PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3 2.6.12.

Essais de dénombrement microbien

01/2021:20612
Le choix de la méthode est déterminé par des facteurs tels que
la nature du produit et la limite spécifiée pour le nombre de
microorganismes. Quelle que soit la méthode choisie, elle
doit permettre d’effectuer l’essai sur un échantillon de taille
2.6.12. CONTRÔLE MICROBIOLOGIQUE suffisante pour permettre l’évaluation de la conformité aux
spécifications, et il convient d’établir l’applicabilité de cette
DES PRODUITS NON STÉRILES : méthode.
ESSAIS DE DÉNOMBREMENT
MICROBIEN(1)
1. INTRODUCTION
Les essais décrits ci-après permettent le dénombrement des
bactéries mésophiles et des moisissures et levures capables 4. FERTILITÉ DES MILIEUX, APPLICABILITÉ DE
de croître en aérobiose. LA MÉTHODE DE DÉNOMBREMENT ET TÉMOINS
Ces essais sont en premier lieu destinés à déterminer si NÉGATIFS
une substance ou préparation satisfait à une spécification 4-1. CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES
préétablie en matière de qualité microbiologique. Il convient L’aptitude de l’essai à permettre la détection des
dans ce cas de se conformer aux indications données ci-après, microorganismes en présence du produit doit être établie.
notamment en ce qui concerne le nombre d’échantillons à
prélever et l’interprétation des résultats. L’applicabilité de la méthode d’essai doit être confirmée
chaque fois qu’un changement susceptible d’affecter le résultat
de l’essai est apporté au mode opératoire ou au produit.
Les méthodes décrites ne sont pas applicables aux produits
contenant des microorganismes viables en tant qu’ingrédients
actifs.
D’autres méthodes microbiologiques, notamment des 4-2. PRÉPARATION DES SOUCHES DE RÉFÉRENCE
méthodes automatisées, peuvent être utilisées à condition Utilisez des suspensions standardisées stables des souches
que leur équivalence avec la méthode de la Pharmacopée ait de référence ou préparez des suspensions comme indiqué
été démontrée. ci-après. Les cultures sont effectuées selon un système de lot
de semence tel que les microorganismes viables utilisés pour
l’inoculation n’aient pas subi plus de 5 passages à partir du lot
de semence primaire d’origine. Cultivez séparément chacune
des souches bactériennes et fongiques de référence comme
indiqué dans le tableau 2.6.12.-1.
2. PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES
Réalisez le dénombrement dans des conditions permettant Utilisez de la solution tampon peptonée au chlorure de sodium
d’éviter toute contamination microbienne extrinsèque du pH 7,0 ou de la solution tampon phosphate pH 7,2 pour
produit à examiner. Les précautions prises pour éviter la préparer les suspensions témoins ; pour mettre en suspension
contamination ne doivent pas affecter les microorganismes les spores d’A. brasiliensis, 0,05 pour cent de polysorbate 80
susceptibles d’être mis en évidence. peuvent être ajoutés au tampon. Utilisez les suspensions dans
les 2 h, ou dans les 24 h si elles sont conservées à 2-8 °C.
On peut également, plutôt que de préparer puis diluer une
Si le produit à examiner possède une activité antimicrobienne, suspension fraîche de cellules végétatives d’A. brasiliensis ou
celle-ci est autant que possible éliminée ou neutralisée. Si des de B. subtilis, préparer une suspension de spores stable puis
neutralisants de l’activité antimicrobienne sont utilisés à cet en utiliser un volume approprié pour l’inoculation. Cette
effet, leur efficacité et leur absence de toxicité à l’égard des suspension peut être maintenue à 2-8 °C pendant une durée
microorganismes considérés doivent être démontrées. validée.

Si des substances tensioactives sont utilisées pour la

préparation des échantillons, leur absence de toxicité à l’égard
des microorganismes considérés et leur compatibilité avec les
neutralisants utilisés doivent être démontrées.
3. MÉTHODES DE DÉNOMBREMENT
Utilisez la filtration sur membrane ou le dénombrement
sur plaque, selon que l’une ou l’autre méthode est prescrite.
