Unité d’enseignement : méthodologique 1

Matière : Méthodes de la biologie moléculaire appliquées à l'analyse des aliments

Crédits : 4
Coefficient : 2
Contenu de la matière :
Trois axes sont abordés:
•Analyse enzymatique: rappels théoriques d'enzymologie; utilisation des enzymes
comme moyen de dosage, de diagnostic et de traçabilité; applications spécifiques en
industries alimentaires; perspectives.
•Analyse immunochimique: rappels théoriques d'immunologie; présentation des
techniques immunochimiques: principes et méthodologies (tests
immunoenzymatiques ELISA, Western blot, chromatographie à flux latéral,
agglutination, immunocapteurs ...); applications spécifiques en industries
alimentaires; perspectives.
•Techniques de génie génétique: notions théoriques; techniques d'hybridation
moléculaire et techniques PCR; applications en industries alimentaires dans les
secteurs du diagnostic moléculaire (microbiologie), de la traçabilité et de la
certification (empreintes génétiques d'ADN nucléaire ou mitochondrial;
problématique des OGM); perspectives. Réalisation et démonstration de plusieurs de
ces techniques lors de séances pratiques.
 Présenté par
Dr Rahmoun mohammed nadjib
 Introduction

Beaucoup de réactions chimiques peuvent se produire spontanément; d'autres

exigent d'être catalysées pour procéder à un rythme significatif.

Les catalyseurs sont des molécules qui permettent d’accélérer la vitesse

nécessaire pour convertir chimiquement une substance à une autre.
Thermodynamiquement, l'ampleur de cette barrière d'énergie peut être
commodément exprimée en termes de variation d'énergie libre.

Un catalyseur réduit le niveau de cette barrière du fait de son interaction avec
le substrat pour former un complexe de transition activé qui forme le produit et
libère le catalyseur. Le catalyseur n'a pas été consommé ou altéré au cours de la
réaction ainsi, en principe, il peut être utilisé indéfiniment afin de transformer le
substrat en un produit; dans la pratique, cependant, elle est limitée par la
stabilité du catalyseur, qui s’engendre dans sa capacité à conserver sa structure
active à travers le temps dans les conditions de réaction.
 Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui jouent un
rôle central dans le monde vivant. Les réactions essentielles
pour le fonctionnement d'un être vivant sont trop lentes et sans
la présence de ces catalyseurs, la vie telle que nous la
connaissons aujourd'hui ne serait pas possible.

 Qu'il s'agisse de réactions simples comme la formation de

bicarbonate à partir d'eau et de dioxyde de carbone ou de
réactions complexes comme la réplication de l'ADN, chaque
réaction chimique se déroulant au sein d'un être vivant est
catalysée par un ou plusieurs enzymes spécifiques.
 Les enzymes (étymologie levain)
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques.

Il existe deux types d'enzymes.

ex
Les ribozymes (ARN) RNA hammerhead ribozyme.
Clivage autocalytique

Ex trypsine.
Les enzymes
protéiques Protéase à serine
Structure des
enzymes

Les enzymes sont des protéines (structures tertiaires et

quaternaires).
Ils ont une forme globulaire
Une structure 3D complexe
Exemples: structure d’enzyme

La nucléase
La carboxypeptidase

La pepsine
Agissent à faible concentration
Agissent sur la vitesse de la réaction
Ne changent pas les produits de la réaction.
Se retrouvent toujours à la fin de réaction
Il est stéréospécifique du substrat
Les enzymes diffèrent des catalyseurs chimiques
classiques sur plusieurs points importants :
1.Vitesse des réactions plus grandes 1017 fois (cas de
la phosphatase alcaline).
2.Conditions de réaction plus douces.
3.Spécificité de réaction plus grande.
4.Possibilité de régulation.
 Enzyme Facteur
d'accroissement
Chymotrypsine 107

Lysozyme 2 108

Uréase 1014

Phosphatase alcaline 1017

 Diagramme énergétique sans enzyme

Sans enzyme le diagramme énergétique d'une réaction est

Pour passer de S à P il faut franchir l'énergie

d'activation DGact. Cette barrière peut ralentir
très fortement la réaction

DGact

S
DGreac<0, la réaction se fait du substrat
vers le produit

DGreac

P
 Diagramme énergétique avec enzyme

Sans enzyme

DGact, l'énergie d'activation est diminué, la

réaction est fortement accélérée.
S L'équilibre n'est pas changé
EP

ES

P
 Rôle biologique
• Les enzymes participent à la quasi-totalité
des réactions biochimiques à l’intérieur et
à proximité immédiate d’une cellule,
exemple:
• Les enzymes de l’appareil digestif
dégradent les glucides, les lipides et les
protéines qui proviennent de l’alimentation
en éléments simples.
La réaction biochimique : c'est une réaction chimique qui se déroule dans la cellule ou le
milieu cellulaire, en présence d'un catalyseur biologique (biocatalyseur), l'enzyme.
On écrira une réaction enzymatique de la manière suivante :
E
S P
Il existe essentiellement 2 grands types de réactions biochimiques :

les réactions de dégradation de la matière organique (catabolisme) ;

les réactions de synthèse de la matière organique (anabolisme).
Un substrat est une molécule transformée au cours d'une réaction
chimique.

