BIOCHIMIE

PASS – LAS 2023-2024

Option Santé
ENZYMOLOGIE
D. MASSON
• De Chimie à la Biochimie – Cours d’introduction D. Masson
• Acides aminés et protéines 1 CM M. Denis
• Glucides 1 CM G. Herbreteau
• Acides aminés et protéines CM M. Denis
• Enzymes et coenzymes CM D. Masson
• Glucides 2 CM D. Masson
• Lipides et lipoprotéines CM F. Nazih & K. Bach
• Applications médicales ED D. Masson & M. Duflot
 Apport de la Biochimie
• Un point commun entre ces technologies :
• Outil d’exploration – ex : Le dosage du Glucose
Une réaction de transformation du glucose
Capteur Freestyle Abbott
catalysée par une enzyme

• L’outil du patient

Glucose + O2 → Ac. Gluconique + H2O2

Ou
• L’outil des laboratoires
Glucose + ATP → Glucose-6-Phosphate + ADP

Suivie d’une seconde réaction produisant un

métabolique quantifiable par spectrophotométrie
ou 1 e-
 Apport de la Biochimie
• Outil de compréhension des mécanismes d’action de médicaments
• Les inhibiteurs enzymatiques

• Nombreuses classes thérapeutiques

• Hypocholestérolémiants
• Antibactériens
• Antiviraux
• Antihypertenseurs
• Anti inflammatoires
• Anti-cancéreux
• …
 Plan du cours « Enzymologie »
• Généralités, définition et classification des enzymes

• Cinétique des réactions enzymatiques à 1 substrat

• Influence de la concentration en enzyme
• Influence de la T° et du pH
• Influence de la concentration en substrat
• Paramètres cinétiques
• Mesure d’activité enzymatique
• Isoenzymes
• Enzymes à cinétique non michaélienne

• Régulation du métabolisme par la régulation de l’activité enzymatique

• L’inhibition enzymatique
• L’inhibition compétitive
Enzymologie – Importance en Médecine
• Médicaments
• Enzymes médicaments : Rares ex. Uricase
• Médicaments inhibiteurs d’enzymes : Nombreux cf. cours introduction
• Pathologies
• Déficit partiel ou total
• Erreurs innées du métabolisme
• Dépistage néonatal :
• Phénylcétonurie, Hyperplasie des surrénales …
• …
• Outil d’exploration
• Substrats
• Enzymes
• Compréhension de mécanismes de physiologie et physiopathologie
Enzymes : définition & fonctions
• Protéines qui jouent un rôle de catalyseurs dans les réactions du métabolisme

• Protéines agissant à des concentrations très petites, qui augmentent la vitesse

des réactions chimiques, sans en modifier le résultat.

• A la fin de la réaction, la structure de l’enzyme se retrouve inchangée.

• En l’absence d’enzymes, la vitesse des réactions est incompatible avec la vie

cellulaire

• Orientation métabolique
• Efficacité
• Pas de sous-produit ou de réactions secondaires
 Enzymes : Eléments structuraux
• Protéines Site actif de la
• Enzymes de nature entièrement protéique Glycogénine
• Enzymes composées de 2 parties distinctes :
• Partie protéique : apoenzyme
• Partie non protéique : groupement prosthétique
• Eléments ou cofacteurs associés
• Cofacteurs de nature organique (Coenzymes)
• Molécule d’hème
• Ions métalliques
• Dissociable (Ca) ; Liaison forte (Fe, Zn, Cu, Ni, Mn, Mg …)
• Le site actif
• Partie de l’enzyme susceptible de fixer le substrat par interactions faibles
• Volume tridimensionnel faisant intervenir des AA
• 2 parties au sens fonctionnel : Site de liaison (reconnaissance, le maintien
et l’orientation) + Site catalytique
 Spécificité - double
• Spécificité de réaction
• Chaque enzyme ne catalyse qu’un seul type de réaction

