzymes : cinétique
L’activité enzymatique permet de mesurer le travail des enzymes (efficacité). On mesure souvent l’activité
enzymatique par :

• La disparition du substrat (S);

• La quantité du complexe Enzyme-Substrat (ES)
• L’apparition du produit (P) généré (le plus utilisé);
• La quantité d’enzyme (E) libre;
Les enzymes : cinétique
 L’activité enzymatique augmente avec la concentration du substrat jusqu'à ce que tous les sites actifs
aient liés leur substrat en même temps (activité maximale).

En laboratoire, on mesure l’activité enzymatique

en ordre zéro. Ceci implique que la vitesse est
constante car l’enzyme est en présence d’un
excès de substrat.

Ainsi, l’activité enzymatique (la performance de

l’enzyme) ne dépend que de deux choses :
• La quantité d’enzyme
• La performance de l’enzyme (son turn-over
number)
Les enzymes : cinétique Substrat

[Substrat] faible [Substrat] élevée

Les enzymes : cinétique
Ordre zéro, ordre un… Qu’est-ce que c’est?

Réaction d’ordre zéro Réaction d’ordre un

V V

t t
C C
de de
P P

t t
Les enzymes : cinétique
L'activité enzymatique est une mesure de la quantité d'enzymes active dans une préparation. L'unité
d'activité enzymatique (U) est définie en terme de quantité de substrat disparaissant par unité de temps
ou de quantité de produit apparaissant par unité de temps.

L’unité officielle est le katal (kat), ou ses dérivés (mkat, nkat, etc.) et est l'unité suggérée par l'Union
internationale de biochimie; elle s'exprime en termes de mol/sec. Cette unité est cependant peu
employée.

On voit beaucoup plus souvent des U exprimées en µmol/min ou mmol/min. Les autres unités de
quantité de matière (g, mg, etc.) ou de temps (heures, jour) ne sont habituellement pas utilisées.

L’unité internationale de l’activité enzymatique est le µmol/min, traduisant la quantité d’enzyme

susceptible de transformer 1 micromole de substrat par minute.

Pour des solutions contenant des enzymes, on peut également exprimer des activités volumiques en
terme d'U/mL. L'activité spécifique des préparations plus ou moins purifiées s'exprime souvent en U/g
de protéines. Si on veut comparer la quantité d'activité entre deux tissus, on utilise généralement les
U/g de tissu.
Mesure de l’activité enzymatique
Méthode générale par absorbance
La méthode générale est donc basée sur l’absorbance d’un faisceau lumineux,
qui est régie par la loi de Beer-Lambert :

A = Absorbance = log (I/I0)

A = εlC ε = Coefficient d’extinction molaire
l = Longueur de la cuvette
C = Concentration
Les enzymes : cinétique
Pour exprimer l’activité enzymatique :

Vitesse = ΔA/min x volume final

𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇
(en ) ε x10-6 volume sérum
min�𝐿𝐿

Puisque la quantité d’enzyme varie selon le volume, on quantifiera souvent l’activité

enzymatique par litre (L). Donc, le calcul se fait en UI/L (donc en µmol par minute par litre).

Généralement analysée par absorbance, △A = A1 – A2, soit la différence d’absorbance à deux

moments. ε correspond au coefficient d’extinction molaire de la substance analysée (même
que Beer-Lambert).

Les volumes final et de sérum sont utilisés afin de faire une proportion adéquate entre le
volume analysé et ce qui est requis par le système international (par litre).
Volume final = Volume total dilué après addition de l’enzyme
Volume sérum = Volume de sérum contenant l’enzyme (avant dilution)
Les enzymes : cinétique
1,0 mL de solution tamponnée contient du substrat en excès et 50 µL de solution d’enzymes.
Après 5 min de réaction, une couleur se développe et l’absorbance augmente linéairement de
0,2 à 1,4. L’absorptivité molaire du produit est de 6200 L/mol⋅cm, alors que les mesures ont été
effectuées avec une cuvette de 1 cm de largeur. Calculez :
a) Le taux de changement de concentration;
b) l’activité enzymatique en unités internationales (UI).
Les inhibiteurs
Un inhibiteur enzymatique est une substance qui se lie à une enzyme
provoquant la diminution de son activité. Un inhibiteur peut empêcher la fixation du
substrat sur le site actif en se fixant à sa place (inhibition compétitive), ou provoquer
une déformation de l'enzyme qui rend celle-ci inactive (inhibition non-compétitive).
L'inhibiteur non-compétitif modifie la
forme tertiaire de l'enzyme, ce qui
modifie le le site actif. le substrat ne
peut pas se lier au site actif déformé.
Ainsi, l'augmentation de la
concentration du substrat n'accélère
pas l'activité enzymatique, ce qui a
normalement lieu lorsqu’il n’y a pas
d’inhibiteur.
L’inhibiteur non-compétitif est donc un…
Inhibiteur allostérique
Les inhibiteurs
Inhibition compétitive
Substrat
Inhibiteur

Site actif

Enzyme

Inhibition non-compétitive Substrat

Inhibiteur

Site
Site actif
allostérique
Inhibition compétitive: exemple
Le méthotrexate se lie à la DHF reductase pour l’empêcher de réduire l’acide folique. Puisque les cellules
cancéreuses contiennent plus d’enzyme DHF reductase que les cellules saines (car elles se multiplient
davantage ), le médicament est plutôt spécifique aux cellules cancéreuses.

DHF-reductase

Acide dihydrofolique (le dihydrofolate est simplement la forme déprotonée)

Méthotrexate (MTX), un agent de chimiothérapie. 1000x plus de fixation que le dihydrofolate.

