Overproduction of Metabolites

of Industrial Microorganisms

Mechanisms enabling microorganisms to avoid

overproduction of primary metabolic products
through enzyme regulation
 THE NATURE OF METABOLIC
PATHWAYS

Pour pouvoir manipuler des micro-

organismes afin de produire au
maximum des métabolites d’importance
économique pour l’être humain, mais à
un coût minimal, il est important que la
physiologie des organismes soit comprise
autant que possible.
 METABOLISM
• Cells must accomplish two fundamental tasks to
grow
– Synthesize new components
• biosynthesis
– Harvest energy
• The sum total of chemical reactions of biosynthesis and
energy-harvesting is termed metabolism

The series of chemical reactions involved in converting a

chemical (or a metabolite) in the organism into a final
product is known as a metabolic pathway.
 PRINCIPLES OF METABOLISM
• Metabolism is broken down into two
components
– Anabolism
– Catabolism
• Catabolism
– Degradative reactions
– Reactions produce energy from the break
down of larger molecules
• Anabolism
– Reactions involved in the synthesis of cell
components
– Anabolic reactions require energy
• Anabolic reactions utilize the energy
produced from catabolic reactions
 INDUSTRIAL MICROBIOLOGICAL PRODUCTS AS
PRIMARY AND SECONDARY METABOLITES

Les produits des micro-organismes industriels peuvent être

divisés en deux grands groupes, ceux qui résultent du
métabolisme primaire et ceux qui résultent du
métabolisme secondaire. La ligne de démarcation entre les
deux n'est pas toujours nette, mais la distinction est utile
pour discuter de produits industriels.
Régulation des métabolites primaires
Rétro-inhibition

La charge
énergétique
Régulation de
l’activité
enzymatique Dégradation des
enzymes

Modification
Régulation du d’enzymes
métabolisme
Primaire
Induction

Régulation de la
synthèse Répression
enzymatique

atténuation
11
Rétro-inhibition d’une voie non ramifiée

E1 E2 E3
A B C D
13
Rétro-inhibition des voies ramifiées
 Régulation par rétro-inhibition

Rétro-inhibition cumulative Rétro-inhibition concertée

Régulation par rétro-inhibition
Rétro-inhibition séquentielle Rétro-inhibition par iso-enzymes
 Rétro-inhibition par la charge énergétique

1
[ATP]  [ADP]
Energy charge  2
[ATP]  [ADP]  [AMP]

High energy charge means the cell has a lot of energy

Low energy charge means the cell has little energy

 Dégradations des enzymes

Les enzymes inutiles peuvent être dégradées par les protéases

spécifiques. E.g. Tryptophane synthétase de S.cereviceae est
dégradé quand la cellule entre en phase stationnaire

Modification d’enzymes

L’activité enzymatique peut être contrôlée par le changement

conformationel (phosphorylation) e.g phosphatase
synthétase d’E. coli
Induction
 R P O S ADN

ARN
polymerase Transcription

Apo-represseur
m ARN

Translation

Enzyme

Répression

Co-represseur (Produit final)

 Atténuation
Attenuation: mécanisme qui contrôle la capacité de l’ARN
polymerase de lire un atténuateur, qui est un terminateur placé
au début de la transcription.

Ce type de régulation n’a été mis en évidence que chez les

procaryotes.

Selon ce mode, la transcription d’un opéron est selon la

structure secondaire d’un petit peptide dit « peptide leader ».
 Immediate or
Substrate Enzyme subsequent product

Induction Inhibition/Repression
 Surproduction des métabolites
primaires

1. Decrease in concentration of end product

2. Mutation to feedback resistance

Overproduction of an intermediate in an unbranched
pathway:
 Overproduction of an intermediate in an
unbranched pathway

glutamicum (cit-)
Corynebacterium
 Overproduction of end-products of a
branched pathway

Ceci est mieux illustré (figure ci-dessous) dans le cas de la

lysine, un acide aminé important manquant de céréales et
donc ajouté en complément aux aliments céréaliers en
particulier dans les aliments pour animaux. Il est produit en
utilisant Corynebacterium glutamicum ou Brevibacterium
flavum.
The initial enzyme in this pathway aspartokinase is regulated by concerted
feedback inhibition of threonine and lysine
 Overproduction of end-product of an
unbranched pathway

Deux méthodes sont utilisées pour la surproduction du

produit final d'une voie non ramifiée. Le premier est
l'utilisation d'un analogue toxique du composé désiré
et le second est par une mutation reverse d’un mutant
auxotrophique.
Amélioration de la production
des Métabolites secondaires
 Caractéristiques des métabolites secondaires

 Chaque métabolite secondaires est produit par un réduit de micro-

orgnismes.

 Les métabolites secondaires sont apparemment non essentiels pour la

croissance et la reproduction.

 La formation des métabolites secondaires est extrêmement dépendant des

conditions de croissance, principalement la composition du milieu.

 Les métabolites secondaires sont souvent produit comme un groupe d’une

structure très proche, une souche de Streptomyces produit 32 antibiotiques.