• Spécificité de substrat
• Chaque enzyme agit exclusivement sur un substrat ou des composés ayant en commun
certains éléments d’architecture moléculaire

• Niveau de spécificité
• D’ordre stérique
• Rappel : Interactions faibles indispensables pour assurer la reconnaissance, le maintien
et l’orientation du substrat
• Exemple
• Le galactose, épimère en C4 du glucose, n’est pas pris en charge par les enzymes de la
glycolyse
• La Lactate deshydrogénase (LDH) catalyse l’oxydation réversible du L-lactate en Pyruvate
 Classification des enzymes - 6 groupes
• Oxydo-réductases
• Transfert d’électrons, d’atomes d’hydrogène ou introduction d’atomes d’oxygène
• Transférases
• Transfert d’un groupement fonctionnel ou d’une molécule sous forme d’un radical
• Hydrolases
• Coupure d’une liaison par les éléments d’une molécule d’eau
• Lyases
• Réaction d’addition de groupes fonctionnels ou élimination de groupes par rupture de liaison
sans participation d’une molécule d’eau
• Isomérases
• Transfert d’un groupe fonctionnel à l’intérieur d’une molécule
• Ligases ou synthétases
• Formation de liaisons covalentes avec couplage énergétique (ATP)
 Codification internationale – classification des
enzymes
• Dénomination
• Nom usuel (ex. Trypsine) ; Nom de substrat + « ase » (ex. Uréase) ; Nom du substrat et de la
transformation réalisée + « ase » (Ex. Lactate déshydrogénase)
• Numérotation conventionnelle (Code à 4 chiffres) : 6 classes
• 1 – Type de réaction
• 2 – Le substrat métabolisé et/ou le mécanisme impliqué
• 3 – Le type d’accepteur (co-substrat / coenzyme)
• 4 – Le N° d’ordre
• Exemples
• Lactate déshydrogénase (LDH)
• EC 1.1.1.27 → L-Lactate : NAD oxydoréductase

• Glucokinase
• EC 2.7.1.2 → ATP : D-glucose 6-phosphotransférase
 Autres exemples
• Hydrolase : EC 3.2.1.108 → Lactase + H2O

Lactose + H2O → Galactose + Glucose

• Lyase : EC 4.1.1.22 → L-Histidine Carboxy-Lyase

L-Histidine → Histamine + CO2

• Isomérase : EC 5.3.1.9 → Glucose-6-Phosphate Isomérase

Glucose-6-Phosphate → Fructose-6-Phosphate

• Ligases ou synthétases : EC 6.3.2.3 → Glutathion synthétase

g-Glutamyl-L-Cystéine + Glycine + ATP → Glutathion + Phosphate + ADP (cf chapitre Glutathion)

 Plan du cours « Enzymologie »
• Généralités, définition et classification des enzymes

• Cinétique des réactions enzymatiques à 1 substrat

• Influence de la concentration en enzyme
• Influence de la T° et du pH
• Influence de la concentration en substrat
• Paramètres cinétiques
• Mesure d’activité enzymatique
• Isoenzymes
• Enzymes à cinétique non michaélienne

• Régulation du métabolisme par la régulation de l’activité enzymatique

• L’inhibition enzymatique
• L’inhibition compétitive
 Cinétique des réactions enzymatiques à un
substrat
• Protéines qui jouent un rôle de catalyseur. A la fin de la
réaction, la structure de l’enzyme se retrouve inchangée.