La méthode dite du nombre le plus probable (NPP), bien
que généralement moins exacte que les autres méthodes
de dénombrement microbien, peut néanmoins être la plus
adaptée pour certains groupes de produits présentant une
biocharge très faible.
(1) Ce chapitre a fait l’objet du processus d’harmonisation des pharmacopées. Voir chapitre 5.8. Harmonisation des pharmacopées.
4-3. TÉMOIN NÉGATIF
Pour vérifier les conditions opératoires, effectuez un contrôle
sur un témoin négatif préparé en substituant le diluant choisi
à la préparation à examiner. Aucune croissance microbienne
n’est observée. Un contrôle sur un témoin négatif est
également effectué lors de l’examen du produit comme décrit
dans la section 5. L’obtention d’un résultat non conforme
nécessite une investigation.
4-4. FERTILITÉ DES MILIEUX
Effectuez ce contrôle sur chaque lot de milieu, qu’il soit acheté
prêt à l’emploi ou préparé à partir d’un milieu déshydraté ou
des ingrédients décrits.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 5057
2.6.12. Essais de dénombrement microbien PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3

Tableau 2.6.12.-1. – Préparation et emploi des microorganismes de référence

Applicabilité de la méthode de dénombrement
Fertilité des milieux
Préparation de la en présence du produit
Microorganisme
souche de référence Germes aérobies Germes aérobies
Moisissures et levures Moisissures et levures
totaux totaux
Staphylococcus aureus Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux
par exemple : peptones de caséine peptones de caséine peptones de caséine et
et de soja ou milieu et de soja et milieu de soja/NPP : milieu
ATCC 6538 liquide aux peptones liquide aux peptones
liquide aux peptones
NCIMB 9518 de caséine et de soja de caséine et de soja - de caséine et de soja -
CIP 4.83 30-35 °C ≤ 100 UFC  ≤ 100 UFC
NBRC 13276 18-24 h 30-35 °C 30-35 °C
≤ 3 jours ≤ 3 jours
Pseudomonas Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux
aeruginosa peptones de caséine peptones de caséine peptones de caséine et
par exemple : et de soja ou milieu et de soja et milieu de soja/NPP : milieu
liquide aux peptones liquide aux peptones liquide aux peptones
ATCC 9027 de caséine et de soja de caséine et de soja - de caséine et de soja -
NCIMB 8626 30-35 °C ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC
CIP 82.118 18-24 h 30-35 °C 30-35 °C
NBRC 13275 ≤ 3 jours ≤ 3 jours
Bacillus subtilis Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux Milieu gélosé aux
par exemple : peptones de caséine peptones de caséine peptones de caséine et
et de soja ou milieu et de soja et milieu de soja/NPP : milieu
ATCC 6633 liquide aux peptones liquide aux peptones liquide aux peptones
NCIMB 8054 de caséine et de soja de caséine et de soja - de caséine et de soja -
CIP 52.62 30-35 °C ≤ 100 UFC ≤ 100 UFC
NBRC 3134 18-24 h 30-35 °C 30-35 °C
≤ 3 jours ≤ 3 jours
Candida albicans Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud
par exemple : dextrosé-gélosé peptones de caséine dextrosé-gélosé peptones de caséine dextrosé-gélosé
ou milieu liquide et de soja  ≤ 100 UFC et de soja  ≤ 100 UFC
ATCC 10231 Sabouraud dextrosé ≤ 100 UFC 20-25 °C  ≤ 100 UFC 20-25 °C
NCPF 3179 20-25 °C
30-35 °C ≤ 5 jours 30-35 °C ≤ 5 jours
IP 48.72 2-3 jours
≤ 5 jours ≤ 5 jours
NBRC 1594
NPP : non applicable
Aspergillus brasiliensis Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud Milieu gélosé aux Milieu Sabouraud
par exemple : dextrosé-gélosé ou peptones de caséine dextrosé-gélosé peptones de caséine dextrosé-gélosé
milieu dextrosé-gélosé et de soja ≤ 100 UFC et de soja ≤ 100 UFC
ATCC 16404 à la pomme de terre ≤ 100 UFC 20-25 °C ≤ 100 UFC 20-25 °C
IMI 149007 20-25 °C 30-35 °C ≤ 5 jours 30-35 °C ≤ 5 jours
IP 1431.83 5-7 jours, ou ≤ 5 jours ≤ 5 jours
NBRC 9455 jusqu’à sporulation
satisfaisante NPP : non applicable

Ensemencez des fractions/plaques de milieu liquide aux
peptones de caséine et de soja et de milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja avec un petit nombre (au
maximum 100 UFC) des microorganismes indiqués dans le
tableau 2.6.12.-1, en utilisant pour chacun une fraction/plaque
de milieu séparée. Ensemencez des plaques de milieu
Sabouraud dextrosé-gélosé avec un petit nombre (au
maximum 100 UFC) des microorganismes indiqués dans
le tableau 2.6.12.-1, en utilisant pour chacun une plaque de
milieu séparée. Incubez dans les conditions spécifiées dans le
tableau 2.6.12.-1.