Un produit dans une réaction enzymatique est la molécule résultante

de la transformation d'un substrat au cours de cette réaction.
 Le site actif
• Une partie d'une enzyme, le site
actif, est particulièrement
important
• La forme et l'environnement
chimique à l'intérieur du site actif
permet une réaction chimique de
procéder plus facilement.
• Le site actif d’une protéine peut
diminuer l’énergie d’activation
grâce à des acides aminés
spéciaux qui ont des
groupements fonctionnels qui
facilitent le transfert des ions
© H.PELLETIER, M.R.SAWAYA
ProNuC Database hydrogènes du substrat à
d’autres molécules et vice-
versa.

© 2007 Paul Billiet ODWS

 Les cofacteurs

A part les hydrolase, les enzymes ont parfois besoin de fixer une autre partie non
protéique pour catalyser une réaction (transfert d'électrons, de protons, d'hydrure, de
groupe phosphate,…).
Cette partie appelle cofacteurs. Cella peut être un métal, un nucléotide…

Dans ce cas la partie protéique s'appelle l'apoenzyme

La partie non protéique s'appelle le cofacteur (nécessaire à la réaction enzymatique).

L'association de la partie protéique (apoenzyme) et de la partie non-protéique

(cofacteur) constitue l'holoenzyme.

+ NADH + H+ + NAD+

glucose sorbitol
Ex Nicotinamide adénine dinucléotide NAD dans l'aldose réductase
 Les cofacteurs peuvent être labile ou fortement fixés à l'enzyme.

On appelle groupe prosthétique les cofacteurs qui sont fortement lié à l'enzyme
(parfois avec une liaison covalente).
L'enzyme les régénère à la fin de la réaction.

Le site actif de la phosphotriesterase

est constitué de 2 atomes de zinc

Les autres cofacteurs labiles se dissocient et sont régénérés par d'autres enzymes.
Ex ATP
 Les coenzymes

Si le cofacteur est d'origine organique (vitamine, nucléotide,…), le cofacteur est appelé

coenzyme.

Aldose réductase
Ex coenzyme labile: le NAD

Ex coenzyme prosthétique: Cholestérol oxydase

la Flavine adenine dinucléotide (FAD)
Le coenzyme est
profondément enfoui
dans l'enzyme.

cholesterol + O2 = cholest-4-en-3-one + H2O2

 Les enzymes sont des catalyseurs
extrêmement efficace
Le rapport kcat/Km est souvent donné comme 1010
mesure de l'efficacité catalytique, car il kcat/KM
correspond à une constante de vitesse pour de (s-1 M-1)
basses concentrations de substrat (S)
105

ADC = arginine décarboxylase 1

STN = staphylococal nuclease 1 minute
FUM = fumarase CAN
PEP = carboxypeptidase B
CMU = chorismate mutase 10-5
1 week
ANC = carbonic anhydrase CMU
100 years knon
10-10 (s-1)
t 1/2 = PEP
1 million years FUM
Source: R. Wolfenden 2001
10-15
Acc. Chem. Res. STN
4 billion years ADC

Elle peuvent accélérer une réaction des milliards de milliards de fois

 Le substrat
• Le substrat d'une enzyme sont les
réactants qui sont activés par l'enzyme
• Les enzymes sont spécifiques à leurs
substrats
• La spécificité est déterminée par le site
actif
 Les enzymes peuvent être extrêmement
spécifiques

Grace aux interaction avec les substrats (formes, géométrie, nature chimique)
Elle peuvent discriminer des formes chimiques très proche, les énantiomères …
 SPECIFICITE ENZYMATIQUE

Mode d'action des enzymes

Les protéines enzymatiques catalysent une réaction en

reconnaissant les molécules de substrat grâce à une
complémentarité de forme.
Enzymes…

 sont spécifiques à
ce qu'ils vont
catalyser.
 Adapter au
substrat comme
une clé et serrure
 Les enzymes peuvent avoir une très grande affinité pour le substrat

acétylcholine

Acétylcholinestérase de torpille

ES
 ES (DG) Ke  K d 
ES  
DG
 e RT
E S 
Grace au nombreuses interactions que l'enzyme peut faire avec le substrat
(hydrophobe, liaisons ioniques, liaisons hydrogène, …) le substrat peut être fixé
a de très faible concentration (< mM, mM) .

Une enzyme peut être très efficace à de très faible concentration.

