2.6.32. Essai des endotoxines bactériennes par la méthode du rFC PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.

Pour d’autres volumes ou en cas de récipients multiples,
il convient d’adopter d’autres approches qui doivent être
justifiées (voir section 2-2-2). L’augmentation du volume total
par dilution peut être envisagé pour assurer une complète
inoculation des volumes d’échantillon de 100 μL. Dans le
cas des produits de volume inférieur à 1 mL pour lesquels
un échantillonnage final n’est pas possible, il convient de
recourir, en le justifiant, à un essai indirect, un essai en cours
de production ou un autre essai approprié.
Analyse. Ensemencez des récipients contenant du milieu
de culture avec les échantillons dès que possible, puis
incubez pendant au moins 7 jours. En fonction des résultats
obtenus lors des essais d’applicabilité et en tenant compte
des microorganismes concernés, la période d’incubation
peut être prolongée jusqu’à 14 jours. Sélectionnez des
températures d’incubation permettant de déceler un large
spectre de microorganismes. De telles températures se situent
généralement dans un intervalle de 30-37 °C, cependant,
pour les produits cellulaires à durée de conservation très
courte, il se peut qu’une température d’au moins 35 °C, qui
accélère la croissance, soit plus appropriée pour obtenir
un résultat « négatif à date » pertinent. En outre, pour les
produits présentant un risque important de contamination par
l’environnement, 2 intervalles de température de, par exemple,
20-25 °C (aérobie) et 30-37 °C (anaérobie) sont utilisés afin de
couvrir à la fois les microorganismes environnementaux et les
microorganismes cliniques.
Le tableau 2.6.27.-3 présente de possibles approches
alternatives pour le choix de la température d’incubation.
La température et la durée d’incubation sont basées sur les
résultats de l’étude d’applicabilité réalisée pour le produit
cellulaire à examiner.
Tableau 2.6.27.-3. – Réglages de température possibles dans
des systèmes de culture automatisés utilisés seuls ou associés à
une méthode manuelle
Incubation
Incubation aérobie
anaérobie
Option 1 20-25 °C (système automatisé), 30-35 °C (système
si nécessaire 30-35 °C (système automatisé)
automatisé)
En conséquence, l’augmentation des paramètres pertinents
au moment de l’essai pourrait ne pas être significative et des
contaminants microbiens pourraient ne pas être reconnus par
le système (résultat faux négatif).
3-2. MÉTHODES ALTERNATIVES
3-2-1. Combinaison d’une préculture et d’une détection
par des méthodes alternatives
Des milieux de culture liquides aérobies et anaérobies, ou
des milieux solides équivalents, sont ensemencés avec les
échantillons à examiner pour une courte période d’incubation
(par exemple 12-24 h en fonction de la sensibilité de la
méthode alternative utilisée). Une méthode alternative
appropriée pour la détection rapide des microorganismes est
ensuite effectuée (par exemple, techniques d’amplification
des acides nucléiques (2.6.21), cytométrie en flux (2.7.24),
bioluminescence (5.1.6)).
3-2-2. Détection directe par des méthodes alternatives
(5.1.6)
Dans le cas d’un produit cellulaire avec une très courte durée
de conservation (quelques heures, par exemple) ou lorsque
les méthodes classiques ne permettent pas une détection
satisfaisante des microorganismes, des méthodes de détection
directes non fondées sur la croissance peuvent être utilisées
pour le contrôle microbiologique (par exemple, techniques
d’amplification des acides nucléiques (2.6.21), cytométrie en
flux (2.7.24), bioluminescence (5.1.6)).
Par rapport aux méthodes fondées sur la croissance, cette
approche permet d’obtenir un résultat dans un laps de temps
très bref, mais au détriment de la sensibilité. Selon l’approche
utilisée, des microorganismes non viables peuvent être décelés
en plus des microorganismes viables.
3-2-3. Validation de la méthode
La validation est effectuée selon les recommandations
générales du chapitre général 5.1.6 et les recommandations
spécifiques aux produits cellulaires de la section 3-1-2 pour les
méthodes automatisées fondées sur la croissance. La sensibilité
de ces approches doit être validée en tenant compte des
temps de doublement des microorganismes potentiellement
contaminants lors de la pré-incubation.