 Le mécanisme de régulation est différent significativement des métabolites

primaires.
 Régulation des métabolites secondaires

La production des métabolites secondaires est contrôlée par 5

classes des gènes;

I- Gènes de structure
II- Gènes de régulation
II- Gènes résistance
IV- Gènes de perméabilité
V- Gènes du métabolisme primaires

300 gènes Chlorotétracyclines

2000 gènes Néomycine
 SURPRODUCTION DEs MÉTABOLITES SECONDAIRES

Quelques mécanismes de régulation

Induction : par exemple, le tryptophane pour la production d'ergot, etc.

Régulation du produit final : certains métabolites inhibent leur propre
biosynthèse.
Régulation catabolite : une enzyme clé est inactivée, inhibée ou réprimée.
ex. Le glucose peut inhiber plusieurs antibiotiques
l'ammoniac est un inhibiteur de la production d'antibiotiques.
Régulation des phosphates : Pi pour la croissance et la multiplication chez les
pro et eucaryotes. L'augmentation de la concentration de Pi peut accroître les
métabolites secondaires, mais l'excès est nuisible.
Autorégulation : mécanisme d'autorégulation de la production, comme les
hormones.
1.Induction

La biosynthèse des antibiotiques est stimulée par de faibles

concentrations de substances ajoutées, de structure très
variable et avec des modes d'action inconnus.

Ils ne sont efficaces que lorsqu'ils sont ajoutés dans les premiers
stades de la culture.
L'effet stimulant de certains composés dans la fermentation
secondaire des métabolites ressemble à l'induction enzymatique

Un bon exemple est le rôle du tryptophane dans la

fermentation des alcaloïdes de l'ergot par Claviceps sp.

Une induction similaire semble être exercée par la méthionine

dans la synthèse de la céphalosporineC par Cephalosporium
ocremonium.
2.Rétro-régulation (feedback)

Un exemple est l'inhibition de la pénicilline par la lysine. La

biosynthèse de la pénicilline par Penicillium chrysogenum est
affectée par la rétro-inhibition par la L-lysine, car la
pénicilline et la lysine sont les produits finaux d'une même
voie de biosynthèse.
3.Auto-régulation:
Plusieurs métabolites secondaires ou même leurs analogues
inhibent leur propre biosynthèse par un mécanisme de rétro-
inhibition (chloramphénicol, pénicilline, cycloheximides et acide
6-méthylsallicylique (produit par Penicillium urticae).
4.Reppression catabolique

La répression catabolique est un mécanisme général

dans lequel une enzyme clé impliquée dans une voie
catabolique est réprimée ou inhibée lorsque un substrat
facilement dégradable est ajouté.

Les substrats qui se sont révélés déclencheurs de la

répression catabolite comprennent des sources d'azote et de
carbone.
Si le glucose est présent dans le milieu, ainsi que d'autres sucres, il est toujours le
premier à utiliser. L’utilisation des autres sources est fréquemment reportée.
La répression du métabolisme secondaire par la source de
carbone est connue depuis longtemps. Dans la production de
la pénicilline, il était connu depuis longtemps que la
pénicilline n’est pas produite dans un milieu contenant du
glucose jusqu'à ce qu’après l'épuisement du glucose.
 Mécanisme de la Repression Catabolique

• Glucose:cAMP Presence du glucose

• CAP (CRP) protein

• No CAP-cAMP Adenyl cyclase

CAP X ATP

complex i p o z y a
– No Promoter
activation Inactive

-Galactosidase Permease Transacetylase

Low level expression

• c-AMP Absence du glucose

• CAP (CRP)
protein Adenyl cyclase

• CAP-cAMP CAP c-AMP ATP

complex i p o z y a
– Promoter Active

activation
Inactive
• Positive control
-Galactosidase Permease Transacetylase

Maximum expression
5. Inhibition par le phosphate inorganique

Des concentrations de phosphate inorganique variable

entre 0,3-30 mM permettent une excellente croissance des
organismes procaryotes et eucaryotes. D'autre part, la
concentration maximale qui favorise le métabolisme
secondaire est de 1,0mM, alors que qu’une concentration
moyenne équivalente à 10mM inhibe complètement le
métabolisme secondaire .
Des concentrations élevées de phosphate inhibent la
formation d'antibiotiques, de sorte que l'industrie des
antibiotiques sélectionne de manière empirique les milieux à
faible teneur en phosphate, ou réduit la teneur en phosphate
en ajoutant des agents complexants lephosphate au milieu.
 Méthodes empiriques employées pour désorganiser les
mécanismes régulateurs dans la production de métabolites
secondaires

Les procédés qui sont utilisés pour induire la

surproduction de métabolites secondaires sont dans
l'ensemble empiriques. De tels procédés comprennent
les mutations et la stimulation par la manipulation des
composants et des conditions de culture.
 Mutation

Effet stimulateur des précurseurs:

La production de pénicilline a été stimulée par l'addition d'acide
phénylacétique, la synthèse de l'aflatoxine par Aspergillus parasiticus et la
méthionine requise. Dans la formation de mitomycine par Streptomyces
verticillatus, la L-citurulline est un précurseur.

Composés inorganiques: P. inorganique, manganèse

Température: