L’ANALYSE DES

Carotenoïdes
DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS
 L’ANALYSE DES

Carotenoïdes
DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS

Izabela Miranda de Castro

Luis Fernando Londoño
José Luiz Viana de Carvalho
Angélica María Jaramillo
Sidney Pacheco
Indice

Détermination de carotenoïdes 4 3. Pratique expérimentale 13

Introduction 4 • Choix de la longueur d’onde de travail 13
Applicabilité 4 • Nécessité de faire un blanc 13
Principe de l’analyse 4 • Utilisation des cuves 13
Procedure experimentale 4 Assurance qualité et contrôle de la qualité 14
1. L’échantillonnage 4 Considerations pratiques pour le developpement
2. Préparation des échantillons 4 de systemes AQ/CQ 14
• Matrice: Manioc 5 • Organisation 14
• Matrice: Patate douce 6 • Validation des méthodes 14
3. L’extraction des échantillons 7 • Accreditation de laboratoires 14
4. Obtention de l’extrait en éther du pétrole 8 • Comparaisons interlaboratoires 14
5. Quantification par spectrophotométrie 9 • Situations où le laboratoire realise
• Feuille des résultats 10 les essais mais pas l’echantillonnage 15
Anexe 11 • Maitrise des enregistrements 15
Spectrophotométrie 11 Assurance qualité 15
1. Interaction lumière – matière 11 • Le controle des stocks 15
2. Loi de Beer-Lambert 12 • Documents d’enregistrements et conservation
• Unités 12 des archives 15
• Limites 12 • Échantillons pour l’analyse de caroténoïdes 15
 DÉTERMINATION DE CAROTENOÏDES

Introduction 2. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS

Les caroténoïdes sont des pigments naturels, liposolubles,
synthétisés uniquement par les plantes et certains
microorganismes. Certains d’entre eux sont des précurseurs
de la vitamine A. Les caroténoïdes présents chez les animaux
proviennent de leur alimentation, et en particulier des fruits
et des légumes. Les caroténoïdes possèdent des propriétés
fonctionnelles variées. Ce sont tout d’abord des colorants
très utilisés par l’industrie agro-alimentaire , mais aussi,
des molécules fonctionnelles actives dans la prévention de
certaines maladies.
Pour commencer la procédure d’analyse des caroténoïdes, la
préparation des échantillon doit d’abord être effectuée. Chaque
échantillon prélevé doit être soigneusement lavés à l’eau
courante en utilisant des brosses ou des éponges pour assurer
que la procédure de nettoyage soit complète et efficace.
Les échantillons doivent être nettoyés, épluchés, coupés,
triturés, homogénéisés dans des processeurs / mixer avant
d’être extraits. En fait, ils doivent être pesés en double, deux
replicates, en retirant des aliquotes de chaque échantillon en
function du montant probable des caroténoïdes présents dans
chaque matrice selon le tableau ci-dessous.

Applicabilité Dans le programme Haverst Plus, nous avons travaillé sur

la détermination des caroténoïdes dans plusieurs matrices.
Cette méthode est utilisée pour le dosage de caroténoïdes La procédure spécifique à suivre pour préparer chaque type
présents dans les aliments biofortifiés. d’échantillon étudié est décrite ci-dessous.

Principe de l’analyse TABLEAU 1. Quantité d’échantillon

Extraire et quantifier les caroténoïdes de végétaux. La Material Masse (g) Fiole jaugée (mL)
méthode est basée sur l’extraction des caroténoïdes avec un Carotte 2 100
solvant organique, et la détermination subséquente de leur
concentration par spectrophotométrie. Patate douce 2a5 50
Manioc 5 a 15 50

Procedure experimentale Farine de manioc 5 a 20 25

Maïs 5 a 10 50
1. L’ÉCHANTILLONNAGE
Farine de maïs 2a3 50
Les plantes à analyser doivent être collectées conformément
Tomate 2a5 100
à certaines règles. Les échantillons à analyser pour la teneur
en caroténoïde peuvent être collectés directement auprès du
secteur de la vente au détail ou même de la production. Le
nombre d’échantillons recueillis dépendra du lot échantillonné
ou de la superficie cultivée.