Option 2 35-37 °C (système automatisé), le cas 35-37 °C (système

échéant, incubation supplémentaire automatisé) 01/2021:20632
à une température inférieure
(méthode manuelle)*

Option 3 30-32 °C (système automatisé) 30-32 °C (système

automatisé)

Option 4 30-32 °C (système automatisé) 35-37 °C (système

2.6.32. ESSAI DES ENDOTOXINES
automatisé) BACTÉRIENNES PAR LA MÉTHODE
* Le cas échéant, incubez en outre à une température comprise entre DU FACTEUR C RECOMBINANT
20 °C et 30 °C. L’incubation peut être réalisée en utilisant des milieux
microbiologiques disponibles dans le commerce, soit des flacons L’essai des endotoxines bactériennes par la méthode du
facteur C recombinant (rFC) est destiné à la quantification des
aérobies destinés à des systèmes automatisés, soit des milieux liquides
aux peptones de caséine et de soja. endotoxines produites par des bactéries gram-négatives. Il est
effectué au moyen de rFC basé sur la séquence génomique
3-1-4. Observation et interprétation des résultats de la limule (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus,
Examinez les milieux, visuellement ou à l’aide de systèmes Tachypleus gigas ou Carcinoscorpius rotundicauda), par une
automatisés, au moins 1 fois par jour et à la fin de la période méthode fluorimétrique.
d’observation, pour détecter des signes éventuels de croissance L’essai est réalisé dans des conditions permettant d’éviter toute
microbienne. S’il n’est pas observé de croissance microbienne contamination par des endotoxines bactériennes.
au cours ou à la fin de la période d’observation, le produit est
« négatif en culture ». Si une croissance est observée dans le 1. ÉQUIPEMENT
cadre d’un essai valide, le produit est « positif en culture ». Dépyrogénez dans un four à chaleur sèche, par une méthode
Si les flacons ensemencés sont conservés pendant plus de 12 h validée, toute la verrerie et les autres éléments d’équipement
avant d’être placés dans le système de culture automatisé, une résistant à la chaleur. La durée et la température minimales de
subculture de chaque flacon ensemencé doit être effectuée chauffage sont généralement de 30 min à 250 °C. Si l’on utilise
pour déceler les faux négatifs. Le cas peut notamment se du matériel en plastique (par exemple plaques de microtitrage
présenter quand des microorganismes à croissance rapide ou embouts de pipettes automatiques), il doit être établi qu’il
se trouvent dans des conditions optimales et peuvent est exempt d’endotoxines détectables et n’interfère pas dans
commencer à proliférer pendant la période de conservation. l’essai.

5068 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3 2.6.32. Essai des endotoxines bactériennes par la méthode du rFC

