Cma 2020

1ère année Master Microbiologie Appliquée Contrôle microbiologique des aliments
Introduction
La qualité hygiénique d‟un produit alimentaire dépend surtout de la nature mais aussi
souvent du nombre de la flore microbienne présente dans ce produit. Si cette flore est
composée de microorganismes susceptibles d‟engendrer des maladies après consommation
(maladies infectieuses, toxi-infections, intoxications, intoxinations) le produit est dangereux et
ne doit en aucun cas être commercialisé.
Le contrôle microbiologique de routine d‟un produit alimentaire consiste en :

-une estimation du nombre des contaminants (flore aérobie mésophile totale, coliformes,
anaérobies sulfito-réducteurs) ou leur détection (Salmonella, Shigella, Listeria, Vibrio, etc.).
- un contrôle de stabilité (stérilité) pour les conserves.
En bactériologie alimentaire, il n‟est pas nécessaire de rechercher, de compter et d‟identifier

systématiquement toutes les bactéries, levures et moisissures présentes dans le produit. Il
suffit souvent d‟effectuer :
a) une étude quantitative de la flore microbienne :
- soit par dénombrement d‟une flore microbienne donnée : la numération de la flore aérobie
mésophile totale, la numération des levures et moisissures,
- soit par dénombrement d‟un groupe bactérien pouvant correspondre à une contamination
déterminée : coliformes thermotolérants et/ou streptocoques du groupe D témoignant
d‟une contamination fécale, staphylocoques pour la mise en évidence d‟une contamination
d‟origine cutanée, germes indologènes, germes putrides, etc. La présence par exemple de
bactéries d‟origine fécale témoigne dans nos aliments d‟un manque d‟hygiène.
b) une recherche orientée de certaines bactéries pathogènes : telles que Salmonella,

Staphylococcus aureus, Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter,
Yersinia, etc. Cette recherche exige l‟utilisation de méthodes spécifiques hautement
sélectives.
Le plus souvent, ces analyses ne diffèrent d‟un produit alimentaire à un autre que par certains
détails d‟exécution. Parmi les analyses “communes” à tous (ou presque tous) les produits
alimentaires, on peut citer par exemple les numérations des coliformes ou de la flore aérobie
mésophile totale.
1 Dr MECHAI- DEBABZA. M
La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est donc fonction de très
nombreux facteurs ; le microbiologiste doit définir la notion quantitative et qualitative de la
flore normale de son produit (microorganismes “habituels”et tolérables), et de la flore
contaminante dont le seuil de tolérance sera défini en fonction du risque que fait courir cette
flore à un type donné de consommateur.
1. L’échantillonnage
Il s‟agit d‟une étape fondamentale, qui consiste à prendre un échantillon donné après avoir
choisi le lieu de prélèvement. Si les échantillons ne sont pas correctement prélevés et
manipulés ou ne sont pas représentatifs d‟un lot ou d‟une production, les résultats d‟analyse
n‟auront aucune signification. Un échantillonnage représentatif est essentiel quand l‟analyse a
pour but de détecter la présence de germes pathogènes ou de toxines qui peuvent être
distribués de façon hétérogène dans l‟aliment.
La Méthode d’échantillonnage est celle préconisée par l‟ICMSF (International Commission

of Microbiological Specifications for Foods : La Commission Internationale des Normes
microbiologiques relatives aux denrées alimentaires). Le principe de base de cette méthode est
le suivant : un échantillon analysé donne des résultats non satisfaisants s’il renferme des
microorganismes dangereux ou s‟il contient des microorganismes en nombre supérieur à
une limite au-delà de laquelle il devient potentiellement dangereux.
Dans cette méthode le symbole m représente la limite permettant de répartir les échantillons
en 2 groupes: acceptables (valeur ≤ m) et inacceptables (valeur > m).
Quand un microorganisme donné est toléré dans un aliment 3 catégories d‟échantillons sont
définies :
- catégorie 1 : acceptables si la valeur ≤ m
- catégorie 2 : acceptables mais avec une limite si m < la valeur ≤ M
- catégorie 3 : inacceptables si la valeur > M
m et M sont les valeurs seuils : m sépare la 1ère et la 2ème catégories et M sépare la 2ème et
la 3ème catégorie.
La valeur de M peut être liée à celle de m par les relations suivantes (mais ce n‟est pas
obligatoire) : M=10m pour les dénombrements en milieu solide et M=30m pour les
dénombrements en milieu liquide. On peut aussi tenir compte d‟une marge liée aux
tolérances analytiques qui correspond aux valeurs 3m (en milieu solide) et 10m (en milieu
liquide) (voir figure page 05).
Il existe deux types de plan d‟échantillonnage qui sont applicables à des systèmes aliments -
germes- consommateurs bien identifiés.
1.1. Plan d’échantillonnage à 2 classes

Avec un plan d‟échantillonnage à 2 classes, on définit une valeur m qui présente la limite
permettant de répartir les échantillons en deux classes (1 et 3) : les échantillons acceptables
(valeurs ≤ m) et les échantillons inacceptables (valeurs > m) (voir figure page 05).
Dans ce plan, n représente le nombre d‟échantillons examinés et le symbole c représente le

nombre d‟échantillons tolérés au-delà de la valeur seuil, nombre qui permet de juger le lot
comme satisfaisant.
Ce type de plan correspond le plus souvent aux conclusions : absence dans (le produit est
jugé de qualité satisfaisante ou bien propre à la consommation) ou encore présence dans (le
produit est déclaré de qualité non satisfaisante ou bien impropre à la consommation). Il est
généralement appliqué aux microorganismes pathogènes (Exemple : pour la plupart des
produits on a avec Salmonella et d‟autres microorganismes très dangereux comme Listeria et
Brucella m = 0, n = 5, c = 0).
Cependant, si m=0 et c ≠ 0, le lot est jugé de qualité satisfaisante si le nombre des

échantillons présentant des valeurs supérieures à la valeur critique m est inférieur ou égal à c
fixé (pour les viandes de volailles contaminées en surface par Salmonella: m = 0, n = 5, c = 1)
Dans certains cas même si un nombre relativement élevé de microorganismes est admis (m ≠
0), seules les tolérances analytiques sont tolérées et il n y a pas de valeur M : la tolérance
analytique donne la valeur 3m en milieu solide et 10m en milieu liquide. On est donc en
présence d‟un plan à 2 classes (pour les viandes de boucherie conditionnées sous vide ou non,
réfrigérées ou congelées, on a pour la flore aérobie mésophile totale : m = 5.104, n= 5, c = 0).
La rigueur du plan dépend des valeurs de n et de c. Plus grand est n pour une valeur donnée de
c, meilleure sera la qualité des lots acceptés. A l‟inverse, pour une valeur donnée de n, c
augmente, la rigueur du plan diminue.
1.2. Plan d’échantillonnage à 3 classes

Ce plan est basé sur la reconnaissance de 3 classes d‟échantillons en fonction de leur niveau
de contamination (la tolérance analytique est prise en compte) : (voir figure page 05).
- classe 1 : acceptables si la valeur ≤ 3m lors du dénombrement effectué en milieu solide et ≤
10m lors du dénombrement effectué en milieu solide
- classe 2 : acceptables mais avec une limite si 3m < la valeur ≤ 10M lors du
dénombrement effectué en milieu solide et 10m < la valeur ≤ 30M lors du dénombrement
effectué en milieu liquide.
- catégorie 3 : inacceptables si la valeur > M (la valeur > 10m lors du dénombrement
effectué en milieu solide et la valeur > 30m lors du dénombrement effectué en milieu liquide).
La valeur S constitue le seuil de toxicité : S= m.103
Avec un plan d‟échantillonnage à 3 classes (classes 1, 2, 3), les symboles n et c ont la même
signification que le plan à deux classes, mais il existe pour c un facteur de précision
supplémentaire qui est le nombre d‟échantillons tolérés dont les charges microbiennes sont
comprises entre m et M. La présence d‟échantillons entre m et M n‟est pas souhaitable mais
tolérée. Pour les valeurs supérieures à M, les lots ne peuvent pas être acceptés pour la
commercialisation.
Avec ce plan et en tenant compte de la tolérance analytique, l‟interprétation du lot se fait

comme suit :
a) La qualité du lot est considérée comme satisfaisante :
Si les valeurs observées sont ≤ 3m lors de l‟emploi d‟un milieu solide
Si les valeurs observées sont≤ 10m lors de l‟emploi d‟un milieu liquide
b) La qualité du lot est considérée comme acceptable

Si les valeurs observées sont comprises entre 3m et 10m (≤M) en milieu solide, entre
10m et 30m (≤M) en milieu liquide
Et c/n est inférieur ou égal au rapport fixé
c) La qualité du lot est considérée comme non satisfaisante :

 Lorsque c/n est supérieur au rapport fixé
 Dans tous les cas où les résultats obtenus sont supérieurs à M.
d) Le produit doit être considéré comme toxique ou corrompu, lorsque la
contamination atteint une valeur microbienne limite "S" qui est fixée dans le cas
général à S= m. 103.
a) plan à deux classes b) plan à trois classes

ms : milieu solide; ml : milieu liquide; t.a : tolérance analytique
1.3. Interprétations des résultats selon les normes algériennes (le journal officiel 1998)
Elle se fait comme décrit précédemment, sauf que le plan à deux classes n‟accepte aucune
tolérance de caractère analytique (la valeur limite est m et non plus : 3m pour les
dénombrements en milieu solide et 10 m pour les dénombrements en milieu liquide).
1.4. Choix du plan

Le plan est choisi en fonction de l‟estimation du risque pour la santé et du mode d‟utilisation
de l‟aliment. Les germes sont classés en fonction du risque qu‟ils font courir au
consommateur en :
- germes entraînant un risque sévère (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S. paratyphi,
Shigella dysenteriae, Brucella melitensis, Listeria monocytogenes, virus de l‟hépatite A).
- germes entraînant un risque moyen avec possibilité de large diffusion (Staphylocoques
entérotoxinogènes, Salmonella typhimurium et les autres sérotypes, autres Shigella, Vibrio
parahaemolyticus, Escherichia coli entéropathogènes, Streptocoques β hémolytiques).
- germes entraînant un risque moyen sans grande diffusion (Bacillus cereus, Brucella abortus,
Clostridium perfringens, Salmonella arizonae, Francisella tularensis,Yersinia enterocolitica,
Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, etc...).
2. Test de stabilité des conserves (Epreuve ou contrôle de stabilité)

2.1. Examen préliminaire (avant incubation)
Avant l‟incubation des boites servant au test de stabilité, elles doivent être soumises à un
examen préliminaire. Il faut relever les caractéristiques générales du produit : nature du
contenu, type et forme de l‟emballage, étiquetage, inscriptions réglementaires, code, etc. Les
étiquettes sont retirées et les boites sont marquées puis soigneusement examinées : les serti et
les autres types de joints sont particulièrement inspectés. L‟aspect général permet de définir la
conserve comme normale ou anormale. Dans le cas des boites métalliques classiques, on
utilise les qualificatifs :
 boite normale,
 boite flochée ou à bombage déformable,
 boite bombée (à bombage indéformable),
 boite fuitée (défaut d‟étanchéité visible).
Cet examen est pratiqué également sur les boites après incubation.
Les épreuves de stabilité sont exclues pour les conserves présentant des défauts majeurs
tels que, le bombement, le flochage et le fuitage.
2.2. Contrôle de stabilité