4 L’ANALYSE DES CAROTENOÏDES DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS

 Matrice: Manioc
1 2 3

4 5

Chaque échantillon doit être

épluchée et ensuite divisé en
quatre parties égales dans le
sens longitudinal.

6 7

Choisissez deux parties

qui sont en position
opposée et les broyer
dans un Mixer.

8 9
Les échantillons broyés
peuvent être conservés
au freezer dans des pots
étanches dans l’obscurité.

EMBRAPA 2019 5
 Matrice: Patate douce

1 2
Les patates biofortifiées sont
soigneusement lavées à l’eau
courante à l’aide de brosses ou
d’éponges pour que la procédure
de nettoyage soit adéquate.

3 4

Chaque échantillon doit

être epluché puis divisé en
quatre parties égales dans
le sens longitudinal.

5 6
Après le nettoyage, les
échantillons sont epluchés,
coupés et après, à l’aide d’un
processeur, les patates douces
sont broyées pour l’obtention
d’un mélange homogène.

6 L’ANALYSE DES CAROTENOÏDES DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS

3. L’EXTRACTION DES ÉCHANTILLONS

1 2
La pesée des échantillons est la
première étape de l’extraction. Les
échantillons sont pesés en utilisant
une balance analytique (0,1 mg de
précision) en prélevant des aliquotes
pour l’analyse ayant un poids tel que
décrit dans le tableau ci-dessus.

3 Les échantillons sont transférés 4

dans un mortier pour commencer
l’extraction. On y ajoute 3 g de
Celite et 25 ml d’acétone et le
mélange est homogénéisé / broyé
à l’aide d’un pilon jusqu’à obtention
d’une sorte de pâte.

5
Cette suspension qui contient On lave trois fois au moins
les carotenoides extraits, est avec de l’acétone jusqu’à ce
transférée dans un entonnoir à que l’extraction de l’échantillon
plaque filtrante couplé à une fiole à soit terminée, c’est-à-dire,
vide de 250 ml pour être filtré. l’échantillon reste sans couleur.

EMBRAPA 2019 7
4. OBTENTION DE L’EXTRAIT EN ÉTHER DU PÉTROLE

L’extrait contenant les 1 Cette étape doit être effectuée pour

carotenoïdes (en acétone) est que les caroténoïdes solubilisés dans
transféré à une ampoule à l’acétone puissent être transférés
décanter de 500 ml contenant dans un autre solvant - l’éther de
environ 40 ml d’éther du pétrole. pétrole. Pour éliminer l’acétone, de
l’eau ultra-pure est ajoutée lentement
pour éviter la formation d’émulsion.

2 On observe la formation de deux 3

phases: a) éther du pétrole +
carotenoides (1 et 2) et b) de l’eau
+ de l’acétone. Phase b est alors
éliminée. Cette procédure est répétée
jusqu’à trois fois ou plus.

L’extrait de carotenoïdes en éther du 4 5

pétrole doit être transferé dans une
fiole jaugée pour la quantification.
Il est préférable utiliser la verrerrie
ambre pour éviter la dégradation
des molécules.

6
Un entonnoir contenant un papier 7
filtre avec 3 grammes de sulfate de
sodium anhydre est placé sur la fiole
jaugée. Il faut transferer tout l’extrait
de carotenoïdes de l’ampoule dans la
fiole de 50 ml en le faisant passer à
travers la couche de sulfate.

Aprés avoir lavé l’ampoule et l’entonnoir avec le solvant au moins quatre fois, le volume
de la fiole est complété avec de l’éther du pétrole. Il faut faire attention pour que le
volume total d’éther utilisé ne depasse pas la capacité de la fiole, dans ce cas 50 ml.
8 L’ANALYSE DES CAROTENOÏDES DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS
5. QUANTIFICATION PAR SPECTROPHOTOMÉTRIE

1 La tenneur de carotenoïdes 2
des éxtraits doit
être déterminer par
spectrophotométrie.

3 4 La lecture de l’echantillon
est effectuée en utilisant un
spectrophotomètre a une
longueur d’onde de 450 nm a
l’aide d’ether de petrole en tant
que “blanc”.