• le modèle clé/serrure (Emil Fisher)

Enzyme Substrat Complexe Enzyme - substrat

• le modèle d’ajustement induit

(Daniel E. Koshland)

Enzyme Substrat Complexe Enzyme - substrat

 Le complexe enzyme-Substrat
• Lorsque la fonction du site
actif des enzymes interagit
avec le substrat.
• La forme du site actif
correspond à la forme de
substrats.
• Une fois le substrat et le site
actif se rencontrent une
modification de la forme du
site actif provoque une tension
qui change le substrat et
aboutis au produit final.
 le modèle clé/serrure (Emil Fisher)

S
E
E
E

Enzyme- Enzyme peut être

substrat utilisé à nouveau
complexe P

Reaction coordinnée
© 2007 Paul Billiet ODWS
 Les enzymes servent à réguler le métabolisme

On a un substrat A qui peut former le produit B,C,D,E

B
B

Grace à une enzyme, E

on peut canaliser une E A C
E A C
réaction
D
D
De plus, il faut savoir que l'activité d'une enzyme peut être régulée par des effecteurs
(inhibiteurs ou effecteur).
Les concentrations de produit ou de substrat (ou autre ligand) peuvent aussi moduler
l'activité d'une enzyme (allostérie). C'est un moyen de rétrocontrôle d'une voie
métabolique
La quantité d'enzyme est aussi régulée par la transcription.

Toute ces régulations subtiles permettent à l'organisme de contrôler le métabolisme

Tout ce que ce fixe sur une protéines est appelé ligand.
Le ligand peut être nécessaire à la réaction enzymatique, avoir un
rôle structurale ...
Cela inclus, le substrat, le produit
8. Les enzymes sont nommées selon leur
fonctions.
ex: enzymes oxydatives qui permettent les réactions
d’oxydoréduction = oxydorécuctase
Les enzymes qui catalysent l’addition d’eau = hydrolase,

Les catégories d’enzymes peuvent être;

a) absolue catalyse seulement pour une réaction.
b) groupe qui agit sur les groupement fonctionnels
c) liaison agit sur liaisons spécifiques sans égard
aux structures moléculaires.
d) stéréochimique qui agit sur les isomères
optiques particuliers.
8. Les enzymes sont nommées selon leur fonctions.
La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X
(E.C. : "Enzyme Commission").

Le premier 1er X Réaction catalysée exemple de coenzyme impliqué

"X"
correspond
aux 6 types X=1: oxydoréduction NAD(P)+
de réactions oxydoréductases
catalysées par (E. C. 1.X.X.X)
les enzymes. X=2: transfert de groupes phosphate de pyridoxal
transférases
(E. C. 2.X.X.X)
X=3: hydrolyse aucun
hydrolases
(E. C. 3.X.X.X)
X = 4 : lyases addition de groupe à des atomes pyrophosphate de thiamine
(E. C. 4.X.X.X) engagés dans des doubles liaisons
X=5: isomérisation (de position de phosphate de pyridoxal
isomérases groupe ou de fonction)
(E. C. 5.X.X.X)
X = 6 : ligases condensation de deux molécules ATP
(E. C. 6.X.X.X)
Remarque : dans les banques de données, on trouve une catégorie "Autres" ; exemples : kinases,
phosphoprotéines, "Mutator transposons".
8. Les enzymes sont nommées selon leur fonctions.
La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X
(E.C. : "Enzyme Commission").

Considérons le groupe 1 2ème X l'enzyme agit sur :

des oxydoréductases : X = 1 : E. C. 1.1.X.X le groupe CH-OH
le 2ème "X" permet un du donneur
d'électrons
classement supplémentaire
X = 2 : E. C. 1.2.X.X la fonction aldéhyde
en fonction de la nature du
groupe du donneur ou oxo du donneur
d'électrons
d'électrons sur lequel
l'enzyme agit. X = 3 : E. C. 1.3.X.X le groupe CH-CH
du donneur
d'électrons
etc ...
X = 19 : E. C. 1.19.X.X la flavodoxine
réduite
X = 97 : E. C. 1.97.X.X autres
oxydoréductases
8. Les enzymes sont nommées selon leur fonctions.
La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X
(E.C. : "Enzyme Commission").
8. Les enzymes sont nommées selon leur fonctions.
La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X
(E.C. : "Enzyme Commission").
8. Les enzymes sont nommées selon leur fonctions.
La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X
(E.C. : "Enzyme Commission").
8. Les enzymes sont nommées selon leur fonctions.
La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X
(E.C. : "Enzyme Commission").
8. Les enzymes sont nommées selon leur fonctions.
La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X
(E.C. : "Enzyme Commission").
 Facteurs affectant les enzymes
concentration d’enzyme et de substrat
pH
température
inhibiteurs
 effet de la concentration

• La concentration d'enzyme: à concentration d'enzyme basse il ya une

grande concurrence pour les sites actifs et la vitesse de réaction est faible.
Par l’augmentation de concentration d’enzymes, il ya l’augmentation des
sites actifs et la réaction peut se dérouler à un rythme plus rapide.?
Finalement, l'augmentation de la concentration d'enzyme au-delà d'un
certain seuil provoque un non effet parce que la concentration de substrat
devient le facteur limitant.