Ce contrôle s‟applique aux conserves normales : il est basé sur l‟incubation des boites qui
sont placées sur un papier filtre de manière à détecter facilement une fuite éventuelle.
L‟incubation a pour but de faciliter le développement des formes végétatives et de favoriser la
germination des spores qui auraient pu résister au traitement thermique appliqué. Elle est
différente selon que l‟on a affaire à un produit acide ou non acide :
 Dans le cas d‟un produit acide : l‟incubation d‟un échantillon à une seule température
est suffisante (de 25 à 37°C, de 7 jours à un mois).
 Dans le cas d‟un produit non acide : il est intéressant de mettre les conserves à deux
températures, l'une correspondant à l'optimum des bactéries mésophiles, l‟autre à celui
des bactéries thermophiles.
Les températures et temps d‟incubation varient beaucoup selon les auteurs. Les normes
françaises (V 08-401 et V 08-402) préconisent 21 jours d‟incubation à 32°C (pour tous les
produits) et 7 jours d‟incubation à 55°C (pour les produits peu acides seulement).
En plus des incubations aux différentes températures requises, une mise à la température
ambiante d‟une unité d‟échantillonnage témoin est indispensable.
En pratique, de nombreux laboratoires effectuent l‟incubation pour les mésophiles à 30°C.
Certains incubent à 37°C pendant un temps plus court (10 jours) mais cette pratique est à
déconseiller car cette température est trop élevée pour certains germes mésophiles.
En Algérie, les températures d‟incubation sont déterminées dans le journal officiel (JORA
1998), selon l‟origine animale ou végétale du produit et selon son pH (voir le journal officiel
page 23).
Après incubation des boites aux températures requises, divers types d’analyse sont
effectués. Les examens : macroscopique, organoleptique, physico-chimique et
microscopique sont effectués pour toutes les boites (boite non incubée ou témoin : mise à
température ambiante et boites incubées aux différentes températures).
2.3. Examen macroscopique

Avant l‟ouverture de la boite, noter soigneusement si la boite est normale (ne présentant ni
bombage ni des fuites), flochée ou anormale : fuitée (observation des traces sur le papier
filtre) ou bombée.
2.4. Examen organoleptique

Ouvrir la boite aseptiquement et noter soigneusement l‟aspect, la texture, la couleur et l‟odeur
du produit. Il ne faut jamais goûter.
2.5. Examen physico-chimique

Le pH est mesuré sur le produit en l‟état ou après homogénéisation dans le cas de produits
hétérogènes.
2.6. Examen microscopique

Il s‟effectue par coloration de Gram d‟un frottis préparé à partir de la suspension mère : un
échantillon de 25g de produit est broyé en présence de 100 ml d‟eau peptonée ou de diluant
tryptone-sel. Après coloration de Gram, le frottis est examiné au microscope.
La morphologie de la flore microbienne est soigneusement étudiée et le nombre moyen de

germes par champ microscopique est déterminé (sur 20 champs microscopiques).
Lorsque l‟on compare l‟examen microscopique d‟un produit incubé à celui d‟un produit
identique témoin non incubé, on peut calculer le facteur R=n/n0, n étant le nombre moyen de
germes dans le produit incubé et n0 celui dans le produit témoin.
2.7. Démonstration de la stérilité commerciale
Lorsque :
 Les boites incubées restent normales.

 On ne décèle aucune modification de texture, de couleur ou d‟odeur par rapport à la
boite témoin.
 Le facteur d‟examen microscopique R est ˂ 100.
 La différence de pH par rapport au témoin est ˂ 0,5 unité.
On considère que la conserve est stérile au moins au sens « commercial ».
2.8. Démonstration de la stérilité biologique par l’analyse microbiologique

Cette étude n‟est réalisée que pour les boites incubées. Elle nécessite outre les examens déjà
mentionnés, l‟ensemencement d‟un ou plusieurs milieux pour les flores sporulées (aérobie et
anaérobie) mésophile et thermophile, après préparation de la suspension mère et des dilutions
décimales (jusqu‟à a 10-3). Les milieux utilisés doivent contenir de l‟amidon (0,2%) pour
lever la dormance des spores.
a) Bactéries sporulées aérobies mésophiles

Elles sont dénombrées par ensemencement de 0,1 ml de la suspension mère et de ses
dilutions, à la surface de gélose PCA (Plat Count Agar) à 0,2% d‟amidon. L‟incubation est de
72h à 30°C.
b) Bactéries du « flat sour »

Elles sont dénombrées par ensemencement de 0,1 ml de la suspension mère et de ses
dilutions, à la surface de gélose PCA à 0,2% d‟amidon. L‟incubation est de 48h à 55°C.
Remarque : En milieu solide, les contaminations accidentelles sont fréquentes : il est donc
nécessaire de préparer des boites de Pétri témoins non ensemencées que l‟on incube avec les
autres.
c) Bactéries sporulées anaérobies mésophiles

Elles sont dénombrées par inoculation de quelques ml de la suspension mère et de ses
dilutions, dans un milieu liquide viande-foie à 0,2% d‟amidon. 3 tubes sont ensemencés.
L‟incubation est de 72h à 30°C.
d) Bactéries sporulées anaérobies thermophiles
Elles sont dénombrées par inoculation de quelques ml de la suspension mère et de ses
dilutions, dans un milieu liquide viande-foie à 0,2% d‟amidon. 3 tubes sont ensemencés.
L‟incubation est de 48h à 55°C.
2.9. Méthode d’interprétation des résultats du test de stabilité des conserves
Il faut être prudent en ce qui concerne l‟interprétation des tests de stérilité. En milieu solide,
les contaminations accidentelles sont fréquentes : il est donc nécessaire de préparer des boites
de Pétri témoins non ensemencées que l‟on incube avec les autres. En milieu liquide, si un
seul tube sur trois est positif, on peut considérer aussi que la contamination est accidentelle.
Un examen microscopique (Gram) permet de mieux juger la situation : il s‟agit de germes
Gram (-) ou de cocci ou de bactéries corynéformes Gram (+), la contamination extérieure est
probable; s‟il s‟agit de bacilles typiques Gram (+), il faut être prudent. L‟idéal est évidemment
la stérilité biologique absolue mais en fait on tolère souvent la présence de rares spores de
Bacillaceae inertes, c‟est-à-dire non pathogènes ni toxinogènes et incapables de se multiplier
(1 ou 2/ g).
En pratique, les conserves doivent satisfaire au test de stabilité. A ce sujet, on peut
différencier le cas des conserves destinées aux pays tempérés qui n‟ont besoin d‟être stables
qu‟à 30°C de celui des conserves aux pays chauds où la stabilité doit être bonne à 30°C et
55°C.
Au niveau de la composition microbiologique proprement dite, on distingue le cas des
conserves acides et des non acides.
a) Pour les produits acides, il faut exiger :

 absence de germes acidophiles (lactobacilles, levures, moisissures),
 absence des sporulés thermophiles,
 absence de germes pathogènes (Salmonella, Staphylococcus).
On tolère la présence de spores de Bacillus inertes.
b) Pour les produits peu acides, il faut exiger en outre :

 absence de Clostridium toxinogènes,
 absence de toxines.
La stérilité biologique est exigée par certains pays.
Dans tous les cas, l‟examen microscopique direct ne doit pas révéler plus de 30 bactéries sur
20 champs microscopiques.
2.10. Recherche des causes d’altérations en cas des boites anormales
Lorsque les boites sont anormales soit par leur aspect, soit par l‟examen général décrit
précédemment, une étude microbiologique plus ou moins complète est réalisée. On effectue la
série d‟analyses décrite pour la démonstration de la stérilité biologique plus d‟autres
analyses pour rechercher les causes d‟altérations :
- Dénombrement de la flore aérobie mésophile totale
- Dénombrement des germes indologènes
- Dénombrement des germes putrides
- Dénombrement des lactobacilles
- Dénombrement des staphylocoques
- Dénombrement des germes anaérobies sulfito-réducteurs
- Dénombrement des levures et moisissures
- Recherche de Salmonella
3. Numération de la flore mésophile aérobie totale (FMAT)

3.1. Définition et intérêt
Il s‟agit du dénombrement surtout des bactéries aérobies mésophiles revivifiables après 72 h
d‟incubation à 30°C dans un milieu de culture bien défini.
Ce dénombrement reflète la qualité microbiologique générale d‟un produit naturel et permet
d‟en suivre l‟évolution. La charge de la FMAT pourra donner une indication de l‟état de
fraîcheur ou de l‟état de décomposition du produit. Au cours des traitements technologiques
(ou dans le cas des produits manipulés), le dénombrement de cette flore permettra de juger
l‟incidence des diverses opérations.
Il est très important de savoir qu‟un nombre très élevé de germes totaux peut correspondre à
un produit sain (laits fermentés) alors qu‟un petit nombre de germes peut ne pas correspondre
à un produit sain (présence de germes pathogènes, présence de toxines actives).
3.2. Méthodologie
Ce dénombrement est réalisé en milieu solide selon différentes méthodes.
3.2.1. Dénombrement après culture sur milieu solide (méthode classique)
1 ml de du produit ou de la suspension mère et de ses dilutions est ensemencé dans la masse
du milieu gélosé de numération = gélose plate count agar (PCA) (15 ml de milieu à 45⁰C). Il
est recommandé de ne pas attendre plus de 15 minutes entre la préparation de la suspension
mère et ses dilutions et le moment où la gélose est coulée. Il est également recommandé de
couler à la surface du milieu ensemencé (après solidification) une mince couche de gélose
blanche ou gélose non nutritive (4 ml de gélose).
Gélose blanche (eau gélosée):
- Gélose 15g
- Eau distillée 1000 ml
pH 7 ; autoclavage 20 minutes à 120 ⁰C.
Cette numération peut être réalisée par étalement en surface au moyen d‟un râteau, de 100 μl
du produit et de ses dilutions; l‟étalement au moyen du râteau doit être effectué
immédiatement avant que ces 100 μl ne soient absorbés en totalité dans la gélose.
La lecture se fait après 72 heures d‟incubation à 30°C.
3.2.2. Dénombrement après filtration sur membrane

Cette méthodologie est particulièrement utilisée dans le cas des liquides alimentaires (eau,
jus,…) pour lesquels la concentration en microorganismes est relativement faible et/ ou pour
lesquels le dénombrement sur un grand volume est nécessaire.
Un volume donné (100 ml généralement) de l‟échantillon ou de sa dilution est filtré sur

membrane, qui sera ensuite déposée en surface de la gélose PCA, préalablement coulée,
(surface porteuse des germes vers le haut). Après 48 à 72 heures d‟incubation à 30°C, les
colonies ont comptées.
Figure 01 : Coupe schématique d’un appareil de filtration sur membrane
3.2.3. Dénombrement au moyen du Pétrifilm
Il s‟agit d‟un système de culture / numération à “usage unique”. Un Pétrifilm est constitué
d‟un film inférieur quadrillé qui sert de support à une couche mince de milieu gélosé
déshydraté (PCA). Le film supérieur est un film souple, porteur d‟un gel soluble à l‟eau froide
et d‟un adhésif additionné d'un indicateur d'oxydoréduction facilitant la lecture par sa
réduction (TTC: chlorure de triphényltétrazolium se réduit en formozan rouge).
Pour réaliser la numération, il faut déposer le film sur une surface plane et dans une zone
stérile, soulever le film supérieur et déposer lentement 1 ml de l‟échantillon ou de ses
dilutions au centre du film inférieur. Celui-ci est alors recouvert délicatement avec le film
supérieur en évitant l‟introduction de bulles d‟air. La répartition homogène de l‟inoculum est
obtenue au moyen d‟un applicateur plastique avec lequel on exerce une légère pression sur le
diffuseur. Attendre une minute pour permettre au gel de se solidifier. Le film est alors incubé
horizontalement. Après 48 à 72h d‟incubation à 30°C, le comptage des colonies est effectué.
Figure 02 : Mode d'emploi de Pétrifilm
4. Recherche d'une contamination d'origine fécale
4.1. Coliformes, coliformes thermotolérants, E.coli, entérobactéries

4.1.1. Définitions
 Entérobactéries : bacilles à Gram -, asporulés, aéro-anaérobies facultatifs, oxydase-,
nitrate réductase+, glucose+ avec ou sans production de gaz.
 Coliformes : entérobactéries qui fermentent le lactose avec production de gaz à 30°C. Ils
comprennent entre autres les genres : Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter,
Serratia.
 Coliformes thermotolérants (fécaux) : coliformes fermentant le lactose avec production
de gaz à 44°C. Ils comprennent entre autres les espèces suivantes : Citrobacter freundii,
Citrobacter diversus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Klebsiella wisconsensis,…
 Escherichia coli présumés : coliformes thermotolérants produisant de l‟indole à 44°C.
 Escherichia coli : coliformes thermotolérants produisant de l‟indole, et ont les caractères
biochimiques de cette espèce.
4.1.2. But
Les coliformes sont des bactéries qui vivent dans l‟intestin, mais aussi dans l‟environnement.
Leur présence en concentration excessive dans un aliment, signifie donc une contamination
fécale, c‟est-à-dire un contact anormal entre aliment et matières fécales. Cependant cette
spécificité est limitée par l‟existence de coliformes dans l‟environnement. Elle est plus grande
avec les coliformes thermotolérants et tout particulièrement E. coli qui résiste mal dans les
conditions externes et signifie davantage une contamination fécale récente de l‟aliment. En
plus, les coliformes thermotolérants sont souvent associés à des entérobactéries pathogènes
comme les Salmonella et les Shigella.
4.1.3. Colimétrie en milieu liquide (méthode du NPP)

La numération des coliformes est réalisée par ensemencement de 1 ml de l‟aliment (ou de sa
suspension mère) et de ses dilutions dans un bouillon lactosé bilié au vert brillant (BLBVB).
Les séries contiennent 2, 3 ou 5 tubes (selon le système choisi) et les résultats sont analysés
par la méthode de Mac Grady. Chaque tube contenant 10 ml de BLBVB est préalablement
muni d'une cloche de Durham destinée à piéger le gaz. Dans le milieu BLBVB, le vert brillant
inhibe les bactéries Gram+, la bile inhibe la plupart des bactéries qui ne sont pas d‟origine
intestinale. Après ensemencement, les milieux sont incubés à 37°C pendant 48 h. Sont
considérés comme positifs les tubes dans lesquels il y a un trouble du milieu et une production
notable de gaz (1/10e au moins du volume de la cloche).
La numération des coliformes thermotolérants est effectuée avec le même milieu mais après
48 heures d‟incubation à 44°C.
La numération des coliformes thermotolérants et les E.coli présumés est réalisée par le test de
Mackenzie (figure 03) à partir des tubes positifs coliformes (+) : une öse d‟un tube positif est
inoculée dans un tube de BLBVB avec cloche, et une autre dans un tube d‟eau peptonée. Les
deux tubes sont incubes à 44°C pendant 48h.
Figure 03 : Test de Mackenzie

Après incubation, s‟il y a production de gaz (BLBVB) et d‟indole (mis en évidence par
addition de réactif de Kovacs dans le tube d‟eau peptonée) on peut soupçonner la présence
d‟E. coli dans le tube initial (voir tableau 01 pour les autres interprétations possibles). Il faut
noter cependant que certaines entérobactéries (Klebsiella oxytoca et certaines espèces de
Citrobacter) peuvent donner une réaction positive et donc un résultat erroné. De ce fait, par le
test de Mackenzie, on ne peut dénombrer que les E.coli présumés. Il faut alors procéder à une
identification à partir des tubes coliformes thermotolérants positifs, pour dénombrer E.coli.
Tableau 01 : Lecture et interprétation du test de Mackenzie
4.1.4. Colimétrie en milieu solide

a) Milieux
La numération des coliformes peut être effectuée en gélose lactosée biliée au cristal violet et
au rouge neutre (gélose VRBL : violet red bile lactose agar) ou en gélose au désoxycholate
0,1% (gélose lactosée au désoxycholate = gélose DL : désoxycholate-lactose). Ces milieux
contiennent du désoxycholate et du cristal violet, inhibiteurs des bactéries Gram +, du lactose
et le rouge neutre comme indicateur de pH.
b) Ensemencement
Introduire 1 ml de produit ou de ses dilutions dans une boîte de Pétri, puis verser 13ml du
milieu en surfusion (45°C) et homogénéiser. Après solidification, couler 5 à 8 ml du même
milieu à la surface (double couche). Après nouvelle solidification, incuber pendant 24 h à
30°C (ou 37°C) pour les coliformes totaux et à 44°C pour les coliformes fécaux.
c) Lecture
Toutes les colonies rouges (bactéries lactose +) sur gélose DL ou rouges violacées sur gélose
VRBL, d‟un diamètre voisin de 0,5 à 1 mm, sont considérées comme étant des colonies de
coliformes. Les entérobactéries lactose (-) comme Salmonella, Shigella et Proteus et les
Pseudomonas donnent des colonies incolores.
4.1.5. Colimétrie après filtration

a) Milieu
Parmi les milieux les plus utilisés, le milieu Endo qui contient de la fuschine basique et le
sulfite de sodium, qui inhibent partiellement la flore contaminante à Gram positif.
b) Technique
Filtrer un volume connu du produit, de la suspension mère ou des dilutions. Après filtration,
déposer la membrane sur la gélose et incuber 24 h à 37°C pour les coliformes totaux et à 44°C
pour les coliformes fécaux.
c) Lecture
Les coliformes donnent des colonies rouges à éclat métallique, alors que les bactéries lactose -
donnent des colonies transparentes.
4.1.6. Colimétrie par le système Petrifilm

Le test Petrifilm pour les coliformes contient un milieu VRBL, un agent gélifiant soluble dans
l‟eau froide et un indicateur coloré (TTC) facilitant la lecture. La fermentation du lactose par
les coliformes s‟accompagne de la production de gaz, qui est piégé par le film supérieur et
s‟accumule autour des colonies de coliformes qui sont colorées en rouge. La numération des
coliformes totaux et celle des coliformes thermo tolérants est réalisable par incubation
respective à 37°C et 44°C pendant 24 h.
4.1.7. Dénombrement des entérobactéries
La numération des entérobactéries est intéressante au niveau industriel comme test de qualité
hygiénique globale : elles peuvent être considérées comme indicatrices de mauvaises
conditions de manipulation et de fabrication.
Le milieu généralement utilisé est la gélose biliée au cristal violet et au rouge neutre (gélose
VRBG : violet red bile glucose agar).
Après ensemencement dans la masse de 1 ml à partir du produit ou de ses dilutions,
l‟incubation est faite à 30°C pendant 24 h.
Les entérobactéries donnent des colonies rouges d‟un diamètre ≥ 0,5 mm.
4.1.8. Numération d’Escherichia coli

Le dénombrement des E.coli peut être réalisé à la suite de la colimétrie (en milieu liquide) ou
directement sur milieu gélosé.
a) Numération après colimétrie

Suite au test de Mackenzie, une identification est faite après isolement sur un milieu EMB
(milieu à l'éosine et au bleu de méthylène), inoculé à partir des tubes BLBVB positifs à 44°C
(correspondants aux E.coli présumés).
La gélose EMB contient deux colorants : la fuschine basique et le bleu de méthylène, inhibant
partiellement les bactéries Gram +. Après 24 h d‟incubation à 37°C, les colonies de 2 à 3 mm
de diamètre, violettes avec un reflet métallique, seront identifiées par la galerie classique ou
par la galerie miniaturisée API 20 E.
On considère comme E. coli toute souche glucose+ lactose + gaz + donnant les caractères :
indole+, rouge de méthyl RM+, Voges Proskauer VP-, citrate-, mannitol+ et uréase-.
b) Numération directe en milieu gélosé

Elle est réalisée sur milieu sélectif chromogène TBX (tryptone, bile, X-Glucuronate) mettant
en évidence des colonies β-glucuronidase +.
Après ensemencement dans la masse de 1 ml à partir du produit ou de ses dilutions,
l‟incubation est faite à 44°C pendant 24 h.
Après incubation, compter les colonies bleues (β-glucuronidase +) caractéristiques d'E.coli.
4.2. Dénombrement des streptocoques fécaux (entérocoques)

4.2.1. Définition et intérêt
Les streptocoques fécaux regroupent l‟ensemble des streptocoques possédant l‟acide
teichoïque caractéristique du groupe D de Lancefield, c‟est-à-dire essentiellement :
Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans, E. hirae, Streptococcus bovis, S. suis et S.
equinus.
Ces bactéries sont des hôtes normaux de l‟intestin de l‟homme et des animaux, leur nombre
variant de 105 à 107 par g de matière fécale. Néanmoins, elles n‟indiquent pas toujours une
contamination fécale car elles sont très répandues dans la nature (sol, air, eaux, végétaux).
Les entérocoques ne sont généralement pas considérés comme pathogènes du point de vue
alimentaire. Cependant, ils peuvent être exceptionnellement associés à des cas d‟intoxications
bénignes ou parfois se révéler des pathogènes opportunistes. De ce fait, on tolère en général
moins de 103 streptocoques fécaux par g ou ml d‟aliment.
4.2.2. Numération en milieu liquide

Cette numération se fait en deux étapes :
a) Test présomptif
Ce test est effectué par ensemencement du milieu Rothe, qui contient de l‟azide de sodium
(NaN3) inhibant la plupart des microorganismes. Ce milieu est moins sélectif que le milieu
Litsky.
1 ml de la suspension mère (et de ses dilutions) est ensemencé dans 10 ml de milieu selon la
méthode de NPP. Après 24 h à 48 h d‟incubation à 37°C, on considère comme positif tout
tube présentant un trouble bactérien. Ces tubes sont soumis au test confirmatif.
b) Test confirmatif
L‟addition d'éthyl violet au milieu de Rothe le rend sélectif des seuls streptocoques fécaux car
il freine le développement d'autres bactéries Gram (+), alors qu'il ne gène pas celui des
streptocoques. Le milieu de Litsky est en fait du milieu de Rothe additionné de 0,5 mg d'éthyl
violet par litre.
Ce milieu est ensemencé à partir d‟une öse prélevée dans les milieux de Rothe positifs. Après
24 h d‟incubation (ou 48 h) à 37°C, on considère comme positif tout tube présentant un
trouble bactérien. Parfois, la culture s'agglomère au fond du tube en fixant le colorant et en
formant une pastille violette de signification identique à celle du trouble. Il faut noter que les
bactéries ayant cultivé en milieu Litsky sont soupçonnées être des entérocoques, donc une
confirmation doit être faite par isolement suivi d‟une identification.
4.2.3. Numération en milieu solide

Cette méthode n‟est utilisable qu‟en présence d‟un grand nombre de streptocoques fécaux.
a) Milieu de Slanetz et Bartley
Ce milieu contient le TTC et l'azide de sodium.
Après ensemencement à la surface, incuber 24 h (ou 48 h) à 37°C.
Les streptocoques fécaux donnent sur ce milieu des petites colonies rouges ou roses.
b) Milieu KF (Kenner Fécal) streptocoque

Ce milieu contient l'azide de sodium, le pourpre de bromocrésol et le TTC ajouté après
stérilisation.
Les streptocoques fécaux donnent des colonies roses, rouges ou marron, entourées d‟un halo
jaune après 24 heures d‟incubation à 37°C.
4.2.4. Isolement
Le milieu D-Coccosel (BEA: bile-esculine-azide) permet l‟isolement sélectif des
entérocoques. Les streptocoques du groupe D donnent de petites colonies translucides
entourées d‟un halo noir correspondant à l‟hydrolyse de l‟esculine (le dérivé phénolique
libéré: l'esculétine, forme un complexe noir avec les ions ferreux).
Les Staphylococcus cultivent sur ce milieu en donnant des colonies volumineuses, opaques,
sans halo noir. Il en est de même avec certaines levures et pour quelques germes à Gram
négatif.
4.3. Bactéries anaérobies sulfito-réductrices (Clostridium sulfito-réducteurs)

4.3.1. Définition et intérêt
Ces bactéries sont des hôtes normaux de l‟intestin de l‟homme et des animaux, mais on les
rencontre fréquemment dans la nature et en particulier dans le sol et dans les matières
organiques en voie de putréfaction. Ces germes sont très résistants en raison de leur caractère
sporulé. Parmi les Clostridium sulfito-réducteurs, C. perfringens occupe une place très
importante: il est très souvent à l‟origine de toxi-infections alimentaires.
La résistance des Clostridium sulfito-réducteurs est beaucoup plus importante des autres
indicateurs, ils sont parfois seuls survivants d‟une contamination fécale ancienne. Il est
difficile lorsqu‟ils sont seuls présents de conclure à une contamination fécale; lorsqu‟ils sont
présents aux cotes des autres indicateurs, ils confirment l‟origine fécale d‟une contamination.
4.3.2. Dénombrement des spores et des formes végétatives