• On admet que l’activité catalytique est liée à la formation d’un

complexe transitoire ES

• In vitro : Mise en présence

• en milieu aqueux tamponné (pH)
• à température constante (T°)
• de quantités connues d’enzyme et de substrat ( [E] [S] )

• On suit le déroulement de la réaction

• On mesure la vitesse de la réaction (v)
• Quantité de substrat transformé par unité de temps
• Quantité de produit formé par unité de temps
 Influence de la concentration de l’enzyme
[E] T° pH [S]
• Relation linéaire
• Plus la concentration de l’enzyme est grande et
plus la vitesse initiale est grande

• Pour une concentration donnée fixe du

substrat, l’augmentation de la vitesse des
réactions enzymatique est proportionnelle à la
concentration d’enzyme :
Relation linéaire

• Application médicale +++

• détermination indirecte de la concentration
d’enzymes dans un milieu biologique
 Influence de la Température et du pH
[E] T° pH [S]
• T° : 2 composantes : Energie d’activation & intégrité structurale et
fonctionnelle de l’enzyme
• Effet N°1 : La vitesse des réactions enzymatiques augmente en fonction
de la température
• Effet N°2 : Inactivation thermique des enzymes
• Dénaturation thermique par rupture des interactions faibles qui
stabilisent la structure tridimentionnelle des protéines

• pH : 2 effets
• Modification de l’ionisation des acides aminés du site actif
• Modification des interactions avec le substrat
• Modification des efficacités catalytiques
• Aux pH extrêmes : dénaturation de la protéine et perte de
l’activité fonctionnelle
• Zone étroite 6 – 8 ou pH extrêmes
 Influence de la concentration du substrat
[E] T° pH [S]
• Plus la concentration en substrat augmente plus la vitesse initiale augmente
• Courbe d’allure hyperbolique
• V tend vers Vmax

• Vmax = vitesse de la réaction lorsque [S] tend vers l’infini

• La réaction enzymatique est saturable

• Equation de Mickaelis et Menten : v = f ([S]) Hyperbole

• On définit une constante K (constante de Michaelis : KM)

(k-1 + k2) = [E] [S] = KM
k1 [ES]
• Lorsque [S] = KM  v = ½ Vmax
2 représentations graphiques Représentation de
Lineweaver et Burk
L’originale

Relation linéaire utile à l’exploitation

des résultats expérimentaux :
1/v en fonction de 1/[S]

Lorsque [S] = KM  v = ½ Vmax

 Paramètres cinétiques
• Vitesse maximale Vmax
Constante de Michaelis KM • Vmax = vitesse de la réaction lorsque [S] tend vers
l’infini
• Dimension d’une concentration
• En situation d’excès de substrat : E « totalement »
• Correspond à [S] lorsque v = ½ Vmax sous forme ES
• KM est la constante de dissociation apparente du v = Vmax = k2 [ET]
complexe ES • k2 est appelée constante catalytique kcat(temps -1)
• KM permet d’apprécier l’affinité de l’enzyme pour
le substrat • Constante catalytique de l’enzyme kcat
• Valeurs de KM • Nombre de molécules de substrat converti en produit
• KM « petit » (KM < 10-6 M)  Forte affinité par unité de temps dans des conditions définies de T°
et de pH
• KM « grand » (10-2 < KM < 10-1 M)  Faible affinité
• Appréciation de la vitesse en fonction de [S] • Efficacité catalytique des enzymes (Vitesse &
• Si [S] <
10-2 KM  v < 0.01 Vmax Affinité)
• Si 10-1 KM < [S] < 10 KM  0.1 Vmax < v < 0,9 Vmax • kcat / KM ( peut aussi s’exprimer en Vmax/KM )
• Permet de classer différents substrats vis-à-vis d’une
enzyme en terme d’efficacité (Affinité & Vitesse)
 Activité enzymatique
• Intérêt médical
• Quelle est la concentration d’une enzyme
« E » fonctionnelle dans un milieu
biologique ?
• Conditions
• Situation où la vitesse ne dépend que de la
concentration en enzyme
• Excès de substrat : [S] >> KM
• Mesure de l’apparition du produit ou de la
disparition du substrat en début de
réaction (durant la phase stationnaire)
• Paramètres pH et température fixés
• Expression en nombres de moles
transformées par unité de temps
• Unités utilisée
Unité Internationale (UI) : quantité d’enzyme
qui catalyse la transformation d’1 µmole de
substrat par minute
• Exemple : mesure de la quantité de lipase
(enzyme pancréatique) dans le plasma d’un
patient
• Normalement : < 60 UI / L
• Si Résultat > 180 UI / L témoigne d’une
élévation de la quantité de lipase dans le
plasma, révélant une atteinte pancréatique
Cas particulier des enzymes à cinétique non michaelienne