• La concentration du substrat: à une faible concentration de substrat il ya

plusieurs sites actifs qui ne sont pas occupés. Cela signifie que la vitesse de
réaction est faible. Quand plusieurs molécules de substrat sont ajoutés,
plusieurs complexes enzyme-substrat peuvent être formés. Comme il ya des
sites les plus actifs, et le taux de réaction augmente.?
Finalement, l'augmentation de la concentration du substrat encore plus sera
sans effet. Les sites actifs seront saturés donc pas plus complexes enzyme-
substrat peuvent être formés.
L’ effet du pH
 L’ effet du pH
Valeurs de pH Optimum

Activité
d’enzyme
Trypsine

Pepsine

1 3 5 7 9 11
pH
 L’ effet du pH
• Les niveaux de pH extrêmes vont produire une
dénaturation
• La structure de l'enzyme est modifiée
• Le site actif est déformée et les molécules de substrat
ne pourra plus pénétrer dedans
• A des valeurs de pH légèrement différente de la
valeur optimale de l'enzyme, de petits changements
dans les charges de l'enzyme et son substrat se
produiront
• Ce changement de ionisation aura une incidence sur
la liaison du substrat avec le site actif.
 L’ effet de la temperature
• Q10 (le coefficient de température) = l'augmentation
du taux de réaction avec l’augmentation de la
température de10 ° C
• Pour les réactions chimiques Q10 = 2-3 (La vitesse de
la réaction double ou triple avec chaque augmentation
de 10 ° C de la température)
• Réactions enzymatiques contrôlée suivent cette règle
car ils sont des réactions chimiques
• Mais à des températures élevées protéines sont
dénaturés
• La température optimale pour une réaction
enzymatique contrôlée sera un équilibre entre la Q10
et de dénaturation.
L’ effet de la temperature
 L’ effet de la temperature

Q10 Dénaturation
Activité
d’enzyme

0 10 20 30 40 50
Temperature / °C
 L’ effet de la temperature
• Pour la plupart des enzymes ont une température
optimale d'environ 30 ° C
• Beaucoup d’entre elles ont des T plus basses?
Poissons d'eau froide vont mourir à 30 ° C parce que
leurs enzymes se dénaturent
• Quelques bactéries ont des enzymes qui peuvent
résister à des températures très élevées pouvant
atteindre 100 ° C
• La plupart des enzymes sont cependant complètement
dénaturés à 70 ° C
 Inhibiteurs
• Les inhibiteurs sont des composés chimiques qui
réduisent la vitesse des réactions enzymatiques.
• Ce sont généralement spécifiques et ils fonctionnent à
de faibles concentrations.
• Ils bloquent l'enzyme mais ils ne sont pas
généralement dénaturants.
• De nombreux médicaments et poisons sont des
inhibiteurs d'enzymes dans le système nerveux.
 L'effet de l'inhibition de
l'enzyme
• Inhibiteurs irréversibles: se combinent
avec les groupes fonctionnels des acides
aminés dans le site actif, de façon
irréversible.
• Exemples: gaz et les pesticides
neurotoxiques, contenant
organophosphoré, se combinent avec des
résidus de serine dans le estérase
enzyme acétylcholine.
© 2007 Paul Billiet ODWS
 L'effet de l'inhibition de
l'enzyme
• Les inhibiteurs réversibles: Ceux-ci
peuvent être éliminés par lavage de la
solution d'enzyme par dialyse.
• Il existe deux catégories.

© 2007 Paul Billiet ODWS

 Deux types d'inhibiteurs d'enzymes

• Inhibiteur
compétitif

• Les produits chimiques

qui ressemblent au
substrat normale d'une
enzyme et concurrencer
avec elle le site actif.

• Réversible en fonction
Exemple: Le médicament Antabuse est utilisé pour aider
de la concentration de les alcooliques à cesser de boire. Antabuse inhibe
l'inhibiteur et du l'aldéhyde oxydase, qui entraîne l'accumulation
d'acétaldéhyde au cours du métabolisme de l'alcool. Les
substrat. niveaux élevés d'acétaldéhyde provoquent des symptômes
de nausées et de vomissements.
 L'effet de l'inhibition de
l'enzyme
1. Compétitive: ce sont
des compétition avec
les molécules E+I EI
substrats dans le site
Reversible Enzyme inhibitor
actif. reaction complex
L'action de l'inhibiteur est
proportionnel à sa
concentration.
Ressemble étroitement à la
structure du substrat..
Deux types d'inhibiteurs d'enzymes
Deux types d'inhibiteurs d'enzymes
 L'effet de l'inhibition de
l'enzyme

Succinat Fumarate + 2H++

e Succinate dehydrogenase 2e-

CH2COOH COOH CHCOOH

CH2

CH2COOH CHCOOH
COOH
Malonate
 Deux types d'inhibiteurs d'enzymes

• 2. Inhibiteur non
compétitif

• ne pénètre pas dans le

site actif, mais se lie à une
autre partie de l'enzyme,
provoquant un
changement de forme du
site actif de l'enzyme

• Habituellement réversible,
selon la concentration de
l'inhibiteur et le substrat.
Exemple: Vous savez peut-être que les composés contenant des métaux
lourds tels que le plomb, le mercure, le cuivre ou l'argent sont toxiques.
Ceci est parce que les ions de ces métaux sont des inhibiteurs non-
compétitifs pour plusieurs enzymes.
Deux types d'inhibiteurs d'enzymes
 Applications des inhibiteurs

• Rétroaction feedback négative: point final

ou un produit inhibition de fin
• Poisons morsure de serpent, des
alcaloïdes végétaux et gaz neurotoxiques.
• Antibiotiques en Médecine, les sulfamides,
les sédatifs et les stimulants

© 2007 Paul Billiet ODWS

 Mécanisme général d'une enzyme
E
S P

Une enzyme (E) transforme un substrat (S) en produit (P).