Ce dénombrement est réalisé en anaérobiose (en tube ou dans une jarre) et repose sur
l‟appréciation de la réduction des sulfites en sulfures, qui précipitent avec les ions du fer, en
donnant les sulfures de fer de couleur noire. La réaction est la suivante :
6H+ + 6e- + SO 32- S 2- + 3 H2O
S2- + Fe++ FeS (noir)
a) Milieux
Les milieux utilisés sont : le milieu viande-foie (VF) sulfité et le milieu de Wilson-Blair, qui
sont répartis en tubes à raison de 20 ml par tube. Après régénération (10 minutes à 100°C) du
milieu et refroidissement à 50°C, ajouter à chaque tube 0,5 ml d‟une solution de sulfite de
sodium à 5 % et 0,2 ml (4 gouttes) de l‟alun de fer à 5 %.
b) Ensemencement
Les milieux sont ensemencés comme suit : 0,1 ml (ou 1 ml) de produit ou de ses dilutions est
introduit dans le milieu en surfusion à 45°C. Le tube est alors vissé et le mélange effectué par
retournement lent. Il faut éviter d‟oxygéner le milieu au cours de cette phase. Après
ensemencement, laisser refroidir et solidifier sur paillasse. Les tubes sont incubés à 37°C
pendant 24 à 48 heures.
c) Lecture
Les colonies des bactéries sulfito-réductrices sont très nettement noires; leur taille varie selon
l‟espèce. Clostridium perfringens produit des colonies de grande taille de 3 à 5mm de
diamètre. Le nombre des bactéries anaérobies sulfito-réductrices est exprimé par 1 g ou ml du
produit alimentaire.
4.3.3. Numération des spores
Le produit ou sa suspension mère est chauffée à 80°C pendant 10 minutes au bain marie, pour
détruire les formes végétatives. Les techniques déjà décrites sont alors applicables à cette
suspension (dilutions puis ensemencement) et permettent le dénombrement sélectif des spores
des bactéries anaérobies sulfito-réductrices.
5. Recherche et dénombrement de Clostridium perfringens

5.1. Définition
Il s‟agit d‟un bacille Gram+, sporulé, anaérobie strict et immobile. Le bacille (4 μm x 1 μm)
se présente isolé, en paires ou en courtes chaînettes. Le germe possède un pouvoir réducteur
élevé. La résistance de sa spore est très grande dans le sol, l‟eau, l‟eau de mer, l‟air, les
viandes, les légumes, les semi-conserves etc. C‟est une bactérie que l‟on rencontre
fréquemment dans les produits cuits puis refroidis lentement.
5.2. Numération
a) Milieux
Parmi les milieux de numération le milieu tryptone - sulfite - néomycine (TSN) et le milieu
tryptone - sulfite - cyclosérine (TSC) sont les plus utilisés. Ils sont rendus sélectifs par
l‟addition d‟antibiotiques (la néomycine, la polymyxine B ou la D cyclosérine). Ces milieux
peuvent être utilisés pour la numération des Clostridium sulfito-réducteurs,
b) Ensemencement
Après régénération du milieu TSC en tubes (20 ml), ajouter aseptiquement par tube 0,2 ml
d‟une solution stérile de cyclosérine à 40 mg/ml. Pour le milieu TSN, ajouter par litre du
milieu 10 ml de néomycine à 2mg/ml et 10ml de polymyxine à 5mg/ml.
Pour l‟ensemencement en tubes, ajouter au milieu complet, 1 ml d‟inoculum et mélanger
doucement par retournement. Pour l‟ensemencement en boîte de Pétri, à 10 ml de milieu à
45°C ajouter 0,1 ml de suspension mère (ou des dilutions). Après solidification ajouter 5 ml
de milieu. Incuber pendant 24 h à 46°C (en jarre anaérobie pour les boites).
c) Lecture
Les colonies colorées en noir sont des colonies des Clostridium sulfito-réducteurs et
présomptives de Clostridium perfringens. La confirmation de la appartenance à l‟espèce peut
être réalisée par les tests : nitrate réductase (+), lactose (+), gélatine (+), lécithinase (+). La
confirmation peut être également réalisée en repiquant les colonies sur gélose à l‟œuf de
Willis et Hobbs.
5.3. Tests de confirmation
A partir d‟une colonie prélevée sur TSN ou TSC, procéder à des repiquages sur les milieux
gélatine-lactose et nitrate mobilité ou sur milieu Willis et Hobbs.
a) Milieu gélatine-lactose
Le milieu réparti en tube est ensemencé par piqûre centrale. Après 24 heures d‟incubation à
37°C en anaérobiose, la présence de gaz, l‟acidification (jaunissement) et la liquéfaction de la
gélatine sont mises en évidence avec C. perfringens.
b) Milieu nitrate-mobilité
Après ensemencement par piqûre et incubation à 37°C pendant 24 h en anaérobiose,
C.perfringens immobile cultive le long de la ligne d‟ensemencement. Ajouter 5 gouttes des
réactifs nitrate réductase 1 et nitrate réductase 2 pour la recherche des nitrites. Clostridium
perfringens est nitrate réductase (+).
c) Milieu de Willis
Ce milieu permet de confirmer les caractères lactose (+) et lécithinase (+).
Au milieu régénéré, ajouter 10 % de suspension stérile de jaune d‟œuf diluée au 1/2 avec de
l‟eau distillée. Couler 15 ml de milieu par boîte et étaler sur une moitié de la boîte une goutte
de sérum anti Clostridium perfringens à 6000 unités/ml. Repiquer les colonies de façon
uniforme sur le milieu. Après 24 h d‟incubation à 37°C (ou mieux à 45°C) en anaérobiose, les
colonies de C. perfringens lactose (+) sont rouges. L‟activité lécithinase se traduit par la
présence d‟une zone de précipitation blanche opaque autour des colonies. Si on est en
présence de C. perfringens, il n‟y a pas de culture sur la moitié de la boîte contenant
l‟antisérum.
Les bacilles immobiles anaérobies stricts, Gram +, qui donnent des colonies noires en milieu
TSN ou TSC, lécithinase (+), réduisant les nitrates en nitrites, lactose (+), gélatinase (+) sont
considérés comme C. perfringens. On peut réaliser la recherche du sérotype par
séroagglutination sur lame avec chacun des 13 sérums correspondants aux sérotypes définis
par HOBBS.
5.4. Numération de Clostridium perfringens par titrage de l’α- toxine

a) Principe
Les cellules végétatives de C. perfringens sont peu résistantes aux conditions défavorables de
milieu externe. Elles meurent rapidement par exemple au cours de la réfrigération, de la
congélation et après pasteurisation. Des numérations de C. perfringens après entreposage de
l‟aliment à basse température ne sont donc pas possibles. L‟α-toxine produite au cours de la
croissance du germe est stable au froid et sa production est sensiblement proportionnelle au
nombre de cellules initiales. On peut donc l‟extraire quantitativement et obtenir une relation
avec le maximum de population initialement présente.
b) Méthode
- Broyer 25 g d‟aliment dans 100 ml de tampon HEPES pendant 2 minutes (Composition
du tampon HEPES : N-2-hydroxyéthylpipérazine N‟-2-éthane sulfonique 6 g, Na Cl 11,7
g, eau distillée 1000 ml. Le pH et ajusté à 8 avec Na OH 2 N)
- Centrifuger 20 minutes à 20000 g et à 5°C.
- Filtrer le surnageant.
- Transférer le filtrat dans un sac à dialyse. Concentrer à 5 ml contre 400 ml de
polyéthylène glycol (MM 20000). Le concentrât est ajusté à 7 ml.
- Préparer 10 tubes de 13 x 100 mm avec 0,5 ml de Na Cl à 0,85 % sauf le premier et le
dernier tube.
- Ajouter 0,5 ml d‟extrait au 1er et au 2ème tube ; mélanger le 2ème tube et transférer 0,5 ml
de ce tube au 3ème et ainsi de suite (dilutions 1, 1/2, 1/4, .... 1/256)
- Mélanger dans le dernier tube : 0,25 ml d‟extrait, 0,25 ml de NaCl à 0,85 % et 0,1 ml
d‟antitoxine α.
- Préparer une gélose au sang
- Faire des trous dans la gélose à l‟emporte-pièce (3 mm de diamètre) espacés de 3 cm
- Remplir chaque trou avec l‟extrait en commençant par la plus grande dilution
- Incuber 24 h à 35°C et mesurer l‟hémolyse. L‟extrait additionné d‟antitoxine doit être
négatif
- Ajouter au liquide restant des tubes 0,5 ml l„extrait de jaune d‟œuf (1 jaune d‟œuf + 250
ml de Na Cl à 0,85 %), centrifuger 20 minutes à 14000 g à 5°C; le surnageant est filtré sur
filtre 0,45 mm. L‟absence d‟activité de la lécithinase est indiquée par une opacité des
solutions. L‟extrait additionné d‟antitoxine doit donner une réaction négative.
Tableau 02: Interprétation des résultats du titrage de l’α- toxine
6. Recherche et/ou numération des Staphylocoques et S. aureus

6.1. But
Certains auteurs recommandent de considérer les staphylocoques comme indicateurs dans les
aliments crus : ils peuvent signaler des contaminations humaines par manipulation ou par voie
aérienne, ou une contamination originelle d‟un produit animal. Ce fait permet d‟accepter les
staphylocoques en petit nombre dans certains produits.
Certains Staphylococcus aureus peuvent produire des entérotoxines responsables des
intoxinations alimentaires. Néanmoins, S.aureus peuvent être recherchés et dénombrés
comme test d‟hygiène des procédés pour savoir s‟il y a ou non une contamination par le
personnel, étant soit hébergés dans le rhinopharynx de porteurs asymptomatiques, soit
présents au niveau d‟infections cutanées.
6.2. Enrichissement
Lorsque le nombre des staphylocoques est faible, un enrichissement sur des milieux liquides
peut être nécessaire. Les milieux utilisés sont :
a) Milieu de Zebovitz
Dans ce milieu, la concentration élevée en glycine inhibe fortement la flore secondaire
Gram+, alors que le chlorure de lithium inhibe la flore Gram-. Le pyruvate, le mannitol et la
glycine favorisent le développement des staphylocoques coagulase +. La formation de tellure
noir révèle la croissance de Staphylococcus et l‟intensité du noircissement dépend du nombre
des bactéries réductrices.
Ajouter au milieu, le tellurite de potassium à 1 % stérilisé par filtration (20 ml pour chaque
litre du milieu). Le milieu (10ml par tube) ensemencé par 1 ml de l'échantillon ou de ses
dilutions est incubé 24 h à 37°C. Les staphylocoques coagulase + réduisent le tellurite en
tellure métallique noir.
b) Milieu Giolitti Cantoni
Il a une composition proche de celle du milieu Zebovitz. Il est utilisé dans l'analyse des eaux.
Avant emploi, ajouter à chaque tube (10ml) de milieu, 0,1ml d'une solution de tellurite de
potassium à 0,5% stérilisée par filtration. Apres ensemencement du milieu par 1 ml de
l‟échantillon ou de ses dilutions, l‟incubation est faite penadant 24 h à 37°C. La formation de
tellure noir révèle la croissance de Staphylococcus.
c) Bouillon de Chapman
Ce milieu permet l‟enrichissement en staphylocoques du fait de sa teneur très élevée en sel
(15 %), étant donné que les staphylocoques sont halophiles.
A 10 ml de milieu, ajouter 10 ml de la suspension à enrichir (pour avoir une concentration
finale en Na Cl de 7,5 %). Incuber 24 h à 37°C. Les staphylocoques donnent un trouble au
milieu.
Après enrichissement, un isolement à partir des tubes positifs est réalisé sur les milieux
solides préconisés.
6.3. Numération sur milieux solides