2. RÉACTIFS K
Réactifs M
Le facteur C recombinant est basé sur la séquence génomique K = dose seuil d’endotoxines ayant un effet pyrogène, par
de la limule (Limulus polyphemus, Tachypleus tridentatus,
kilogramme de masse corporelle,
Tachypleus gigas ou Carcinoscorpius rotundicauda). Tous
les réactifs, notamment le substrat fluorogène et le tampon, M = dose maximale recommandée pour le produit, en
doivent être exempts d’endotoxines détectables. bolus, par kilogramme de masse corporelle.
Solutions de réactifs Lorsque le produit est destiné à être administré par injections
Si nécessaire, préparez les réactifs suivant les instructions du rapprochées ou en perfusion continue, M est la dose maximale
fabricant du kit d’analyse. Conservez-les au réfrigérateur ou totale par heure.
au congélateur, comme indiqué par le fabricant. Dans les monographies, la limite en endotoxines des
substances actives pour administration parentérale est
Eau EEB (eau pour essai des endotoxines bactériennes) spécifiée en UI/mL, UI/mg, UI/unité d’activité biologique, etc.
Eau pour préparations injectables R ou eau produite par un Concentration de la solution à examiner :
autre procédé ne réagissant pas avec le réactif utilisé à la limite
– mg/mL si la limite en endotoxines est spécifiée par rapport
de détection du réactif.
à la masse (UI/mg),
3. PRÉPARATION DE LA SOLUTION MÈRE ÉTALON – unités/mL si la limite en endotoxines est spécifiée par
D’ENDOTOXINE rapport à l’unité d’activité biologique (UI/unité),
Préparez une solution mère étalon d’endotoxine à partir d’une – mL/mL si la limite en endotoxines est spécifiée par rapport
préparation de référence d’endotoxine étalonnée par rapport à au volume (UI/mL).
l’étalon international, par exemple l’étalon d’endotoxine PBR. λ = concentration la plus basse utilisée sur la courbe
La teneur en endotoxines est exprimée en Unités d’étalonnage.
Internationales (UI). L’équivalence en Unités Internationales
de l’étalon international est indiquée par l’Organisation 7. MÉTHODE FLUORIMÉTRIQUE QUANTITATIVE
mondiale de la Santé. Cette méthode consiste à mesurer la fluorescence (en unités
NOTE : 1 Unité Internationale (UI) d’endotoxine équivaut à 1 de fluorescence relative, RFU, pour relative fluorescence units)
Unité d’Endotoxine (UE). émise par un substrat fluorogène (réactif) après clivage par le
facteur C activé par les endotoxines. Elle est utilisée comme
Pour la préparation et la conservation de la solution mère essai fluorimétrique en point final.
étalon d’endotoxine, suivez les instructions figurant sur la
notice et sur l’étiquette. L’essai fluorimétrique en point final repose sur l’existence
d’une relation quantitative entre la concentration en
4. PRÉPARATION DES SOLUTIONS ÉTALONS endotoxines et la fluorescence du mélange réactif à la fin de la
D’ENDOTOXINE période d’incubation, exprimée, par exemple, par ΔRFU :
Après avoir énergiquement agité la solution mère étalon ΔRFU = RFUt point final - RFUt 0
d’endotoxine, préparez les dilutions en série appropriées de
cette solution avec de l’eau EEB. RFUtpoint final = fluorescence du mélange réactif à la fin de
Utilisez les solutions dès que possible pour éviter une la période d’incubation,
éventuelle perte d’activité par adsorption. RFUt0 = fluorescence du mélange réactif au début de
5. PRÉPARATION DES SOLUTIONS À EXAMINER la période d’incubation.
Préparez les solutions à examiner en dissolvant ou en diluant L’essai est effectué à la température d’incubation recommandée
la substance active ou le médicament à examiner avec de l’eau par le fabricant du kit d’analyse (généralement 37 ± 1 °C).
EEB. Pour la dissolution ou la dilution de certaines substances 8. CONTRÔLES PRÉLIMINAIRES
ou préparations, l’emploi d’autres solutions aqueuses peut
être plus approprié. Si nécessaire, ajustez le pH de la solution Des contrôles préliminaires sont effectués afin de vérifier la
à examiner ou de la dilution utilisée de telle sorte que le validité de la méthode fluorimétrique, en démontrant que les
mélange de cette solution et du ou des réactifs ait un pH critères de validité de la courbe d’étalonnage sont satisfaits
compris dans l’intervalle spécifié par le fabricant du kit (8-1) et que la solution à examiner n’interfère pas dans l’essai
d’analyse (généralement 6,0 à 8,0). L’ajustement du pH peut (8-2).
être effectué au moyen d’un acide, d’une base ou d’un tampon Il est nécessaire de valider la méthode d’essai chaque fois que
appropriés, selon les recommandations du fabricant du kit des modifications susceptibles d’affecter le résultat de l’essai
d’analyse. Les acides et les bases peuvent être préparés à partir sont apportées aux conditions expérimentales.
de solutions concentrées ou de solides, avec de l’eau EEB, dans 8-1. VÉRIFICATION DES CRITÈRES DE VALIDITÉ DE LA
des récipients exempts d’endotoxines détectables. L’absence, COURBE D’ÉTALONNAGE
dans les tampons, d’endotoxines détectables et de facteurs Cet essai est à effectuer chaque fois qu’un nouveau lot de
d’interférence doit être établie. facteur C recombinant est utilisé.
6. DÉTERMINATION DE LA DILUTION MAXIMALE La sensibilité de l’instrument doit être ajustée conformément
SIGNIFICATIVE aux recommandations du fabricant du kit d’analyse.
A partir de la solution étalon d’endotoxine, préparez au moins
La dilution maximale significative (DMS) est la dilution 3 solutions de concentrations différentes comprises dans
maximale d’un échantillon à laquelle la limite en endotoxines l’intervalle indiqué par le fabricant du kit d’analyse, pour
peut être déterminée. Elle est calculée à l’aide de la formule établir la courbe d’étalonnage. Si l’intervalle de concentration
suivante : souhaité dépasse de plus de 2 log10 l’intervalle indiqué par le
limite en endotoxines ´ concentration de la solution a examiner fabricant, il faut préparer des solutions étalons supplémentaires
λ de façon à encadrer chaque incrément logarithmique de
l’intervalle couvert par la courbe d’étalonnage. Effectuez l’essai
Limite en endotoxines : la limite en endotoxines d’une sur 3 exemplaires au moins de chacune des solutions étalons,
substance active administrée par voie parentérale, définie sur suivant les instructions fournies par le fabricant (proportions
une base posologique, est égale à : en volume, temps d’incubation, température, pH, etc.).