-Première étape. Le substrat se fixe sur l'enzyme

K1
S ES
K-1

-La deuxième étape: la catalyse . Le substrat est transformé en produit

K2
ES EP
K-2
-Troisième étape. Le produit est relâché
K3
EP E+P
K-3

Si il y a plusieurs substrats. La réaction se fera étape par étape (et non simultanément)
pour être efficace. C'est une succession de réaction du premier ordre.
On revient toujours à ce système générale
 K1 Equilibre
E+S ES
K-1

A l'équilibre
K1[E][S]=K-1 [ES]
K-1/K1= [E].[S] /[ES]

Or Kd= [E].[S] /[ES] Kd =constante de dissociation

Par conséquent Kd= K-1/K1

Si [S]=kd, [ES]=[E]
Il y a autant d'enzyme libre que d'enzyme liée au substrat
 Diagramme énergétique

Sans enzyme le diagramme énergétique d'une réaction est

Pour passer de S à P il faut franchir l'énergie

d'activation DGact. Cette barrière peut ralentir
très fortement la réaction

DGact

S
DGreac<0, la réaction se fait du substrat
vers le produit

DGreac

P
 Avec Enzyme

Sans enzyme

DGact, l'énergie d'activation est diminué, la

réaction est fortement accélérée.
S L'équilibre n'est pas changé
EP

ES

K1 K2 K2
E+S ES EP E+P
K-1 K-2 K-2
 S
EP
DGfix
ES

Pour fixer le substrat, il y a une petite barrière d'énergie. Il faut chasser des molécules
d'eau. Il faut que l'enzyme fasse des changements conformationnelles …
L'énergie thermique est suffisante pour passer cette barrière. Parfois, les enzymes ont
un champs électrique afin d'orienter et d'attirer le substrat (ex acétylcholinestérase). Les
enzymes psychrophiles sont plus flexibles que les enzymes mésophiles.
ES
En fixant le substrat, on augmente l'ordre: C'est défavorable.
Pour compenser cette perte entropique, le substrat fait des interactions
énergiquement favorables avec l'enzyme (liaisons ioniques, liaisons hydrogène,
stacking, interactions hydrophobe …).
L'énergie dégagé (DH) augmente l'entropie du milieu (DS=DH/T)
 ‡

S
EP

ES

P
L'énergie d'activation de la réaction est abaissé.

Effet entropique
Les substrats sont fixés. Il y a augmentation de la concentration locale des réactif et
comme les substrats sont correctement orienté pour la reaction, il y a plus de chance
qu'ils réagissent.
C'est un effet entropique favorable.

Effet énergétique
L'enzyme peut parfois déstabiliser le substrat, déformation géométrique, polarisation
d'une liaison, attaque d'une liaison …
Stabilisation de l'etat intermédiaire: charge, liaisons,…

Au final l'énergie d'activation est abaissé et il y réaction

 S
EP

DGreac
ES

Le produit est formé.

Souvent, le produit a une affinité plus faible que le substrat.
De plus, au début de la réaction comme il n'y a pas encore de produit dans la
solution, le produit sortira plus facilement (effet entropique)

Comme pour l'arrivé du substrats, le produit pour sortir doit franchir une barrière
d'énergie. Déplacement de molécules d'eau, mouvements de la protéines.

Quelque soit le chemin, à la fin on récupère l'énergie de la réaction.

Cette énergie peut être couplé à d'autre réactions non favorable (ex ATP)
 La métastabilité est la propriété pour un
état d'être stable cinétiquement mais pas
S thermodynamiquement
EP

ES

Les états ES et EP sont métastable et peuvent être piégé. (concentration P et S, T°, …)

Les autres états intermédiaires sont beaucoup plus difficile à piéger

 Cinétique d'une enzyme au cours du temps
K1 K2 K3
E+S ES EP E+P
K-1 K-2 K-3

Apparition du produit au cours du temps

[P]

La vitesse peut être mesurée

avec l'apparition du produit.
Vitesse initiale
d P   d S 
v ou
dt dt

t
Phase
Phase Effet équilibre
préstationnaire du produit
stationnaire

[ES] [S]>>[E] [EP] [ES] [EP]

L'enzyme La vitesse Le produit qui s'accumule La concentration du

se charge est constante. ralentie la réaction produit reste constante
(loi d'action de masse)

En enzymologie classique, on s'intéresse à la phase stationnaire (linéaire) en mesurant la vitesse initiale.