Cette numération n‟est possible que si le nombre de staphylocoques dans le produit est
supérieur à 100 /g ou ml.
a) Milieu Chapman
C‟est un milieu hypersalé : il contient une forte teneur en Na Cl (7,5%) et inhibe la croissance
de nombreuses bactéries. Cependant, il est peu spécifique : d‟autres bactéries halophiles (des
Bacillus ou des corynébactéries) peuvent se développer. L‟utilisation du mannitol avec
production d‟acide se traduit par virage, du rouge au jaune, du rouge de phénol contenu dans
ce milieu.
La gélose est ensemencée en surface par 0,1 ml du produit ou de ses dilutions. La boîte est
incubée 24 à 48h à 37°C. Les colonies de Staphylococcus aureus sont rondes, régulières,
bombées, opaques et pigmentées en jaune-doré; elles sont entourées d‟un halo jaune
correspondant à une acidification à partir du mannitol (mannitol +). S.epidermidis donne des
colonies blanches sur fond rouge (mannitol -).
b) Milieu de Baird Parker

Ce milieu est plus sélectif que le milieu Chapman : il favorise mieux la croissance de
Staphylococcus, il évite les retards de croissance dus aux conditions hostiles dans de
nombreux aliments peu favorables aux staphylocoques. Dans ce milieu, le tellurite possède un
effet inhibiteur important et peut être réduit en tellure noir (rôle d'indicateur). La glycine et le
pyruvate sont des nutriments favorisant la croissance. Le chlorure de lithium inhibe les
germes Gram -.
Ajouter à 100 ml du milieu régénéré, 5 ml d‟une émulsion de jaune d‟œuf (15 ml de jaune
d'œuf prélevé aseptiquement et additionné de 35 ml d'eau physiologique stérile), 1 ml d‟une
solution de tellurite de potassium à 1% stérilisée par filtration. Ensemencer en surface 0,1 ml
de la suspension mère ou de ses dilutions et incuber 24 h à 37°C.
S. aureus donne des colonies noires, brillantes, convexes, de 1 à 1,5 mm de diamètre,
entourées d‟un halo opaque (lécithinase+) avec ou sans halo clair.
 S. epidermis donne des colonies noires, brillantes, de forme irrégulière.
 Micrococcus: très petites colonies marron sans halo.
 Bacillus : colonies irrégulières marron foncé.
 Levures : colonies blanches.
6.4. Numération en milieu liquide

Cette méthode est à utiliser si le nombre supposé de germes est inférieur à 10 par g ou ml
d‟aliment. Le milieu utilisé est le bouillon trypticase-soja.
Ensemencer avec 1 ml (ou 10 ml) de suspension mère ou de ses dilutions (séries de deux ou
de trois tubes: méthode de Mac Grady). Incuber 48 h à 37°C. Transférer une öse de chaque
tube positif (présentant un trouble) sur milieu de Baird Parker. Incuber les boîtes 24 h à 37°C.
Identifier la présence de colonies de staphylocoques. Réaliser la numération par la méthode
du NPP.
6.5. Identification
La recherche et le dénombrement des staphylocoques pathogènes peuvent être réalisés sur les
mêmes milieux utilisés pour les staphylocoques totaux, mais il faut ici caractériser le pouvoir
pathogène. L‟identification de S. aureus repose surtout sur la recherche d‟une coagulase libre,
du «clumping factor», d‟une ADNase, d‟une thermonucléase, d‟une hémolysine et des
protéines à activités particulières.
6.5.1. Recherche de l’activité coagulase

On ensemence d‟abord un bouillon cœur-cervelle (bouillon pour recherche de la
staphylocoagulase). Après ensemencement du bouillon, incuber 24 h à 37°C. Après
incubation, 0,5 ml de milieu est mélangé à 0,5 ml de plasma de lapin. Le mélange est incubé à
37°C et observé toutes les 30 minutes. La prise en masse du plasma est généralement totale.
6.5.2. Recherche du clumping-factor (coagulase liée)

a) Principe : S. aureus possède au niveau de leur paroi un récepteur du fibrinogène. Dans ce
test, des hématies de mouton sensibilisées par du fibrinogène sont agglutinées en présence
d‟une souche de S. aureus porteuse du récepteur.
Figure 04: Principe de la recherche du clumping factor
b) Technique : sur une lame, déposer une goutte d‟hématies témoins (-) et une goutte
d‟hématies sensibilisées (+). Dans ces gouttes, disperser 1 à 2 colonies à l‟aide de l‟anse ou
d‟une pipette Pasteur; donner à la lame un léger mouvement de rotation. Lire la réponse après
15 secondes. Une réponse positive correspond à une agglutination massive avec les hématies
sensibilisées.
Figure 05: Test d'agglutination sur lame
6.5.3. Recherche d’une ADNase

Ensemencer le milieu contenant l'ADN par strie unique. Incuber 24 heures à 37°C. Inonder la
surface de la gélose avec une solution d‟acide chlorhydrique N, ou avec une solution à 0,1 %
de bleu de toluidine. Après 5 minutes on observe dans les cas d‟une réaction positive :
- avec l‟acide chlorhydrique, une zone claire autour de la strie (placer la boîte sur fond noir)
- avec le bleu de toluidine, une zone rose autour de la strie, le reste de la boîte étant bleu.
6.5.4. Recherche d’une thermonucléase

La présence d‟une thermonucléase est recherchée à partir d‟une culture en milieu cœur-
cervelle, chauffée à 100°C pendant 15 minutes. On dépose ensuite 5 à 10 μl de l‟inoculum
dans des puits creusés dans une gélose ADN-bleu de toluidine. Après 4 h d‟incubation à
37°C, la gélose devient rose autour des puits contenant la thermonucléase.
La présence d‟une ADNase thermostable (thermonucléase) semble être en bonne corrélation
avec le pouvoir entérotoxinogène des souches de S.aureus.
6.5.5. Détection immunologique de l’ADN ase thermostable : test d’inhibition en gélose

a) Principe: S.aureus possède une nucléase thermostable d‟une grande spécificité
antigénique. Le test consiste à comparer l‟activité ADNasique d‟une culture bactérienne sur
une plaque gélosée contenant ou non un anticorps antinucléase, l‟antisérum étant en quantité
suffisante pour inhiber cette activité. En présence de bleu de toluidine et d‟ADN dans la
gélose, une activité nucléasique provoque la formation d‟un halo rose.
b) Technique : Sur une plaque gélosée contenant de l‟ADN et du bleu de toluidine et de
l‟antisérum sur sa moitié, introduire 7 μl de la culture à tester dans les puits. Incuber à 37°C
pendant 2h.
partie sans antisérum partie avec antisérum Interprétation
Staphylococcus aureus
Autre espèce ne produisant

pas de nucléase
Staphylococcus non aureus

produisant une
nucléase de spécificité antigénique
différente
Figure 06: Test d'inhibition en gélose
6.5.6. Recherche de la protéine A

a) Principe : la protéine A est un antigène porté à la surface de S.aureus. Elle peut fixer un
fragment Fc des immunoglobulines de lapin ou de l‟homme. Des hématies de mouton
sensibilisées par Ig G de lapin anti-hématies de mouton sont agglutinées en présence de
S.aureus porteurs de protéine A.
Figure 07: Principe de la recherche de la protéine A
b) Technique : le test est réalisé à partir du milieu gélose nutritive, gélose Mueller Hinton ou
tryticase-soja (pas Chapman ni gélose au sang). La réponse + correspond à une agglutination
en moins de 2 minutes.
Figure 08: Technique de la recherche de la protéine A
6.5.7. Recherche des entérotoxines par la technique d’immunodiffusion double en gel

d’agarose
Cette méthode est basée sur la diffusion d‟antigènes et d‟anticorps en gel d‟agarose à partir de
puits creusés. Lorsque les molécules d'anticorps anti-entérotoxine rencontrent les molécules
d'entérotoxine, la liaison antigène-anticorps conduit à la précipitation des complexes immuns
dans la zone de rencontre. Les précipités se présentent sous la forme d‟un arc blanchâtre
visible à l‟œil nu. Ces toxines peuvent être recherchées par test immunoenzymatique (ELISA)
Figure 09: Recherche des entérotoxines staphylococciques par immunodiffusion
7. Recherche de Salmonella (et de Shigella)

Les Salmonella sont des bactéries toujours pathogènes provoquant des toxi-infections qui
peuvent être graves. Les viandes sont les vecteurs les plus communs, mais toutes les variétés
d‟aliments peuvent être contaminées par ces bactéries. La dose infectante est parfois très
faible et dépend de l‟espèce et du consommateur. La recherche de ces germes s‟effectue par
des tests présence/ absence et la norme est de 0 bactérie par g.
La recherche des Salmonella par la méthode “traditionnelle” nécessite plusieurs phases:
- un pré-enrichissement (revivification) qui est facultatif pour les produits non soumis à
certains types de traitements technologiques susceptibles de “stresser” les bactéries
- un enrichissement sélectif (obligatoire)
- un isolement sélectif
- une identification biochimique
- un sérotypage
Figure 10: Méthodologie de la recherche de Salmonella
7.1. Pré-enrichissement
25 g d‟aliment sont broyés dans 225 ml d'eau peptonée tamponée pendant 2 minutes.
L‟incubation est réalisée pendant 16 h au moins et 24 h au plus à 37°C.
7.2. Enrichissement
Plusieurs milieux d‟enrichissement sont utilisables :
a) Milieu de Muller Kauffmann au tétrathionate
Au moment de l‟emploi ajouter 19 ml (pour 1litre du milieu) de solution iodo iodurée (5 g de
KI, 5 g d‟I2, eau D 20 ml) et 9,5 ml de vert brillant à 0,1 %. L‟addition de 40 mg de
novobiocine inhibe les Proteus.
1 à 2 ml de milieu de pré-enrichissement sont ajoutés à 10 ml de ce milieu. Réaliser deux
tubes par essai. L‟incubation est réalisée sur chaque tube respectivement à 42°C et 37°C
pendant 24 h (ou 48 h).
Dans ce milieu le thiosulfate se transforme en tétrathionate en présence d‟iode. Le
tétrathionate inhibe la croissance des coliformes et des autres bactéries intestinales. Les
Salmonella réduisent le tétrathionate et ne sont pas inhibés. La bile de bœuf stimule la
croissance de Salmonella et inhibe les germes d‟origine non intestinale. Le vert brillant inhibe
les bactéries Gram+.
b) Bouillon au sélénite et à la cystine

Ce milieu est mieux adapté au contrôle des aliments. Il contient du sélénite de sodium qui
inhibe les bactéries Gram +.10 ml de milieu de pré-enrichissement sont ajoutés à 100 ml de
bouillon au sélénite. Deux tubes sont réalisés, l‟un étant incubé à 37°C, l‟autre à 43°C pendant
24 à 48 h.
7.3. Isolement
A partir d‟une öse ou d‟une goutte d‟un des milieux d‟enrichissement, on réalise un isolement
sur l'un des milieux suivants :
a) Milieu Salmonella Shigella (SS)
Après 48 h d‟incubation à 37°C, les colonies se présentent sous les aspects suivants:
 colonies transparentes sans centre noir (Salmonella, Shigella, Serratia, Proteus morganii,
Enetrobacter hafniae)
 colonies transparentes à centre noir (Salmonella, Citrobacter, Proteus vulgaris, Proteus
mirabilis).
 colonies rouges (Enterobacter, Klebsiella) à centre noir (Citrobacter freundii, Arizona).
b) Milieu au vert brillant et au rouge de phénol
Après inoculation incuber 24 h à 37°C. Les dégradations du lactose et du saccharose sont
mises en évidence par le rouge de phénol. Le vert brillant inhibe la flore Gram +. Les
Salmonella sont lactose- et saccharose-, elles donnent des colonies rouges (ou roses)
entourées d‟une zone rouge franc. Les Proteus produisent parfois des colonies similaires. Les
colonies lactose ou/et saccharose+ sont jaune-verdâtres et entourées d‟une coloration
identique.
c) Milieu DCL (désoxycholate, citrate, lactose)