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 5069
2.6.37. Détection des virus étrangers dans les MIV par cultures
La valeur absolue du coefficient de corrélation | r | doit être
supérieure ou égale à 0,980 sur l’intervalle de concentration
en endotoxines adopté.
8-2. FACTEURS D’INTERFÉRENCE
Le kit d’analyse ne contenant pas de facteur G, il n’y a pas lieu
d’attendre de réaction avec les β-glucanes, conduisant à des
résultats faussement positifs. Il faut en tenir compte si l’on
compare la méthode à d’autres méthodes de quantification
des endotoxines bactériennes.
Choisissez une concentration en endotoxines coïncidant avec
le milieu de la courbe d’étalonnage, ou s’en approchant.
Préparez les solutions A, B, C et D comme indiqué dans le
tableau 2.6.32.-1. Effectuez l’essai sur au moins 2 exemplaires
de chacune de ces solutions, suivant les instructions du
fabricant du kit d’analyse (volume de solution à examiner et de
mélange réactif, rapport de ces volumes, temps d’incubation,
etc.).
Tableau 2.6.32.-1
Solution Concentration en Solution à laquelle Nombre
endotoxines sont ajoutées les d’exemplaires
endotoxines
A Néant Solution à examiner Au moins 2
B Concentration Solution à examiner Au moins 2
médiane de
la courbe
d’étalonnage
C Au moins Eau EEB Au moins 2
3 concentrations pour chaque
(la plus faible est concentration
désignée λ)
D Néant Eau EEB Au moins 2
Solution A = solution à examiner éventuellement diluée, jusqu’à la
DMS au maximum.
Solution B (témoin positif-produit) = préparation à examiner à la
même dilution que la solution A, contenant des endotoxines ajoutées à
une concentration coïncidant avec le milieu de la courbe d’étalonnage,
ou s’en approchant.
Solution C = solutions étalons d’endotoxine de mêmes concentrations
que celles utilisées pour la vérification décrite dans la section 8-1.
Solution D (témoin négatif) = eau EEB.
L’essai n’est valable que si les conditions suivantes sont
satisfaites :
– la valeur absolue du coefficient de corrélation de la courbe
d’étalonnage générée avec la solution C est supérieure ou
égale à 0,980,
– le résultat obtenu pour la solution D n’est pas supérieur
à la limite spécifiée pour le blanc dans la description
du mélange réactif utilisé, ou est inférieur à la limite de
détection des endotoxines du rFC employé.
Calculez le recouvrement moyen des endotoxines ajoutées
en soustrayant, le cas échéant, la concentration moyenne
d’endotoxines dans la solution seule (solution A, tableau
2.6.32.-1) à celle obtenue pour la solution additionnée
d’endotoxines (solution B, tableau 2.6.32.-1).
La solution à examiner est considérée comme exempte de
facteurs d’interférence si, dans les conditions de l’essai, la
concentration mesurée en endotoxines ajoutées à la solution
à examiner est comprise entre 50 pour cent et 200 pour cent
de la concentration connue en endotoxines ajoutées, après
déduction des endotoxines éventuellement détectées dans la
solution non additionnée d’endotoxines.
Si le taux de recouvrement en endotoxines n’est pas compris
dans l’intervalle spécifié, la solution à examiner est considérée
comme non exempte de facteurs d’interférence. Répétez la
recherche de facteurs d’interférence à une dilution plus élevée,
mais ne dépassant pas la DMS. L’interférence exercée par la
solution à examiner ou par la solution à examiner diluée (sans