Il y a un maximum d'enzyme liée avec le substrat. D’où la vitesse maximale
 La cinétique en fonction de la concentration d'enzyme

[P]
[E3]>[E2]>[E1]
[E3]
[E2]
[E1]

Plus il y a d'enzyme plus la réaction est rapide.

Par contre cella ne change pas l'équilibre
 Unité de l'activité enzymatique

L'activité enzymatique d'une solution est le nombre de mole de substrat qu'elle

dégrade par seconde

Katal (Kat)
L'unité officielle de la mesure de l'activité enzymatique est le Katal.
C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mole de substrat
par seconde

L'unité international (U.I)

On trouve aussi une autre unité très usuel " l'unité international"
C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mmole de
substrat par minute

Dosage
La mesure de l'activité enzymatique d'une solution permet de doser une
enzyme
Il faut faire la mesure dans des conditions définies (pH, T°(souvent 25°), [S], …)
et connaître l'activité de l'enzyme
 Cinétique (phase stationnaire)
en fonction de la concentration du substrat

Vmax

Plus il y a de substrat, plus l'enzyme est rapide.

C'est la loi d'action de masse.

V Néanmoins, c'est augmentation n'est pas

infini(comme tout processus biologique), et
l'enzyme finie par saturé à la vitesse Vmax.)

Attention, pour les mesure on atteint Vmax de

façon asymptotique. En réalité, il est difficile de
[S] mesuré Vmax car il faut beaucoup de substrat
pour vraiment atteindre Vmax (en théorie [S]=∞)

A faible concentration la vitesse est linéaire

en fonction de la concentration de substrat.

courbe cinétique (V en fonction de [S]) classique des enzyme Michaelienne.

C'est une hyperbole
 Modèle de Michaelis-Menten (1913)
K1 K2 K3
E+S ES EP E+P
K-1 K-2 K-3

Conditions (phase stationnaire).

1 On travaille à de très faible concentration de produit [S]>>[P]

2 Il y a beaucoup plus de substrat que d'enzyme que [S]>>[E]

3 les formes libres de l'enzyme et de l'enzyme lié au substrat sont en équilibre (rapide).
Kd 
E S 
ES 

Avec ces conditions, on peut simplifier la réaction

K1 K2
E+P Comme, il y a peu de produit le retour K-2 est
E+S ES
négligeable
K-1
 K1 K2
E+S ES E+P
K-1

Par conservation, on doit avoir:

[S]ini=[S] + [ES] + [P] or [S]>>[E] et [S]>>[P]

Donc la concentration de substrat peut être considérée comme constante
[S]=[S]ini

[E]tot=[E] + [ES]

L'équilibre étant rapide, la concentration de l'enzyme fixée au substrat est reliée

à la constante de dissociation

Kd 
E S  k 1

ES  k1
la constante de Michaelis (M)
A faible concentration de substrat, l'efficacité d'une enzyme
est donné par le rapport k cat
KM est la constante de Michaelis (M)
kM
Kcat=K2 (s-1)
K1 K2
E+S ES E+P
K-1

L'enzyme doit avoir une bonne affinité pour la substrat (faible

KM) et une grande réactivité pour le substrat (Kcat élevé)

En générale en biologie les enzymes fonctionnent à faible concentration

de substrat
 k cat
Pente k
M

Vmax=kcat [E]

Vmax/2

kM
vo indépendente de [ S ],
[ S ] >> KM vo = vmax
saturation, asymptote
dépendence linéaire de [ S ],
[ S ] << KM vo = vmax·[ S ] / KM
substrat limitant, asymptote

[ S ] = KM vo = vmax / 2 demi-saturation de l'enzyme

 Exemple de constante de Mikaelis (kM)

Enzyme Substrat KM (mM)

Acétylcholinestérase Acétylcholine 0.095
Anhydrase carbonique CO2 12

HCO3- 26
Catalase H2O2 25
Chymotrypsine N-acétylglycine éthyl ester 440

N-acétylvaline éthyl ester 88

N-acétyltyrosine éthyl ester 0.66

Fumarase Fumarate 0.005

Malate 0.025
Uréase Urée 25
Lysozyme hexa N acetylglucosamine 0.006

Km représente l'affinité du substrat pour l'enzyme.

Si [S]=KM, La moitié des enzymes auront le substrat fixé.
KM peut prendre des valeurs très varié.
En générale (KM=Kd), plus KM sera petit plus l'énergie de liaison du substrat (DG) sera
importante.
 Exemple de constantes catalytiques (Kcat)

Enzyme Substrat KM (mM) kcat (s-1)

Acétylcholinestérase Acétylcholine 0.095 14 000
Anhydrase carbonique CO2 12 1 000 000

HCO3- 26 400 000

Catalase H2O2 25 40 000 000
Chymotrypsine N-acétylglycine éthyl ester 440 0.051

N-acétylvaline éthyl ester 88 0.17

N-acétyltyrosine éthyl ester 0.66 190

Fumarase Fumarate 0.005 800

Malate 0.025 900

Uréase Urée 25 10 000
Lysozyme hexa N acetylglucosamine 0.006 0.5

Kcat représente l'activité catalytique de l'enzyme.