Ce milieu se caractérise par sa teneur élevée en désoxycholate. Il inhibe la croissance des
germes Gram+ et partiellement celle de nombreuses entérobactéries (Klebsiella, Enterobacter,
Citrobacter). L‟incubation est réalisée à 37°C pendant 24 h. Sur ce milieu les germes lactose+
donnent des colonies rouges ou rosées. Salmonella donne des colonies incolores à blanchâtres
(Salmonella H2S-) avec un centre noir (Salmonella H2S+).
7.4. Identification biochimique

La reconnaissance des colonies ne permet pas d‟identifier Salmonella mais donne une bonne
présomption (leur aspect peut varier en fonction des souches isolées, mais aussi en fonction
des milieux).
La recherche du biotype se fait par la méthode classique (Kligler, urée-indole, LDC, ß-
galactosidase, Clark et Lubs, citrate) ou par un minisystème de type API.
Le pourcentage de Salmonella donnant un caractère + ou - est indiqué ci-dessous.
Tableau 03: Principaux caractères biochimiques des Salmonella
7.5. Sérotypage
Le genre Salmonella comprend plus de 2000 sérotypes. Ils se différencient par leurs antigènes
somatiques O, de surface Vi et flagellaires H. L'antigène O sert à différencier les groupes.
L‟antigène Vi sert à différencier des sérotypes dans les groupes C et D. Cet antigène de
surface rend O-inagglutinables S. Typhi et S. Paratyphi C et S. Dublin.
Les antigènes H définissent les sérotypes dans les groupes et peuvent se trouver sous 2 aspects
(ou phases) dénommés 1 et 2.
La recherche du sérotype selon Kauffmann White exige la présence :
- de sérums O polyvalents
OMA (agglutinines des groupes A, B, D, E, L)
OMB (agglutinines des groupes C, F, G, H)
OMC (agglutinines des groupes I, J, K, M, N, O, P)
OMD (agglutinines des groupes X, Y, Z)
OMF (agglutinines des groupes 54 à 59)
OMG (agglutinines des groupes 60 à 67).
- de sérums O monovalents
- de sérums H polyvalents
- de sérums H monovalents
- du sérum Vi
Méthodologie
La souche à sérotyper est cultivée sur gélose nutritive (24 h - 37°C).
1 - On s‟assure que la souche est smooth (S) : on place une goutte d‟eau physiologique sur
une lame et on y émulsionne un peu de culture microbienne en agitant doucement.
L‟apparition d‟agglutinats indique que la souche est en phase R (rough) et qu‟elle ne peut être
soumise au sérotypage (souche auto-agglutinante). Dans ce cas, il faut réaliser un nouvel
isolement.
2 - on dépose sur une lame 1 goutte des différents sérums polyvalents (OMA et OMB surtout
car 98 % des Salmonelles rencontrées chez l‟homme et les animaux à sang chaud possèdent
un antigène O correspondant aux agglutinines contenues dans les sérums OMA et OMB) et on
y émulsionne un peu de culture. Après agitation douce on examine la goutte sur fond noir
pendant 5 minutes. Les agglutinations O sont lentes et fines.
3 - si l‟essai est négatif il peut s‟agir :
- d‟une Salmonella appartenant à un autre groupe non testé
- d‟une souche rendue O inagglutinable par masquage de ses antigènes O par des antigènes Vi
que l‟on recherche alors en testant avec le sérum anti Vi : si l‟essai est positif, on s‟oriente
vers les sérotypes : S. Typhi, S. Paratyphi C et S. Dublin, on teste alors avec les sérums O
monovalents correspondants sur un échantillon chauffé pendant 10 minutes à 100°C. Si
l‟essai est négatif, on teste avec les autres sérums polyvalents : OMC, OMD, OMF, OMG.
- d‟une bactérie n‟appartenant pas au genre Salmonella
4 - si l‟essai est positif on réalise des essais avec des sérums monovalents
5 - si l‟essai est positif on recherche les antigènes H phase 1 puis 2.
Tableau 04 : Quelques sérotypes de Salmonella selon Kauffmann White
7.6. Autres méthodes de recherche des Salmonella

La plupart des méthodes qualifiées de “rapides” requièrent encore les phases de pré-
enrichissement et d‟enrichissement.
7.6.1. L’immunofluorescence
Un frottis est réalisé sur une lame à partir de 1 μl de milieu d‟enrichissement. La technique
directe utilise des anticorps anti-Salmonella conjugués à la fluorescéine, la technique indirecte
utilise d‟abord des anticorps de lapin anti Salmonella H puis des anticorps de moutons
fluorescents anti-anticorps de lapin. Les lames sont observées au moyen d‟un microscope
équipé d‟un système d‟éclairage en fluorescence. Le seuil de détection est de 1 bactérie pour
100 champs soit environ 104 cellules/ml de milieu d‟enrichissement.
Figure 11: Représentation schématique d'une réaction d'immunofluorescence indirecte
7.6.2. L’immuno-enzymologie (ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

Elle permet la recherche des Salmonella dans les milieux d‟enrichissement. Il existe
actuellement deux principales modalités de cette technique qui font toutes deux appel à une
phase solide lors de la réaction, phase qui permet la fixation du complexe Ag-Ac (polystyrène
sous forme de billes, tubes, puits, fibres de verre, …etc.) :
a) Technique sandwich : l‟anticorps est dans ce cas fixé aux parois d‟un support solide. Le
produit contenant les antigènes est incubé dans ce récipient ce qui conduit à la formation d‟un
complexe Ag-Ac. Le conjugué Ac-enzyme est alors ajouté au système et forme un complexe
avec l‟anticorps ayant fixé l‟antigène. L‟addition du substrat de l‟enzyme permet de visualiser
la fixation. La réponse est proportionnelle à la quantité d‟antigène.
Figure 12 : Schéma d’un dosage ELISA par la technique Sandwich
b) Technique par compétition: dans ce cas,c‟est un antigène qui est fixé aux parois du
récipient hydrophobe. L‟échantillon susceptible de contenir un antigène de même nature est
ajouté dans le récipient. Dans l‟exemple ci-dessous 3 échantillons différents sont soumis à ce
type d‟analyse. L‟échantillon 1 a une concentration élevée en antigène, le 2ème une
concentration plus faible et le 3ème n‟en contient pas. Après addition du conjugué Ac-
Enzyme, la réaction Ag-Ac se produit et conduit, en fonction des concentrations en Ag libre
(à doser), à une fixation d‟Ac-Enzyme sur le support d‟autant plus importante que la quantité
d‟antigène à doser dans la solution est faible. Après lavage, l‟addition du substrat et sa
transformation en un produit coloré permet alors d‟évaluer l‟intensité de cette fixation
(coloration ++++ en absence d‟Ag, coloration ++ à faible concentration en Ag, pas de
coloration en présence de forte concentration en Ag). La réponse est inversement
proportionnelle à la quantité d‟antigène initialement présente dans le produit.
Figure 13 : Schéma d’un dosage ELISA par compétition
7.6.3. Le test 1-2 de Biocontrol

C'est un test qualitatif de détection des Salmonella mobiles. Ce test associe le pouvoir sélectif
du tétrathionate vis à vis des Salmonella et permet de détecter les flagelles de ces germes
après qu‟ils aient migré dans un milieu contenant des anticorps correspondants.
Figure 14: Schéma explicatif de test 1-2 de Biocontrol
Il s‟agit d‟un dispositif en matière plastique transparente constitué de deux chambres. La plus
petite, chambre d‟inoculation, contient un bouillon au tétrathionate. La plus grande, chambre
de migration, contient un milieu semi- solide peptoné renfermant des anticorps H polyvalents
(anti-flagellaires). Les bactéries qui cultivent dans le bouillon au tétrathionate et mobiles se
déplacent dans la chambre de migration où elles réagissent avec les anticorps anti-flagellaires.
Il se produit une agglutination des bactéries: développement d‟une immunobande visible à
l‟œil nu. La lecture se fait 24 heures après l‟ensemencement.
7.7. Recherche des Shigella

Les Shigella sont des germes pathogènes d‟origine humaine. Agents de maladies infectieuses
telles que la dysenterie bacillaire (Shigella dysenteriae), ils sont transmis par l‟eau et par les
aliments crus (salades, légumes etc...). L‟ingestion de quelques milliers de bactéries peut
provoquer la maladie. Les aliments à suspecter sont ceux qui sont manipulés sans chauffage et
dont le pH est compris entre 6,5 et 7,5.
La recherche de ces germes est réalisable avec la même méthodologie que celle utilisée avec
Salmonella. Le sérotypage est effectué à partir d‟une culture sur gélose ordinaire. Les
Shigelles possèdent des antigènes O, et quelques fois des antigènes K ; elles n‟ont pas
d‟antigènes H. Au laboratoire, on recherche le sérotype à l'aide de sérums A1, A2, B, C1, C2,
C3, D, qui identifient les antigènes O.
8. Recherche de Brucella
8.1. Recherche indirecte de Brucella
Cette recherche est effectuée dans le lait par sérologie. Un antigène de Brucella (souche
Londres 99) coloré à l‟hématoxyline ou au rose Bengale donne une réaction d‟agglutination
avec les anticorps de type IgG présents dans le lait des animaux malades.
Test de l’anneau
1 ml de lait est mélangé avec 1 goutte d‟antigène coloré. Si l‟échantillon de lait est positif,
lesantigènes colorés sont agglutinés et adhèrent aux globules gras qui, en s‟élevant dans le
lait, forment un anneau teinté. La rapidité de la réaction est fonction de l‟âge du lait testé et de
sa teneur en matières grasses. Elle est plus rapide sur un lait frais et est accélérée par
incubation à 37°C (lecture en 30 minutes).
 Test positif : anneau de crème bleu violet, lait sous jacent blanc
 Test négatif : anneau de crème blanc, lait sous-jacent bleu violet clair
 L‟intensité de la réaction est fonction du taux d‟agglutinines présentes dans le lait.
8.2. Clés d'identification de Brucella
Principaux caractères de Brucella : coccobacilles Gram- (1 μm x 0,5 μm) asporulés,
immobiles, aérobies stricts,uréase +, indole -, oxydase généralement +, catalase +, nitrate
réductase +, gélatinase -, VP-, RM-, hémolyse -, certaines souches exigent des atmosphères
enrichies en CO2. Leur croissance est faible et lente sur les milieux ordinaires.La culture se
fait sur des milieux enrichis (bouillon ou gélose à l'infusion de foie, gélose au sérum
pourBrucella, bouillon ou gélose Brucella).
L'identification est parfois réalisée en testant la croissance en présence de colorants. Il est
aussi possible d'utiliser une clé basée sur l'utilisation des substrats carbonés.
Tableau 05 : Caractéristiques des principales espèces de Brucella
Culture avec Culture avec

Espèce Glucose Ribose Xylose arabinose thionine fuschine
(1/25000) (1/50000)
B. melitensis + - - - +* +*
B. abortus + + - + - +
B. suis + + + +/- +* -*
*: un ou plusieurs sérotypes présentent des réactions différentes
9. Recherche et numération des Vibrio

Les Vibrio sont des bacilles Gram – asporulés, incurvés en virgule, très mobiles, aérobies ou
aéro-anaérobies selon les espèces. Ils fermentent les sucres sans production de gaz. Ils
forment des voiles à la surface des milieux de culture liquides. Sur les milieux gélosés, ils
donnent des colonies rondes, lisses, brillantes ou translucides. Leur température optimale de
croissance est de 20 à 30°C pour les saprophytes et de 37°C pour les pathogènes. Une de leurs
caractéristiques est qu'elles se multiplient mieux à pH alcalin.
9.1. Vibrio choleræ
L‟eau est le véhicule de choix de ce vibrion. Le vibrion du choléra est très mobile(cil polaire);
il se multiplie entre 10 et 40°C et cultive bien entre pH 7,6 et 9, ou dans des milieux salés
(3%). Il est inhibé par le sulfate de magnésium. V. choleræ est oxydase+, gélatine+, H2S-,
citrate+ (lentement), glucose+, amidon+, maltose+, mannose+, lactose-, dextrine+, indole+.
a) milieu d’enrichissement (eau peptonée alcaline)
1 ml d‟eau est additionné à ce milieu. Après 6 h d‟incubation à 37°C, on prélève une öse en
surface et on ensemence un second tube qui est à son tour incubé 6 h à 37°C ; l‟isolement est
réalisé à partir d‟une öse prélevée en surface.
b) milieux d’isolement
 gélose nutritive alcaline (pH = 9) :V. cholerae donne des colonies fines et blanches.
 milieu thiosulfate, citrate, sels biliaires, saccharose (TCBS)
La plupart des microorganismes sont inhibés en raison du pH élevé; certains Proteus et
Streptocoques D peuvent y cultiver. Ce milieu permet la croissance rapide de V. cholerae en
15 h à 37°C. V. cholerae donne des colonies jaune brun (saccharose+) de 2 à 3 mm de
diamètre.Un examen microscopique entre lame et lamelle doit être fait pour examiner la
morphologie des bactéries : forme incurvée, flagelle polaire unique, ainsi que la mobilité.
L'identification biochimique peut être réalisée à l'aide d'une API 20E ou de préférence une
API NE.
9.2. Vibrio parahæmolyticus