Pour les milieux solides, la croissance obtenue ne doit
pas différer de plus d’un facteur 2 de la valeur calculée
pour un inoculum standardisé. Pour les inoculums
récemment préparés, la croissance des microorganismes
doit être comparable à celle observée avec un lot de milieu
précédemment contrôlé et approuvé. Les milieux liquides
conviennent si l’on observe une croissance clairement visible
des microorganismes, comparable à celle obtenue sur un lot
de milieu précédemment contrôlé et approuvé.
4-5. APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE DE
DÉNOMBREMENT EN PRÉSENCE DU PRODUIT
4-5-1. Préparation des échantillons. La méthode de
préparation des échantillons dépend des caractéristiques
physiques du produit à examiner. Si aucune des procédures
décrites ci-après ne s’avère satisfaisante, il est nécessaire de
développer une autre procédure.
Produits hydrosolubles. Dissolvez ou diluez le produit à
examiner (on prépare généralement une dilution au 1/10) dans
de la solution tampon peptonée au chlorure de sodium pH 7,0,
de la solution tampon phosphate pH 7,2 ou du milieu liquide
aux peptones de caséine et de soja. Ajustez si nécessaire à
pH 6-8. Les dilutions suivantes, le cas échéant, sont préparées
avec le même diluant.
Produits de nature non lipidique insolubles dans l’eau. Mettez
le produit à examiner en suspension (on prépare généralement
une dilution au 1/10) dans de la solution tampon peptonée au
chlorure de sodium pH 7,0, de la solution tampon phosphate
pH 7,2 ou du milieu liquide aux peptones de caséine et de
soja. Un agent tensioactif tel que du polysorbate 80 à la
concentration de 1 g/L peut être ajouté pour faciliter la mise en
suspension des substances difficilement mouillables. Ajustez
si nécessaire à pH 6-8. Les dilutions suivantes, le cas échéant,
sont préparées avec le même diluant.
Produits de nature lipidique. Dissolvez le produit à examiner
dans du myristate d’isopropyle stérilisé par filtration,
ou mélangez-le avec la quantité minimum requise de
polysorbate 80 stérile ou d’un autre agent tensioactif non
inhibiteur stérile, chauffé si nécessaire à une température
ne dépassant pas 40 °C ou dans certains cas exceptionnels
45 °C. Mélangez soigneusement et maintenez si nécessaire
à la température voulue, dans un bain-marie. Ajoutez le
diluant choisi, préalablement chauffé, en quantité requise
pour obtenir une dilution au 1/10 du produit initial. Mélangez
soigneusement tout en maintenant à la même température
pendant le temps minimum nécessaire à la formation d’une
émulsion. Les dilutions au 1/10 suivantes peuvent être
préparées avec le diluant choisi additionné d’une quantité
appropriée de polysorbate 80 stérile ou d’un autre agent
tensioactif non inhibiteur stérile.

5058 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3
Produits liquides ou solides sous forme d’aérosols. Transférez
aseptiquement le produit dans une membrane filtrante ou
dans un récipient stérile, pour les échantillonnages suivants.
Utilisez pour chacun des récipients à examiner soit la totalité
du contenu, soit un nombre défini de doses (aérosols à valve
doseuse).