La catalase qui a la plus grande activité catalytique connue, chaque enzyme est
capable de dégrader 40 millions de molécules par seconde
Km et Kcat individuellement ne sont pas suffisant pour déterminer si une enzyme
est efficace envers un substrats.
A faible concentration de substrats comme c'est souvent le cas. La vitesse
catalytique est déterminé par la le rapport Kcat/KM

k cat
Pente kM

Vmax=kcat [E]

Vmax/2

kM
 kcat/KM
Enzyme Substrat KM (mM) kcat (s-1) (M-1·s-1)
Acétylcholinestérase Acétylcholine 0.095 14 000 147 368 421
Anhydrase carbonique CO2 12 1 000 000 83 333 333
HCO3- 26 400 000 15 384 615
Catalase H2O2 1100 40 000 000 36 363 636
Chymotrypsine N-acétylglycine éthyl ester 440 0.051 0.1
N-acétylvaline éthyl ester 88 0.17 1.9
N-acétyltyrosine éthyl ester 0.66 190 287 878
Fumarase Fumarate 0.005 800 160 000 000
Malate 0.025 900 36 000 000
Uréase Urée 25 10 000 400 000
Lysozyme hexa N acetylglucosamine 0.006 0.5 83 333

On peut remarquer pour le lysozyme que malgré un mauvais Kcat, l'enzyme est
efficace grâce un bon KM.

De même l'anhydrase carbonique et la catalase ont une très mauvaise affinité pour
leur substrat mais une très bonne constante catalytique. Ce qui en font les enzymes
parmi les plus efficaces
Grace à ces analyse ont peut déterminer les substrats "le plus physiologique" et
l'activité probable de l'enzyme. (Une enzyme peut avoir plusieurs activité.)
Ex chymotryspsine
 Vitesse maximale, perfection catalytique

La vitesse de réaction ne peut être plus importante que la vitesse de fixation du

substrat sur l'enzyme. Cette vitesse est limitée par la vitesse de diffusion. Dans l'eau
cette constante de vitesse est de l'ordre de 109M-1S-1. Les enzymes dont l'activité
catalytique approche cette valeur ont atteint la perfection catalytique.

kcat/KM
Enzyme Substrat KM (mM) kcat (s-1) (M-1·s-1)
Acétylcholinestérase Acétylcholine 0.095 14000 147 368 421
Anhydrase carbonique CO2 12 1 000 000 83 333 333
Catalase H2O2 1100 40 000 000 36 363 636
Fumarase Fumarate 0.005 800 160 000 000
 Linéarisation

A partir de ce graphe, il est difficile

k cat S ini de déterminer rapidement et
V [E]
k M  S ini
précisément Kcat et KM
La courbe n'est pas linéaire, on
est rarement à saturation (Kcat).

représentation de Lineweaver-Burk
On va représenter cette courbe en double inverse 1/V en fonction de 1/S

1 k M  S ini kM 1 1 kM 1 1
  .   . 
V kcat S ini[ E ] kcat [ E ] S ini kcat [ E ] V max S ini V max
Y=1/V a (pente)=KM/Vmax
Y  aX  b X=1/S b (ordonnée à l'origine)=1/Vmax
 représentation de Lineweaver-Burk

1 k 1 1
 M .  Y  aX  B
V V max S ini V max
Pente KM/Vmax

1/V

1/Vmax

1/kM 1/[S]

Dans cette représentation,

la droite coupe l'axe des x en 1/KM
La droite coupe l'axe des y en 1/Vmax
La pente de la droite est KM/Vmax
 Soucis

1/V
Point expérimentaux

1/Vmax

1/kM 1/[S]
[S]=∞

Les point intéressant serait vers l'origine, or il corresponde à des valeurs de substrat
très grande.
Ainsi, on a souvent des point expérimentaux éloignés de l'origine, ce qui rend
l'interprétation peu précise
 Enzyme non Mikalelienne

Parfois l'enzyme n'est pas Mikaelienne (ex allosterie,voir plus tard).

Le modèle déterminé n'est plus valable. On ne peut déterminer directement les
paramètres cinétiques.

OK

Le modèle Mikaelien n'explique pas les points expérimentaux. Les erreurs

expérimentales non plus.
Il faut proposer un nouveau modèle (voir plus tard)
 Pourquoi mesurer Kcat et KM?

Caractérisation
On peut mesurer ces constantes pour caractériser une enzyme envers un substrats.

Spécificité de l'enzyme
En testant différents substrats on peut déterminer les type de substrat reconnu par
l'enzyme (KM) et on peut voire l'efficacité Kcat) de la reaction selon la nature
chimique su substrat (ex type de liaison).

Rôle physiologique de l'enzyme

Le rapport Kcat/kM peut nous aider à trouver le ou les substrats naturels de
l'enzyme (ère génomique).