Il s‟agit d‟un germe d‟origine marine, halophile. Il a d‟abord été à l‟origine de gastroentérites
au Japon, pays où le poisson est parfois consommé cru. Tous les produits de la mer sont
susceptibles d‟être contaminés par cette bactérie.
La préparation de la suspension mère destinée à l‟analyse, à partir de poisson ou de crustacé,
est toujours réalisée en milieu salé (NaCl 3 %).
9.2.1. Numération et isolement
La numération peut être réalisée sur bouillon glucosé au teepol-méthyl-violet ou sur bouillon
TCBS selon la méthode NPP. Ces milieux peuvent être utilisés comme milieux
d'enrichissement : ensemencer avec 1 ml des dilutions (10-1à 10-4) et incuber 18 h à 37°C.
Après incubation, une öse des tubes positifs est ensemencée sur milieu TCBS. Les colonies
sont observées après 18 h d‟incubation à 37°C. V.parahaemolyticus donne des colonies
incolores à centre vert.
9.2.2. Identification
V. parahaemolyticus est glucose+, lactose-, H2S-, mobilité+, oxydase+, LDC+, ODC+,
gélatine+, citrate +, indole+.
9.2.3. Mise en évidence de l’halophilie

Le germe cultive dans les milieux salés (entre 3 et 8 % de sel) mais pas à 0 et 10 % en sel.
a) milieux liquides salés
Il suffit de préparer une gamme de concentration entre 0 et 10%l de chlorure de sodium dans
des tubes de milieux du type eau peptonée à pH 9 et de suivre, après ensemencement, la
croissance à 37°C après 24 heures d‟incubation.
b) milieu à gradient de concentration en sel (méthode de Szybaski)
milieu A milieu B
-extrait de viande 3g 3g
-peptone 5g 5g
-tergitol 0,1 ml 0,1 ml
-gélose 0,1 ml 0,1 ml
-NaCl - 150 g
-eau D 1000 ml 1000 ml
Régénérer les deux milieux et rajouter (à 55°C) 0,1 ml de solution stérile de chlorure de
triphényltétrazolium à 1% à A et B. Poser une boîte de Pétri avec une inclinaison donnée et
verser 8 ml de milieu B de telle sorte que la gélose atteigne le niveau a (figure 13). Après
solidification, poser la boîte à plat et couler 8 ml de milieu A. Après nouvelle solidification,
ensemencer en stries linéaires selon l‟axe du gradient de concentration en sel. Incuber 24 h à
37°C.
Figure 15 : Mise en évidence de l’halophilie par la méthode de Szybaski
9.2.4. Phénomène de Kunagawa

V. parahaemolyticus isolé des aliments n‟est pas hémolytique tandis qu‟isolé à partir
d‟humains il est ß hémolytique.
Le milieu utilisé est le milieu de Watsaguna. Après 30 minutes d‟ébullition ajouter 100 ml
d‟une suspension fraîche d‟hématies humaines. A partir d‟une culture en bouillon trypticase
soja à 3 % de NaCl préalablement incubée 20 h à 37°C, ensemencer la gélose en stries ou par
points. Après 48 h d‟incubation à 37°C observer l‟hémolyse ß (zone claire) autour des zones
de développement du Vibrio.
10. Recherche et numération de Bacillus cereus

10.1. Numération sur milieu de Mossel (gélose MYP: gélose mannitol-yolk-polymyxin)
Le milieu de base contient du mannitol, de chlorure de sodium, et du rouge de phénol. Après
stérilisation, ajouter à 900 ml du milieu de base 100 ml d‟émulsion stérile de jaune d‟œuf à 20
% et 10 ml d‟une solution de sulfate de polymyxine à 1 mg/ml.
Inoculer 0,1 ml de la suspension mère et de ses dilutions à la surface. Incuber 48 h à 32°C.
B. cereus donne des colonies roses (mannitol-), plates, rugueuses, sèches, entourées d‟un halo
de précipité blanchâtre (produits d'hydrolyse insolubles) dû à l‟activité lécithinasique.
10.2. Identification
B. cereus est un bacille court (4 μm x 1 μm) à bouts carrés, en chaînes courtes. Les spores
sont ovoïdes, non déformantes et centrales. La présence de spores peut être mise en évidence
par coloration de Gram. Elles se présentent sous forme de particules endocellulaires ovales et
réfringentes.
B. cereus est : catalase +, glucose+, saccharose+, glycérol+, salicine+, xylose-, arabinose-,
VP+, amidon + (sur gélose nutritive contenant 10g/l d'amidon soluble, ensemencement par
touches), caséine+ (sur gélose au lait, ensemencement par touches), gélatine +, indole -,
citrate -, uréase-, cultive en anaérobiose, nitrate réductase+. B. cereus peut être identifié par la
galerie rapide 50CHB
11. Dénombrement des bactéries aérobies ou des spores de Bacillus

mésophiles ou thermophiles
Cette numération est réalisée sur gélose glucosée au pourpre de bromocrésol.
Milieu BCP-Glucose
- peptone 10 g
- glucose 5 g
- amidon soluble 2 g
- pourpre de bromocrésol 40 mg
- gélose 15 g
- eau D 1000ml
11.1. Numération des bactéries mésophiles aérobies dans les sucres
Inoculer 10 ml d‟une solution de sucre à 20% dans 100 ml de milieu en surfusion à 47°C.
Mélanger et répartir dans 5 boîtes de Pétri. Incuber à 30°C pendant 5 jours et dénombrer
chaque jour séparément les colonies jaunes (acidifiantes) et les colonies bleues (non
acidifiantes).
11.2. Numération des spores de Bacillus mésophiles et thermophiles

Dans les sucres : procéder comme en 11.1 mais après avoir chauffé la solution sucrée 5
minutes à 100°C. Pour les épices procéder de la même façon mais avec une suspension au
1/10 de l‟échantillon.
- Pour les spores de Bacillus mésophiles incuber à 30°C pendant 5 jours en notant chaque
jour le nombre de colonies acidifiantes ou non.
- Pour les spores de Bacillus thermophiles incuber à 55°C pendant 3 jours après avoir
obturé avec de l‟huile de vaseline la boîte ou avec une bande adhésive plastifiée.
Dénombrer chaque jour, séparément, les colonies acidifiantes et non acidifiantes.
12. Recherche de Mycobacterium tuberculosis

Il s'agit de bactéries Gram +, immobiles, aérobies, leur croissance est faible voire impossible
sur milieux de culture ordinaires. L'étude des mycobactéries pathogènes ne peut être réalisée
que par un laboratoire spécialisé. M. tuberculosis est recherché directement dans les produits
alimentaires (lait) et mis en évidence par la coloration de Ziehl-Nielsen.
12.1. Coloration de Ziel-Nelsen
La spécificité de cette coloration repose sur la propriété d‟alcoolo-acido-résistance du germe
(AAR). Les bacilles AAR se colorent seulement à chaud et par des colorants très actifs,
comme la fuschine de Ziehl. Une fois colorés, ils gardent leur coloration, même soumis à
l'action d'acides forts dilués ou de l'alcool.
Après centrifugation à 3 000 g pendant 10 minutes du produit liquide (lait par exemple) on
réalise des frottis à partir du culot. Après séchage et fixation à l‟alcool absolu, on effectue la
coloration de Ziehl-Nielsen :
- colorer le frottis fixé par la fuchsine à chaud pendant 10 minutes sur une platine de Malassez
(figure 16) : il faut qu'il y ait émission de vapeurs blanches mais non ébullition et il faut
rajouterdu colorant au fur et à mesure de son évaporation.
-laver la lame à l'eau (la lame doit être manipulée à la pince)
- plonger la lame dans de l'acide nitrique HNO3 au 1/3 ou sulfurique H2SO4 au 1/4 pendant 2
minutes.
- rincer à l‟eau
- décolorer par l‟alcool absolu pendant 5 minutes goutte à goutte
- rincer à l‟eau
- recolorer au bleu de méthylène phéniqué (colorant de contraste) pendant 30 secondes (bleu
de méthylène 2 g, éthanol 95° 10 ml, phénol aqueux 2,2 ml, eau qsp 100 ml)
- rincer à l‟eau. Sécher à l'air. Observer à l‟objectif à immersion.
Les bacilles de Koch (M. tuberculosis) se présentent sous forme de bacilles fins et longs
colorés en rose sur fond bleu. L‟observation de plusieurs dizaines de champs microscopiques
est nécessaire avant de conclure.
Platine de Malassez
Figure 16 : Coloration de Ziehl-Nielsen

12.2. Culture de M. tuberculosis
La culture du germe est possible sur les milieux : Coletsos et Loewenstein-Jensen, mais en
raison des temps de latence et de doublement très élevés, l‟observation visuelle des colonies
caractéristiques de la bactérie n‟est réalisable qu‟après plusieurs jours d‟incubation à 37°C
(parfois 8 semaines). Les colonies sont lisses sur Coletsos et sèches et rugueuses sur
Loewenstein-Jensen.
13. Recherche de Yersinia enterocolytica

Ses principaux caractères sont : lactose +, glucose +, gaz -, H2S -, uréase +, ADH -, LDC -,
ODC +, galactose +, oxydase -, citrate-, nitrate réductase +, indole +/-, saccharose +, VP +/ -,
lécithinase -, rhammose -, sorbitol -.
Il existe 5 biotypes se différenciant par les caractères : salicine, esculine, indole et xylose et
34 sérotypes O et 19 sérotypes H. Le germe est mobile à 20°C et immobile à 37°C.
La recherche du germe se fait en 4 phases comme pour Salmonella et cette recherche est
possible par hybridation ADN-ADN à partir du milieu d‟enrichissement.
a) Pré enrichissement : 50 g de produit sont ajoutés à 200 ml de tampon phosphate 1/15M à

pH = 7,6. Après homogénéisation le mélange est incubé pendant 7 ou 14 jours à 4°C.
b) Enrichissement :réalisé dans un bouillon au sélénite à 5 % contenant 0,05 % d‟extrait

deviande (1 ml de milieu de pré-enrichissement dans 10 ml de bouillon au
sélénite).L‟incubation est réalisée à 23°C pendant 3 jours. La recherche par hybridation ADN-
ADN peut se faire après cette phase.
c) Isolement :réalisé sur milieu SS ou bismuth - sulfite gélosé (à 23°C pendant 3 jours) ou sur
milieu CIN (cefsulodine, irgasan, novobiocine). Dans ce dernier milieu, les sels biliaires, le
cristal violet, l‟irgasan et les antibiotiques inhibent le développement des bactéries Gram + et
celle de la plupart des bactéries Gram -. Le mannitol et le rouge neutre permettent une
identification présomptive de Y. enterocolytica.
L‟ensemencement peut se faire directement à partir d‟une suspension de l‟aliment ou mieux à
partir du milieu d‟enrichissement.Incuber entre 23 et 32°C.
Y. enterocolytica donne de petites colonies (1 mm) à centre rouge entouré d‟une zone
translucide à contour irrégulier. Après 48 heures d‟incubation les colonies peuvent s‟entourer
d‟une zone de précipité de sels biliaires. Enterobacter, Citrobacter et Serratia donnent des
colonies roses sur CIN.
d) Identification :réalisée sur galerie API 20, incubation à 30°C.
14. Recherche de Campylobacter jejuni