• Cinétique non michaelienne

• Constat 1 : Courbe sigmoïde

• Constat 2 : concerne des enzymes

oligomériques

• Traduit un effet coopératif = modification de

l’affinité pour le substrat en fonction de [S]

• Résulte d’une modification de conformation

(conformations allostériques)

 Mécanisme de régulation de l’activité

Cas particulier des isoenzymes Exemple : la famille « LDH »
Lactate Déshydrogénase

• Isoenzymes : Membres d’une famille

d’enzymes

• Enzymes oligomériques
• Structure IVaire
• Catalysent la même réaction biochimique
• Diffèrent par :
• Leur composition en sous-unités
• Leur comportement électrophorétique (pHi)
• Leurs propriétés antigéniques
• Leur affinité vis-à-vis du substrat
• Fonctions
• Adaptation de l’isoenzyme exprimée au
métabolisme de la cellule
1 seule réaction catalysée
Structure IVaire : 4 sous-unités
2 types de sous-unités : M : Muscle et H :Heart
5 isoenzymes :
LDH-1 : H4
LDH-2 : H3M1 … LDH-5 : M4
Expression tissulaire différentielle
Métabolisme anaérobie : M4
Métabolisme aérobie : H4
 Plan du cours « Enzymologie »
• Généralités, définition et classification des enzymes

• Cinétique des réactions enzymatiques à 1 substrat

• Influence de la concentration en enzyme
• Influence de la T° et du pH
• Influence de la concentration en substrat
• Paramètres cinétiques
• Mesure d’activité enzymatique
• Isoenzymes
• Enzymes à cinétique non michaélienne

• Régulation du métabolisme par la régulation de l’activité enzymatique

• L’inhibition enzymatique
• L’inhibition compétitive
 Régulation du métabolisme par la régulation
de l’activité enzymatique
• Deux types de régulation

• Liée à l’équilibre de la réaction

• Dépend de la disponibilité du substrat et affinité de l’enzyme
• Si [S] << KM : La concentration du substrat régule la vitesse de transformation

• Liée à l’enzyme
• Régulation allostérique par variation de l’affinité selon la concentration en substrat (vue précédemment)
• Régulation par des effecteurs allostériques (activateurs ou inhibiteurs allostériques)
• Régulation par modification structurale de l’enzyme
• Réversible
• Irréversible
• Régulation par variation d’expression de l’enzyme
 Régulation par des effecteurs allostériques
• Sensibilité de l’enzyme à des effecteurs (régulateurs) n’ayant Ex : Protéine Kinase A
Fonction : Serine / Thréonine Kinase
aucune analogie avec le substrat Structure : Tétramère (4 sous-unités)
• Exemple de métabolites régulateurs : ATP, GTP, AMPc, AA … R – Régulatrice (n = 2)
C – Catalytique (n = 2)
Régulateur allostérique (+) : AMPc
• Fixation de l’effecteur (régulateur) allostérique Site de liaison :
• Sur un site différent du site actif Sous unité R
• Sur une sous-unité régulatrice Mécanisme
Changement de conformation qui libère le site
catalytique de C
• Le régulateur allostérique peut être un : Dissociation de R et C activée
• Activateur :
• Augmente l’affinité du substrat
• Libère le site catalytique ou la sous-unité catalytique
• Inhibiteur :
• Diminue l’affinité du substrat
 Régulation par modification structurale de
l’enzyme
• Régulation on/off (interrupteur)
• L’enzyme existe sous 2 formes : inactive et active
Phosphorylation +++
• Réaction rapide et régulée Serine, Thréonine, Tyrosine
Radical – Phosphoryl
• Par intégration d’un signal déclencheur Donneur : ATP