Dispositifs transdermiques. Retirez le film protecteur des
dispositifs transdermiques et placez ces derniers, face adhésive
vers le haut, sur des plateaux de verre ou de plastique stériles.
Couvrez la face adhésive avec une matière poreuse stérile,
par exemple de la gaze stérile, pour éviter que les dispositifs
transdermiques ne collent les uns aux autres, et transférez
les dispositifs dans un volume approprié du diluant choisi
contenant des inactivateurs tels que du polysorbate 80 et/ou de
la lécithine. Agitez énergiquement pendant au moins 30 min.
◊Films orodispersibles. Dissolvez 10 films à examiner soit
dans de la solution tampon peptonée au chlorure de sodium
pH 7,0, soit dans de la solution tampon phosphate pH 7,2,
soit dans du milieu liquide aux peptones de caséine et de
soja. Pour dissoudre la préparation, il peut être nécessaire
de la chauffer (avec ou sans agitation) à une température ne
dépassant pas 40 °C (ou dans des cas exceptionnels 45 °C).
Ajustez si nécessaire à pH 6-8. Les dilutions suivantes, le cas
échéant, sont préparées avec le même diluant.◊
4-5-2. Inoculation et dilution. Ajoutez à l’échantillon
préparé comme décrit ci-dessus (4-5-1) et à un témoin
(ne contenant pas le produit à examiner) un volume de la
suspension microbienne suffisant pour obtenir un inoculum
d’au maximum 100 UFC. Le volume de suspension utilisé ne
doit pas dépasser 1 pour cent du volume du produit dilué.
Pour démontrer que le recouvrement microbien est acceptable,
il faut effectuer l’essai sur l’échantillon préparé avec le plus bas
facteur de dilution possible. Si l’activité antimicrobienne ou la
faible solubilité du produit l’interdit, un protocole spécifique
doit être développé. S’il est impossible d’éviter autrement une
inhibition de la croissance par l’échantillon, on peut procéder
à une neutralisation, dilution ou filtration avant addition de la
suspension microbienne.
4-5-3. Neutralisation/élimination de l’activité
antimicrobienne. Comparez le recouvrement microbien
respectivement obtenu à partir de l’échantillon préparé, dilué
comme décrit en 4-5-2 et incubé selon la procédure décrite en
4-5-4, et de la préparation témoin.
En cas d’inhibition de la croissance (réduction de plus d’un
facteur 2), apportez à la procédure suivie pour l’essai de
dénombrement concerné les modifications nécessaires pour
garantir la validité des résultats. Ces modifications peuvent
par exemple consister en (1) une augmentation du volume
du diluant ou du milieu de culture, (2) l’incorporation au
diluant d’agents neutralisants spécifiques ou généraux,
(3) une filtration sur membrane ou (4) une combinaison des
modifications précitées.
Agents neutralisants. Des agents peuvent être utilisés
pour neutraliser l’activité de substances antimicrobiennes
interférentes (tableau 2.6.12.-2). Ils peuvent être ajoutés au
diluant choisi ou au milieu, de préférence avant la stérilisation.
L’efficacité de tout neutralisant utilisé et son absence de
toxicité à l’égard des microorganismes doivent être démontrées
au moyen d’un blanc comportant le neutralisant mais non
le produit.
Tableau 2.6.12.-2. – Agents usuels de neutralisation des
substances interférentes
Méthode de neutralisation
Substance interférente possible
Glutaraldéhyde, mercuriels Hydrogénosulfite de sodium
(bisulfite de sodium)
Phénoliques, alcool, aldéhydes, sorbate Dilution
Aldéhydes Glycine
Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes
2.6.12. Essais de dénombrement microbien
Méthode de neutralisation
Substance interférente possible
Ammoniums quaternaires (QAC), Lécithine
parahydroxybenzoates (parabènes),
bis-biguanides
QAC, iode, parabènes Polysorbate
Mercuriels Thioglycolate
Mercuriels, halogènes, aldéhydes Thiosulfate
EDTA (édétate) Ions Mg2+ ou Ca2+
Si aucune méthode de neutralisation appropriée ne peut être
identifiée, on peut présumer que l’impossibilité d’isoler le
microorganisme inoculé est imputable à l’activité microbicide
du produit. Cette information tend à indiquer que le produit
n’est pas susceptible d’être contaminé par l’espèce considérée
du microorganisme. Il est cependant possible que le produit
inhibe certains des microorganismes spécifiés ici, mais n’en
inhibe pas d’autres qui ne figurent pas parmi les souches de
référence ou dont ces dernières ne sont pas représentatives.