23
https://www.youtube.com/watch?v=igat8-fRZFY
Les inhibiteurs
*note ajoutée après coup… j’expliquerai KM dans 4 diapos…

Sans inhibiteur
En inhibition compétitive: KM varie (augmente);
Avec inhibiteur
 Vmax est le même; compétitif
 Une augmentation de la concentration de [S] diminuera
l’impact de l’inhibition.
En inhibition non-compétitive: KM ne varie pas;
 Vmax diminue;
 Une augmentation de concentration de [S] n’empêche
pas l’inhibition.
Avec inhibiteur
Vitesse de réaction

non-compétitif

Concentration du substrat
La régulation allostérique (activation ou inhibition)
L’inhibiteur
allostérique est
parfois le produit de
la réaction.

Dans ce cas, une

concentration
critique de produit
inhibe la réaction.
Les enzymes allostériques

Une enzyme allostérique est une enzyme ayant une courbe de cinétique sigmoïde et dont
l'activité peut être modifiée par un effecteur allostérique. En se liant à un site autre que le site
actif, l'effecteur induit un changement de configuration de l'enzyme. Il faut donc que l'enzyme
possède une structure quaternaire.

1 site actif 1 site actif

1 site allostérique
Les enzymes : la constante catalytique
Les enzymes sont également caractérisées par leur constante catalytique, appelée Turnover
Number (TON) en anglais.

La constante catalytique (kcat) d’une enzyme correspond au nombre maximum

de conversions de molécules réactif qui sont catalysées par site actif et par seconde pour
une concentration totale d'enzyme spécifique.

Loi de vitesse

L’anhydrase carbonique, qui transforme le CO2 en H2CO3 et est localisée à la surface

plasmique intracellulaire des globules rouges, a une constante catalytique allant de 4 x 105 à 6
x 105 s-1. Ceci veut dire qu’une molécule de cette enzyme peut transformer de 4 x 105 à 6 x 105
molécules de CO2 par seconde.
Cinétique des réactions enzymatiques
L’équation de Michaelis-Menten est utilisée afin de décrire l’activité enzymatique sur un
substrat:
𝜐𝜐𝑖𝑖 = vitesse initiale, en unité de conc. par unité de temps
𝜐𝜐𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 = vitesse pour une conc. saturante de réactif
𝜐𝜐𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 � 𝑆𝑆 𝑆𝑆 = Concentration du réactif
𝜐𝜐𝑖𝑖 =
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 𝐾𝐾𝑀𝑀 = Constante de Michaelis (𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩𝐩 à 𝒍𝒍′ 𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞𝐞)

La constante de Michaelis (KM)

Correspond à la concentration à laquelle la catalyse est au maximum de son efficacité.
Correspond donc à la concentration de substrat à laquelle la vitesse de réaction est ½vmax.

•Plus le Km est élevé, plus la concentration du réactif doit être élevée afin que l’enzyme ait une
activité catalytique maximale. Cela traduit en général une faible affinité de l'enzyme pour son
substrat.
•Plus le Km est faible, moins la concentration du réactif doit être élevée afin que l’enzyme ait
une activité catalytique maximale. Il s'agit en général d'enzyme sélectives et/ou très actives.

KM de la β-Galactosidase, qui aide à la digestion du lactose est de 4000 µmol/L.

Cinétique des réactions enzymatiques
 Une façon de déterminer expérimentalement la constante de Michaelis est à partir d’un
graphique :
= 4 µmol/L•s

Vitesse de la réaction
= 2 µmol/L•s

Concentration du réactif

𝜐𝜐𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 � 𝑆𝑆 𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇 𝑆𝑆
(4
𝐿𝐿 � 𝑠𝑠 ) �
𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇𝜇 𝑆𝑆
𝜐𝜐𝑖𝑖 = 2 = 0,5 =
𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 𝐿𝐿 � 𝑠𝑠 𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆

𝑆𝑆
𝐾𝐾𝑀𝑀 = 𝑆𝑆 𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 = 2 𝑆𝑆 𝐾𝐾𝑀𝑀 + 𝑆𝑆 =
0,5

Bref, KM = la concentration du substrat lorsque la vitesse de la réaction est la

moitié de la vitesse maximale.
Cinétique des réactions enzymatiques
Une des utilités de la constante de Michaelis-Menten (Km) est de s’assurer qu’on est en
conditions ordre 0 (l’enzyme est saturé de substrat).
En cinétique enzymatique, on détermine dans un premier temps le Vmax de l’enzyme.
Une fois cette valeur connue, on détermine la quantité de substrat qu’il a fallu ajouter pour
atteindre la moitié du Vmax (ce qui correspond à la constante de Michaelis-Menten ou Km, soit la
concentration de substrat requise pour atteindre la moitié de la vitesse maximale). En
multipliant le Km par 100, l’enzyme se retrouvera à coup sûr en ordre 0.

Dépend de Km V
Bas km : meilleure
attraction entre E et S

Dépend de Kcat
[S]
Haut kcat : production
rapide de P
Les enzymes
Maladie lysosomale : quand les enzymes font défaut

Le lysosome contient les enzymes suivantes :

• Lipases, qui dégradent les lipides en acides gras
• Glycosides hydrolases, qui dégradent les glucides
• Protéases, qui dégradent les protéines
• Nucléases, qui dégradent les acides nucléiques

Exemple de maladie lysosomale : La maladie de Fabry

Déficit en enzyme alpha-galactosidase A, chargé de dégrader le globotriaosylcéramide, une
sorte de lipide.
Un des symptômes : mauvaise irrigation des petits vaisseaux sanguins, bloqués par le cumul
de lipides