que la dilution dépasse la DMS) peut également être éliminée
par un traitement approprié, validé, tel que la filtration, la
neutralisation, la dialyse, le chauffage ou des étapes de capture
spécifiques aux endotoxines (enrichissement des endotoxines
présentes dans la solution à examiner avant la détection, en
5070 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3
l’absence de la matrice interférente). Pour vérifier que le
traitement choisi permet d’éliminer l’interférence constatée
sans entraîner de déperdition en endotoxines, répétez la
recherche de facteurs d’interférence sur la préparation à
examiner additionnée d’étalon d’endotoxine et soumise au
traitement choisi.
9. ESSAI
9-1. MODE OPÉRATOIRE
Opérez comme décrit dans la section 8-2.
9-2. CALCUL
Calculez la concentration en endotoxines de chaque
exemplaire de la solution A à partir de la courbe d’étalonnage
établie avec la solution C (étalon d’endotoxine).
L’essai n’est valable que si les 3 conditions suivantes sont
satisfaites :
(1) les résultats obtenus pour la solution C satisfont aux
exigences de validité définies dans la section 8-1,
(2) le recouvrement en endotoxines, calculé à partir de la
concentration en endotoxines obtenue pour la solution B après
déduction de la concentration en endotoxines obtenue pour la
solution A, est compris entre 50 pour cent et 200 pour cent,
(3) le résultat obtenu pour la solution D (témoin négatif)
n’est pas supérieur à la limite spécifiée pour le blanc dans la
description du mélange réactif utilisé, ou est inférieur à la
limite de détection du rFC employé.
9-3. INTERPRÉTATION
La préparation à examiner satisfait à l’essai si la concentration
moyenne en endotoxines des solutions A, après correction
de dilution et concentration, est inférieure à la limite en
endotoxines spécifiée pour le produit.
Des recommandations sur l’essai des endotoxines bactériennes
figurent dans le chapitre général 5.1.10.
07/2020:20637
corrigé 10.3
2.6.37. PRINCIPES DE DÉTECTION
DES VIRUS ÉTRANGERS DANS LES
MÉDICAMENTS IMMUNOLOGIQUES
VÉTÉRINAIRES AU MOYEN DE
MÉTHODES DE CULTURE
Ce chapitre général décrit les principes généraux applicables
aux méthodes de culture visant à isoler et à détecter des virus
étrangers dans toutes les matières utilisées lors de la fabrication
de médicaments immunologiques vétérinaires (MIV) et à tous
les stades du procédé, jusqu’au produit final inclus.
DISPOSITIONS GÉNÉRALES
a) Il est démontré que les cultures cellulaires utilisées pour les
essais des virus étrangers sont appropriées pour détecter le
contaminant cible.
b) Les matières provenant de poulets (comme les oeufs
embryonnés et les cellules primaires) et utilisées pour détecter
les virus étrangers sont issues d’élevages de poulets exempts de
microorganismes pathogènes spécifiés (EOPS) (5.2.2).
c) Si la matière analysée (par exemple, le virus de semence
primaire) est susceptible d’affecter la conduite et la sensibilité
de l’essai des virus étrangers, elle peut être traitée avec une
quantité aussi faible que possible d’un anticorps monoclonal
ou polyclonal, de façon à neutraliser (autant que possible) ou
à éliminer le virus interférant. Des préparations d’anticorps
monoclonaux ou polyclonaux contenant des taux élevés
d’anticorps dirigés contre le virus de semence sont préparées,
sous forme de lots. La préparation d’antigène utilisée pour