Il convient donc d’effectuer l’essai au plus haut facteur de
dilution qui soit compatible avec une croissance microbienne
et le critère d’acceptation spécifique.
4-5-4. Recouvrement de microorganismes en présence
du produit. Effectuez des essais séparés pour chacun
de microorganismes cités. Seuls sont dénombrés les
microorganismes de la souche d’ensemencement.
4-5-4-1. Filtration sur membrane. Utilisez des membranes
filtrantes ayant un diamètre nominal des pores d’au maximum
0,45 μm. Le matériau constituant les membranes est choisi
de telle sorte que l’efficacité de rétention bactérienne ne
soit pas affectée par les constituants de l’échantillon à
examiner. Une membrane filtrante est utilisée pour chacun
des microorganismes cités.
Introduisez dans la membrane filtrante une quantité
appropriée de l’échantillon préparé comme décrit sous 4-5-1 à
4-5-3 (de préférence l’équivalent de 1 g de produit, ou moins
si le nombre présumé d’UFC est élevé), filtrez immédiatement
et rincez le filtre avec un volume approprié de diluant.
Pour le dénombrement des germes aérobies totaux
(DGAT), transférez la membrane sur du milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja. Pour le dénombrement des
moisissures/levures totales (DMLT), transférez la membrane
sur du milieu Sabouraud dextrosé-gélosé. Incubez les boîtes
comme indiqué dans le tableau 2.6.12.-1. Procédez au
dénombrement.
4-5-4-2. Dénombrement sur plaques. Effectuez le
dénombrement sur plaque au moins 2 fois pour chaque milieu
et utilisez la moyenne des 2 résultats.
4-5-4-2-1. Ensemencement en profondeur
Pour des boîtes de Petri de 9 cm de diamètre, introduisez
dans la boîte 1 mL de l’échantillon préparé comme décrit sous
4-5-1 à 4-5-3, puis 15-20 mL de milieu gélosé aux peptones de
caséine et de soja ou de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé,
à une température ne dépassant pas 45 °C. Si les boîtes de
Petri utilisées sont plus grandes, augmentez en conséquence
le volume de milieu gélosé. Utilisez au minimum 2 boîtes
de Petri pour chacun des microorganismes cités dans le
tableau 2.6.12.-1. Incubez les boîtes comme indiqué dans
le tableau 2.6.12.-1. Prenez la moyenne arithmétique des
dénombrements par milieu et calculez le nombre d’UFC dans
l’inoculum initial.
4-5-4-2-2. Etalement en surface
Pour des boîtes de Petri de 9 cm de diamètre, introduisez
dans la boîte 15-20 mL de milieu gélosé aux peptones de
caséine et de soja ou de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé,
à une température d’environ 45 °C, puis laissez solidifier. Si
les boîtes de Petri utilisées sont plus grandes, augmentez
en conséquence le volume de milieu gélosé. Faites sécher
les boîtes, par exemple dans une hotte à flux laminaire ou
un incubateur. Utilisez au minimum 2 boîtes de Petri pour
5059
2.6.12. Essais de dénombrement microbien PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3

chacun des microorganismes cités dans le tableau 2.6.12.-1. Combinaisons observées du nombre
Etalez à la surface du milieu un volume mesuré, d’au moins de tubes présentant une croissance
dans chaque série NPP par Limites de
0,1 mL, de l’échantillon préparé comme décrit sous 4-5-1 à gramme ou confiance
4-5-3. Procédez à l’incubation et au dénombrement comme Nombre de grammes ou millilitres millilitre à 95 pour
de produit par tube de produit cent
indiqué sous 4-5-4-2-1.