• Indépendant du substrat
• Modification réversible ou irréversible
• Modification post traductionnelle
• Modification covalente d’un AA
• Clivage protéolytique d’un précurseur inactif de
l’enzyme (zymogène)
Exemple : Activation du Trypsinogène
en Trypsine
 Régulation par variation d’expression de
l’enzyme
• Induction ou répression de l’expression des gènes
• Aboutit à une synthèse +/- importante de
l’enzyme

• Contrôle transcriptionnel de l’expression de

l’enzyme

• Signal : Hormone ou facteur de croissance

• Activation d’une voie de signalisation

intracellulaire

• Adaptation de la cellule et de son métabolisme

• A l’environnement
• Aux conditions métaboliques
 Plan du cours « Enzymologie »
• Généralités, définition et classification des enzymes

• Cinétique des réactions enzymatiques à 1 substrat

• Influence de la concentration en enzyme
• Influence de la T° et du pH
• Influence de la concentration en substrat
• Paramètres cinétiques
• Mesure d’activité enzymatique
• Isoenzymes
• Enzymes à cinétique non michaélienne

• Régulation du métabolisme par la régulation de l’activité enzymatique

• L’inhibition enzymatique
• L’inhibition compétitive
 L’inhibition enzymatique
• Diminution de l’efficacité catalytique en présence Les différents types d’inhibition
d’une molécule qui se fixe sur l’enzyme enzymatique

• Diminution de la vitesse par rapport à celle Inhibition compétitive

observée en présence de l’enzyme sans inhibiteur
Inhibition non compétitive pure
• Inhibiteur : Ligand de l’enzyme mais non modifié par
celle-ci Inhibition non compétitive mixte

• Site de liaison de l’inhibiteur Inhibition irréversible

• Site actif ou autre
• Interaction ou liaison covalente …

• Réversible ou irréversible
 L’inhibition compétitive (1)
• Liaison au niveau du site actif
 Analogie structurale entre S et I
 blocage du site actif
 L’enzyme ne peut plus fonctionner

• I empêche la fixation de S
 se traduit par une modification de l’affinité de
l’enzyme pour le substrat
 Augmentation de KM

• Liaison réversible de I au niveau du site actif

 L’équilibre peut être déplacé par un excès de
substrat
 L’inhibition compétitive (2)
• Nouvel équilibre

• Constante d’inhibition : Ki
• Constante de dissociation du complexe EI

• Augmentation de KM
• Dépend de [I] et Ki
• Expression de KM en présence de
l’inhibiteur

• Expression de la vitesse en présence

de l’inhibiteur (vI)
 Inhibition compétitive (3) – un exemple
• Le Methotrexate

• Antimétabolite
• Cancer, maladies auto-immunes …

• Analogue de l’Acide Folique

• Métabolite indispensable à la synthèse de
l’ADN

• Inhibiteur d’une enzyme impliquée dans la

régénération de l’acide foliques sous forme
réduite : Dihydrofolate Réductase (DHFR)

• Cytostatique spécifique de la phase S du cycle

cellulaire
 Inhibition compétitive (4) – un exemple
• Le Methotrexate

• Analyse de la représentation de Lineweaver et

Burk
• VMAX inchangée
• KM plus élevée
→ Inhibiteur Compétitif de la DHFR
• De Chimie à la Biochimie – Cours d’introduction D. Masson
• Acides aminés et protéines 1 CM M. Denis
• Glucides 1 CM G. Herbreteau
• Acides aminés et protéines CM M. Denis
• Enzymes et coenzymes CM D. Masson
• Glucides 2 CM D. Masson
• Lipides et lipoprotéines CM F. Nazih & K. Bach
• Applications médicales ED D. Masson & M. Duflot