Mutation rationnelle et mécanisme enzymatique.

En testant différents mutants on peut déterminer les acide aminés impliqués dans la
reconnaissance (il modifie le KM) et ceux directement impliqué dans la reaction (il
modifie Kcat).

Biotechnologie
La compréhension du mécanisme et la caractérisation de l'enzyme permet d'avoir
un intérêt biotechnologique.
Stabilisation (T°, pH, Sel,..)
Mutants plus actif, …
 Attention sans la structure ces interprétations peuvent être hasardeuses.

Une mutation peut changer la conformation d'une enzyme sans être directement
impliqué.

Kcat et Km sont intimement lié. En modifiant un acide aminé spectateur , on peut

changé la réactivité de l'enzyme.
(Changement conformationelle, changement des propriétés physicochimique,
flexibilité, …)
En changeant la réactivité on change KM (effet important si K-1 est comparable à
Kcat) k  k 
K M  1 cat
k1

D'autre part un acide aminé reactif est aussi lié à la fixation du substrat
Les Applications des enzymes spécifiques
en industries alimentaire
 Les Applications des enzymes spécifiques

Amylases, amyloglucosidases et Convertissent l'amidon en glucose et différents sirops.

glucoamylases Convertit le glucose en fructose pour produire des sirops à partir de
Industrie de l'amidon Glucose isomérase féculents. Ces sirops ont des propriétés adoucissantes et des valeurs
calorifiques plus basses que le saccharose pour le même niveau de
douceur.
Hydrolysent l'amidon pour baisser la viscosité du papier et aider à sa
découpe et à son surfaçage.
Amylases, xylanases, cellulases et Les xylanases réduisent la quantité d'agents chimiques nécessaires au
Industrie du papier
ligninases blanchiement; les cellulases lissent les fibres, améliorent le drainage de
l'eau et facilitent l'enlèvement de l'encre; les ligninases hydrolysent la
lignine pour adoucir le papier.
Hydrolyse de la cellulose dans les sucres fermentables lors de la
Industrie du carburant production d'éthanol à partir de la cellulose.
Cellulases et ligninases Récupération des résidus de lignine.
biologique

Pré-trempage et applications liquides directes pour enlever les taches

Protéases excrétées par les bactéries
des vêtements d'origine protéique.
Amylases
Détergents biologiques Détergents pour enlever les résidus d'amidon résistants.
Lipases
Utilisé pour enlever les taches grasses et huileuses.
Cellulases
Utilisé dans les adoucissants biologiques.
Nettoyants de lentilles de Désinfectant protéique.
Protéases
contact
Production d'oxygène à partir du peroxyde pour transformer le latex en
Catalase
Industrie du caoutchouc mousse.
Ficine (protéase)
Industrie photographique Dissolution de la gélatine des films et récupération de l'argent.
Enzymes de restriction, DNA ligases, DNA Manipulation de l'ADN, PCR, ... (génétique, pharmacologie,
Biologie moléculaire
polymérases, ... agriculture, médecine légale, ...).
 Les Applications des enzymes spécifiques en industries alimentaire
Application Enzymes utilisées
Amylases fongiques et de plantes
Traitement de la
nourriture Protéases
Cellulases, pectinases
Papaïne
Les enzymes de l'orge sont
libérées pendant le stade
d'écrasement lors de la fabrication
de la bière.
Largement utilisées dans le brassage pour remplacer les enzymes
Enzymes d'orge produites
industriellement :
Brasserie
Amylase, glucanases, protéases
Bétaglucanases et
arabinoxylanases
Amyloglucosidase et pullulanases
Protéases
Acétolactate décarboxylase
Rennine extraite de l'estomac de
jeunes animaux ruminants
(exemple : veaux, agneaux)
Industrie laitière Enzymes produites par voie
microbienne
Lipases
lactases
Utilisations
Production de sucres à partir d'amidon : fabrication de sirops.
Boulangerie : fermentation de sucres par les levures pour
produire le dioxyde de carbone qui lève la pâte.
Les fabricants de biscuit les utilisent pour baisser la teneur en
protéines de la farine.
Pré-digestion des aliments pour bébés.
Clarification des jus de fruit.
Attendrit la viande pour la cuisson.
Elles dégradent l'amidon et les protéines pour produire des
sucres simples, des acides aminés et des peptides utilisés par la
levure pour la fermentation.
naturelles de l'orge.
Découpent les polysaccharides et les protéines du malt.
Améliorent les caractéristiques du moût ("wort") et la filtration
de la bière.
Bière de faible calorie et ajustage de la fermentabilité.
Enlèvent le trouble produit pendant l'entreposage de la bière.
Augmente l'efficacité de la fermentation en réduisant la
formation de diacétyle.
Hydrolyse des protéines lors de la fabrication de fromage.
Utilisation croissante dans l'industrie laitière.
Production du Roquefort : améliore le mûrissement de la
moisissure bleue.
Hydrolyse du lactose en glucose et galactose.
 glutamate dehydrogenase

Glutamate-Oxaloacetate Transaminase