0,1 0,01 0,001
4-5-4-3. Méthode du nombre le plus probable (NPP). La
méthode du NPP présente une fidélité et une exactitude 2 2 2 35 9-94
inférieures à celles de la filtration sur membrane ou du 2 3 0 29 9-94
dénombrement sur plaques. Elle donne notamment des
résultats peu fiables pour le dénombrement des moisissures. 2 3 1 36 9-94
Elle est donc à réserver aux DGAT pour lesquels le recours aux 3 0 0 23 5-94
autres méthodes est impossible. Si l’emploi de cette méthode
est justifié, procédez comme suit. 3 0 1 38 9-104
Préparez au moins 3 dilutions en série au 1/10 du produit 3 0 2 64 16-181
comme décrit sous 4-5-1 à 4-5-3. Prélevez 3 fois 1 g ou 1 mL à
3 1 0 43 9-181
chaque niveau de dilution et transférez dans 3 tubes contenant
chacun 9-10 mL de milieu liquide aux peptones de caséine 3 1 1 75 17-199
et de soja, si nécessaire additionné d’un agent tensioactif
3 1 2 120 30-360
tel que le polysorbate 80 ou d’un neutralisant de l’activité
antimicrobienne. Pour une série de 3 dilutions, il faut par 3 1 3 160 30-380
conséquent ensemencer 9 tubes.
3 2 0 93 18-360
Incubez tous les tubes à 30-35 °C pendant au maximum
3 2 1 150 30-380
3 jours. Si la nature du produit à examiner rend la lecture des
résultats difficile ou incertaine, effectuez une subculture dans 3 2 2 210 30-400
le même milieu liquide ou sur du milieu gélosé aux peptones
3 2 3 290 90-990
de caséine et de soja, incubez à la même température pendant
1-2 jours et utilisez les résultats ainsi obtenus. Déterminez le 3 3 0 240 40-990
nombre le plus probable de microorganismes par gramme ou
3 3 1 460 90-1980
millilitre de produit à examiner à l’aide du tableau 2.6.12.-3.
3 3 2 1100 200-4000
Tableau 2.6.12.-3. – Valeurs du nombre le plus probable (NPP)
de microorganismes 3 3 3 > 1100

Combinaisons observées du nombre 4-6. RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION

de tubes présentant une croissance
dans chaque série NPP par Limites de Lors de la vérification de l’applicabilité de la méthode de
gramme ou confiance filtration sur membrane ou de dénombrement sur plaques,
Nombre de grammes ou millilitres millilitre à 95 pour
de produit par tube le nombre moyen obtenu pour chacun des microorganismes
de produit cent
de référence ne doit pas différer de plus d’un facteur 2 de
0,1 0,01 0,001 la valeur obtenue en l’absence du produit pour le témoin
0 0 0 < 3 0-9,4 défini en 4-5-2. Lors de la vérification de l’applicabilité de la
méthode NPP, la valeur calculée à partir de l’inoculum doit se
0 0 1 3 0,1-9,5 situer dans les limites de confiance à 95 pour cent des résultats
0 1 0 3 0,1-10 obtenus avec le témoin.
0 1 1 6,1 1,2-17 Si ces critères sont impossibles à satisfaire pour un ou
plusieurs des microorganismes soumis à l’essai par l’une
0 2 0 6,2 1,2-17
des méthodes décrites, il y a lieu d’utiliser pour examiner le
0 3 0 9,4 3,5-35 produit la méthode et les conditions d’essai qui permettent de
s’en approcher le plus.
1 0 0 3,6 0,2-17
1 0 1 7,2 1,2-17
5. CONTRÔLE DES PRODUITS
1 0 2 11 4-35
5-1. PRISE D’ESSAI
1 1 0 7,4 1,3-20 Sauf indication contraire, utilisez 10 g ou 10 mL du produit
1 1 1 11 4-35 à examiner, prélevés avec les précautions mentionnées plus
haut. Pour les liquides ou solides en aérosols, effectuez
1 2 0 11 4-35 l’échantillonnage sur 10 récipients. Pour les dispositifs
1 2 1 15 5-38 transdermiques, effectuez l’échantillonnage sur 10 dispositifs.