C. jejuni est un germe commensal de l‟intestin de nombreux mammifères et oiseaux. Eau et
sol peuvent être contaminés par le germe. Le lait et les volailles semblent être les véhicules les
plus importants du germe. C. jejuni est microaérophile (10 % d‟oxygène pour une croissance
optimale). Il cultive très bien à 42°C. Il s‟agit d‟un germe de très petites dimensions qui peut
être isolé par filtration (filtres de 0,65 μm).La recherche de ce germe est possible par
hybridation.
Le germe peut être isolé sur le milieu de Skirrow après 48 heures d‟incubation à 42°C dans
une jarre sous CO2.
Le milieu de Skirrow contient comme milieu de base la gélose Columbia. Ajouter à 1000 ml
de milieu de base ramené à 47°C 150 ml de sang de mouton défibriné et 10 ml d‟une solution
d‟antibiotiques (vancomycine 10 mg,polymyxine B 5000 UI soit 50 mg, triméthoprime 5 mg
et amphotéricine B 2 mg).L‟atmosphère optimale requise est composée de 85 % d‟azote, 10
% de gaz carbonique et de 5% d‟oxygène.L‟oxygène atmosphérique présent au taux de 21 %
est toxique pour le germe. Après incubation à 42°C, les colonies apparaissent, lisses, fines,
avec une tendance à confluer.
Campylobacter jejuni est oxydase +, catalase +, mobilité + (mobilité en flèche comme un
Vibrio), croissance à 42°C +, croissance à 25°C -, sensibilité à l‟acide nalidixique à 30 μg +,
hydrolyse l‟hyppurate.
Le milieu Campylosel est un milieu équivalent dans lequel les antibiotiques utilisés sont
différents (par litre de milieu : céfopérazone 15 mg, vancomycine 10 mg, colistine 10 000 UI
et amphotéricine B 2 mg). Après incubation à 42°C sous atmosphère adaptée, les colonies de
Campylobacter jejuni ont un diamètre de 1 à 2 mm et s‟étalent le long des stries
d‟ensemencement. Elles sont grisâtres, plates, lisses et brillantes parfois granuleuses.
15. Numération des levures et moisissures

La contamination des aliments par les moisissures est actuellement considérée avec beaucoup
d‟attention en raison des mycotoxines que ces microorganismes sont capables de synthétiser.
Plus de 100 mycotoxines différentes ont été identifiées. Les moisissures sont très largement
répandues dans la nature (air, sol...) et elles peuvent très facilement contaminer les aliments
en cours de fabrication. Elles peuvent sporuler au cours d‟opérations technologiques comme
la déshydratation, l‟acidification, la réfrigération, l‟abaissement de l‟activité de l‟eau. Leurs
enzymes peuvent être à l‟origine d‟altérations diverses dans les aliments.
Les levures acidophiles, psychrotrophes ou osmophiles peuvent induire des altérations

profondes dans les aliments (structure, propriétés organoleptiques etc.). La plupart d‟entre
elles ne sont pas pathogènes.
Ces germes peuvent être dénombrés sur des milieux rendus sélectifs par acidification ou
addition de substances antibactériennes (antibiotiques).
a) Milieu gélosé à la pomme de terre (PDA)
- infusion de pommes de terre 200 g
- glucose 20 g
- gélose 15 g
- eau D 1000 ml
Autoclaver à 121°C pendant 15 minutes. Ajuster le pH à 3,5 par addition d‟acide tartrique à
10%.
b) Milieu gélosé glucosé à l’oxytétracycine (OGA)
L'ensemencement de ces milieux se fait par étalement en surface de 100 μl de suspension
mère ou de ses dilutions. L'incubation est de 3 à 5 jours à 20-25°C.
16. Recherche de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes est un petit bacille Gram + à bouts arrondis de 0,5 à 2 μm de longueur
sur 0,4 à 0,5 μm de diamètre pouvant s‟associer en palissade, asporulé, parfois
coccobacillaire, oxydase -, catalase +.Cette bactérie est aéro-anaérobie mésophile (cultive
entre 3ºC et 45°C avec un optimum à 37°C. La bactérie reste viable après plusieurs années
d‟entreposage à 4°C. Le genre Listeria fait partie des Lactobacillaceae. Sept espèces sont
décrites dans le genre (L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri , L. grayi, L.murrayi
et L.monocytogenes) .
La recherche des Listeria s‟effectue suivant la démarche schématisée dans la figure 15. Dans
les milieux de culture, le rôle des divers composés est le suivant : l‟acide nalidixique inhibe
certains des germes Gram +, le LiCl les germes Gram -, la cycloheximide les champignons.
Les autres antibiotiques ont une action inhibitrice sélective.
Sur le milieu Oxford (base Columbia et inhibiteurs) et sur gélose Palcam, L.monocytogenes
forme des colonies vert olive avec un halo noir par hydrolyse de l‟esculine.
Sur les géloses MMA et LPM, la bactérie forme des colonies qui apparaissent bleutées sous
un faisceau lumineux oblique (angle de 45°C).
Un repiquage est alors réalisé sur milieu gélosé trypticase-soja additionné de 0,6 % d‟extrait
de levure (24 à 48 heures à 30°C). L‟identification est effectuée par la recherche de certains
caractères morphologiques et biochimiques tels que :
- l‟état frais (mobilité en pirouettes)
-coloration de Gram: bacilles Gram +
- catalase +, oxydase -, nitrate réductase -, VP +, RM +, indole -, uréase -, H2S -, esculine +
- gélose au sang (gélose trypticase - soja - extrait de levure 0,6 % - sang de mouton défribiné
7%) : L. monocytogenes présente une hémolyse β avec petites zones claires, L.ivanovii
présente des zones claires nettes.
-L. monocytogenes est mannitol -, rhamnose +, xylose -, hippurate +, amidon-.
Figure 17: Démarche de la recherche de Listeria monocytogenes
17. Recherche de la toxine botulinique : méthode des souris protégées

Cette recherche dangereuse n‟est qu‟exceptionnellement réalisée par des laboratoires
spécialisés. Il existe 6 toxines (A, B, C, D, E, F) qui ont une action toxique identique mais qui
sont antigéniquement différentes, chaque type de toxine n‟étant neutralisé que par le sérum
spécifique contenant les anticorps correspondants. Les types les plus fréquents sont les types
A, B, E (A et B dans les conserves de légumes, jambons, conserves de viande, B et E dans les
poissons et produits dérivés).
Principe:
On évalue la toxicité du filtrat (ou de surnageant de centrifugation) d'un broyat de l'aliment
(ou d'une culture réalisée à partir de celui-ci) par injection à la souris, en utilisant les
antitoxines appropriées pour les tests de protection.
Méthodologie:
- 1 volume d‟aliment est additionné d‟1 volume d‟eau physiologique stérile. Après mélange
(broyage ou mortier 10 minutes) on centrifuge à 5000 g pendant 10 minutes. Le surnageant
est soumis à une filtration stérilisante (Millipore 0,45 μm).
- 2 ml de filtrat sont prélevés et dilués (10-1 à 10-6) dans de l‟eau physiologique. On injecte 0,5
ml de chaque dilution par voie intrapéritonéale à des souris (2 souris par dilution) pour
déterminer la dose minimale mortelle (DMM) de l‟extrait. La mort survient dans les 72 h en
présence de toxine.
- 2 ml de filtrat sont prélevés et chauffés 10 minutes à 100°C. 0,5 ml est injecté à la souris (2
souris par essai). La toxine perd son pouvoir toxique dans ces conditions (100°C, 10 minutes).
- 2 ml de filtrat sont traités par la trypsine (0,2 ml de trypsine à 10 %) pendant 45 minutes à
37°C. Après dilutions injecter 1 ml à la souris. Le pouvoir toxique est maintenu dans ces
conditions de traitement.
Répartir le filtrat à raison de 2 ml / tube
Ajouter au premier 0,1 ml de sérum antibotulinique A
Ajouter au second 0,1 ml de sérum antibotulinique B
......................................................................................
Ajouter au sixième 0,1 ml de sérum antibotulinique F
Laisser en contact 30 minutes à 37°C. Après injection à la souris de 0,5 ml, seule survivra
celle qui a été inoculée avec le filtrat traité par le sérum correspondant à la toxine présente.

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1ère année Master Microbiologie Appliquée Contrôle microbiologique des aliments

Le contrôle microbiologique de routine d‟un produit alimentaire consiste en :

En bactériologie alimentaire, il n‟est pas nécessaire de rechercher, de compter et d‟identifier

b) une recherche orientée de certaines bactéries pathogènes : telles que Salmonella,

La Méthode d’échantillonnage est celle préconisée par l‟ICMSF (International Commission

1.1. Plan d’échantillonnage à 2 classes

Dans ce plan, n représente le nombre d‟échantillons examinés et le symbole c représente le

Cependant, si m=0 et c ≠ 0, le lot est jugé de qualité satisfaisante si le nombre des

1.2. Plan d’échantillonnage à 3 classes

La valeur S constitue le seuil de toxicité : S= m.103

Avec ce plan et en tenant compte de la tolérance analytique, l‟interprétation du lot se fait

b) La qualité du lot est considérée comme acceptable

c) La qualité du lot est considérée comme non satisfaisante :

a) plan à deux classes b) plan à trois classes

1.4. Choix du plan

2. Test de stabilité des conserves (Epreuve ou contrôle de stabilité)

2.2. Contrôle de stabilité

2.3. Examen macroscopique

2.4. Examen organoleptique

2.5. Examen physico-chimique

2.6. Examen microscopique

La morphologie de la flore microbienne est soigneusement étudiée et le nombre moyen de

 Les boites incubées restent normales.

2.8. Démonstration de la stérilité biologique par l’analyse microbiologique

a) Bactéries sporulées aérobies mésophiles

b) Bactéries du « flat sour »

c) Bactéries sporulées anaérobies mésophiles

2.9. Méthode d’interprétation des résultats du test de stabilité des conserves

a) Pour les produits acides, il faut exiger :

b) Pour les produits peu acides, il faut exiger en outre :

3. Numération de la flore mésophile aérobie totale (FMAT)

3.2.2. Dénombrement après filtration sur membrane

Un volume donné (100 ml généralement) de l‟échantillon ou de sa dilution est filtré sur

Figure 01 : Coupe schématique d’un appareil de filtration sur membrane

Figure 02 : Mode d'emploi de Pétrifilm

4. Recherche d'une contamination d'origine fécale

4.1. Coliformes, coliformes thermotolérants, E.coli, entérobactéries

4.1.3. Colimétrie en milieu liquide (méthode du NPP)

Figure 03 : Test de Mackenzie

Tableau 01 : Lecture et interprétation du test de Mackenzie

4.1.4. Colimétrie en milieu solide

4.1.5. Colimétrie après filtration

4.1.6. Colimétrie par le système Petrifilm

4.1.8. Numération d’Escherichia coli

a) Numération après colimétrie

b) Numération directe en milieu gélosé

4.2. Dénombrement des streptocoques fécaux (entérocoques)

4.2.2. Numération en milieu liquide

4.2.3. Numération en milieu solide

b) Milieu KF (Kenner Fécal) streptocoque

4.3. Bactéries anaérobies sulfito-réductrices (Clostridium sulfito-réducteurs)

4.3.2. Dénombrement des spores et des formes végétatives

5. Recherche et dénombrement de Clostridium perfringens

5.4. Numération de Clostridium perfringens par titrage de l’α- toxine

6. Recherche et/ou numération des Staphylocoques et S. aureus

6.3. Numération sur milieux solides

b) Milieu de Baird Parker

6.4. Numération en milieu liquide

6.5.1. Recherche de l’activité coagulase

6.5.2. Recherche du clumping-factor (coagulase liée)

Figure 04: Principe de la recherche du clumping factor

Figure 05: Test d'agglutination sur lame

6.5.3. Recherche d’une ADNase