◊Pour les films orodispersibles, effectuez l’échantillonnage
1 3 0 16 5-38 sur 10 films.◊
2 0 0 9,2 1,5-35 La prise d’essai peut être réduite pour les substances actives
2 0 1 14 4-35 qui seront formulées dans les conditions suivantes : quantité
par unité (par exemple comprimé, capsule, préparation
2 0 2 20 5-38 injectable) inférieure ou égale à 1 mg, ou quantité par gramme
2 1 0 15 4-38 ou millilitre (pour les préparations non présentées par unités)
inférieure à 1 mg. Dans ces cas, la prise d’essai sera au moins
2 1 1 20 5-38 égale à la quantité contenue dans 10 unités ou dans 10 g ou
2 1 2 27 9-94 10 mL de produit.
2 2 0 21 5-40 Dans le cas de produits utilisés comme substances actives et
pour lesquels la quantité d’échantillon est limitée ou la taille
2 2 1 28 9-94
de lot extrêmement petite (moins de 1000 mL ou 1000 g), la

5060 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.3
prise d’essai devra représenter 1 pour cent du lot, à moins que
l’emploi d’une quantité moindre ne soit prescrite ou justifiée
et autorisée.
Dans le cas de produits pour lesquels le nombre total d’entités
constituant un lot est inférieur à 200 (par exemple échantillons
utilisés dans des essais cliniques), la taille de l’échantillon
peut être réduite à 2 unités, ou à 1 unité si la taille du lot est
inférieure à 100.
Effectuez les prélèvements au hasard dans le produit en vrac
ou les récipients dans lesquels est conditionnée la préparation.
Pour obtenir la quantité requise, mélangez le contenu d’un
nombre de récipients suffisant pour former l’échantillon.
5-2. EXAMEN DU PRODUIT
5-2-1. Filtration sur membrane. Utilisez un appareil de
filtration permettant le transfert de la membrane sur le milieu.
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité a
été établie comme décrit dans la section 4, et introduisez la
quantité appropriée d’échantillon dans 2 membranes filtrantes.
Filtrez immédiatement. Lavez chaque filtre selon la procédure
préalablement établie.
Transférez l’une des membranes sur du milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja, pour le DGAT, et l’autre
membrane sur du milieu Sabouraud dextrosé-gélosé, pour
le DMLT. Incubez la boîte de milieu gélosé aux peptones de
caséine et de soja à 30-35 °C pendant 3-5 jours, et la boîte
de milieu Sabouraud dextrosé-gélosé à 20-25 °C pendant
5-7 jours. Calculez le nombre d’UFC par gramme ou par
millilitre de produit.
Pour l’examen de dispositifs transdermiques ◊ou des films
orodispersibles◊, filtrez séparément 10 pour cent du volume
de la préparation décrite sous 4-5-1 sur 2 membranes stériles.
Transférez l’une des membranes sur du milieu gélosé aux
peptones de caséine et de soja, pour le DGAT, et l’autre sur du
milieu Sabouraud dextrosé-gélosé, pour le DMLT.
5-2-2. Dénombrement sur plaques
5-2-2-1. Ensemencement en profondeur
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité a
été établie comme décrit dans la section 4. Préparez au moins
2 boîtes de Petri par milieu et par niveau de dilution. Incubez
les boîtes de milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja à
30-35 °C pendant 3-5 jours et les boîtes de milieu Sabouraud
dextrosé-gélosé à 20-25 °C pendant 5-7 jours. Sélectionnez les
boîtes correspondant à une dilution donnée et présentant le
plus grand nombre de colonies inférieur à 250 pour le DGAT
et à 50 pour le DMLT. Prenez la moyenne arithmétique par
milieu des dénombrements et calculez le nombre d’UFC par
gramme ou par millilitre de produit.
5-2-2-2. Etalement en surface
Préparez l’échantillon par une méthode dont l’applicabilité a
été établie comme décrit dans la section 4. Préparez au moins
2 boîtes de Petri par milieu et par niveau de dilution. Pour
l’incubation et le calcul du nombre d’UFC, procédez comme
décrit pour l’ensemencement en profondeur.
5-2-3. Méthode du nombre le plus probable
Préparez et diluez l’échantillon par une méthode dont
l’applicabilité a été établie comme décrit dans la section 4.
Incubez tous les tubes à 30-35 °C pendant 3-5 jours. Effectuez
si nécessaire une subculture, selon la procédure préalablement
établie. Pour chaque niveau de dilution, notez le nombre de
tubes présentant une croissance microbienne. Déterminez le
nombre le plus probable de microorganismes par gramme ou
millilitre de produit à examiner à l’aide du tableau 2.6.12.-3.
5-3. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Le nombre de germes aérobies totaux (DGAT) est considéré
comme égal au nombre d’UFC obtenues avec le milieu
gélosé aux peptones de caséine et de soja ; si des colonies de
moisissures ou levures sont détectées sur ce milieu, elles sont
(2) Ce chapitre a fait l’objet du processus d’harmonisation des pharmacopées. Voir chapitre 5.8. Harmonisation des pharmacopées.
Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes
2.6.13. Recherche de microorganismes spécifiés
comptabilisées dans le DGAT. Le nombre total de moisissures
et levures (DMLT) est considéré comme égal au nombre
d’UFC obtenues avec le milieu Sabouraud dextrosé-gélosé ;
si des colonies de bactéries sont détectées sur ce milieu,
elles sont comptabilisées dans le DMLT. Si l’on prévoit
que le DMLT risque de dépasser le critère d’acceptation
du fait de la croissance bactérienne, du milieu Sabouraud
dextrosé-gélosé contenant des antibiotiques peut être utilisé.
Si le dénombrement est effectué par la méthode du NPP, la
valeur calculée est le DGAT.
Lorsqu’un critère d’acceptation est prescrit en matière de
qualité microbiologique, il est interprété comme suit :
– 101 UFC : nombre maximal acceptable = 20 ;
– 102 UFC : nombre maximal acceptable = 200 ;
– 103 UFC : nombre maximal acceptable = 2000, et ainsi de
suite.
Les solutions et milieux recommandés sont décrits dans le
chapitre général 2.6.13.
01/2021:20613
2.6.13. CONTRÔLE
MICROBIOLOGIQUE DES PRODUITS
NON STÉRILES : RECHERCHE DE
MICROORGANISMES SPÉCIFIÉS(2)
1. INTRODUCTION
Les essais décrits ci-après permettent de contrôler l’absence,
ou la présence limitée, de microorganismes spécifiés pouvant
être décelés dans les conditions décrites.
Ces essais sont en premier lieu destinés à déterminer si
une substance ou préparation satisfait à une spécification
préétablie en matière de qualité microbiologique. Il convient
dans ce cas de se conformer aux indications données ci-après,
notamment en ce qui concerne le nombre d’échantillons à
prélever et l’interprétation des résultats.
D’autres méthodes microbiologiques, notamment des
méthodes automatisées, peuvent être utilisées à condition
que leur équivalence avec la méthode de la pharmacopée ait
été démontrée.
2. PRÉCAUTIONS GÉNÉRALES
Préparez les échantillons comme décrit dans le chapitre
général 2.6.12.
Si le produit à examiner possède une activité antimicrobienne,
celle-ci est autant que possible éliminée ou neutralisée comme
décrit dans le chapitre général 2.6.12.
Si des substances tensioactives sont utilisées pour la
préparation des échantillons, leur absence de toxicité à l’égard
des microorganismes considérés et leur compatibilité avec les
neutralisants utilisés doivent être démontrées comme décrit
dans le chapitre général 2.6.12.
3. FERTILITÉ ET PROPRIÉTÉS INHIBITRICES DES
MILIEUX, APPLICABILITÉ DE LA MÉTHODE D’ESSAI ET
TÉMOINS NÉGATIFS
L’aptitude de l’essai à permettre la détection des
microorganismes en présence du produit à examiner doit
être établie. L’applicabilité de la méthode d’essai doit être
confirmée chaque fois qu’un changement susceptible d’affecter
le résultat de l’essai est apporté au mode opératoire ou au
produit.
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