Pour le calcul de la teneur totale en caroténoïde, la formule

suivante a été utilisée:

A x V (mL) x 104
carotenoides (µg|g) =
A 1%
1cm x P (g)

A = absorbance
V = le volume total de l’extrait (ml)
P = poids de l’échantillon (g)
A 1%
1cm = 2592 – coefficient d’absorptivité molaire du β-carotène
(dans l’éther du pétrole)

EMBRAPA 2019 9
 FEUILLE DES RÉSULTATS

Analyste: Date:
Échantillon:
Origine:
Observations:

Note: prendre note des faits tels comme ils se sont produits

Quantification par spectrophotométrie

Volume total Coefficient d’absorptivité

Absorbance Poid de l’échantillon (g)
de l’extrait (ml) molaire

Pour le calcul de la teneur totale en caroténoïde, formule suivante l’Utilisée:

A x V (mL) x 104
Carotenoides (µg|g) =
A 1%
1cm x P (g)
A = absorbance
V = le volume total de l’extrait (ml)
P = poids de l’échantillon (g)
A 1%
1cm = 2592 – coefficient d’absorptivité molaire du β-carotène (dans l’éther du pétrole)

Échantillon Résultat

10 L’ANALYSE DES CAROTENOÏDES DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS

 ANEXE

Spectrophotométrie
1. INTERACTION LUMIÈRE – MATIÈRE
La spectrophotométrie est l’étude de l’interaction entre la On peut utiliser le cercle chromatique qui permet de visualiser
matière et le rayonnement. Lorsque de la lumière traverse une rapidement quelles sont les couleurs complémentaires.
substance, elle est en partie transmise et en partie absorbée.
Les couleurs sont placées par ordre croissant de longueur
Si une substance absorbe dans le domaine visible (400 nm <
d’onde le long du cercle. Deux couleurs complémentaires se
λ < 800 nm), alors elle est colorée. Éclairée par de la lumière
trouvent l’une en face de l’autre.
blanche, elle prendra la couleur des radiations qui parviennent à
traverser, couleurs complémentaires des couleurs absorbées.

Rouge
(700 nm)

Orange Rouge-Rosé

Jaune Magenta
(570 nm) (700 nm)

Jaune-Vert
Couleurs Violet
complémentaires

Vert Bleu
(530 nm) (450 nm)

Bleu-Vert Bleu clair

Cyan
(500 nm)

EMBRAPA 2019 11
Exemple: une solution de diiode I2 absorbe principalement On définit:
les rayonnements de longueur d’onde entre 450 et 500 nm
• La transmittance de la solution:
(bleu-violet): la solution est alors jaune-orangée (couleurs
T= It(λ) ; 0 < T < 100%
complémentaires des rayonnements absorbés, situées en
I0(λ)
face dans le cercle chromatique).
• L’absorbance de la solution (ou densité optique) :
1,6 A = − log T (A est ainsi une grandeur positive sans dimension).
1,4
L’expérience montre que pour une solution peu concentrée en
substance absorbante, la relation suivante, dite loi de Beer-
1,2
Lambert, est vérifiée:
1,0

0,8 A = ε(λ) · ℓ · c
0,6 A: absorbance.
0,4 ℓ: longueur de la cellule.
0,2 c: concentration de substance absorbante.
0 ε(λ): molar absorption coefficient (in function of the nature of
0 450 500 550 600 650 700 the substance, the wavelength of the light λ, the nature of the
solvent and the temperature T).
Unités
Une analyse dimensionnelle classique montre que le coefficient
2. LOI DE BEER-LAMBERT d’absorption molaire a la dimension d’une longueur au carré
La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative divisée par une quantité de matière. Son unité dans le S.I. est
et qualitative qui consiste à mesurer l’absorbance ou la densité donc le m2 · mol-1. Mais ce n’est pas l’unité la plus usuelle:
optique d’une substance chimique donnée, généralement em • ℓ se mesure en cm (la cuve fait en général 1 cm).
solution. Plus l’échantillon est concentré, plus il absorbe la • c ’est une concentration en mol · L−1.
lumière dans les limites de proportionnalité énoncées par la loi • A est sans unité.
de Beer-Lambert. • ε(λ) est donc en L · mol−1 · cm−1
Considérons une radiation monochromatique (de longueur Si la solution contient plusieurs substances absorbantes, il y a
d’onde λ) incidente, d’intensité I0(λ). Cette radiation traverse additivité des densités optiques:
une épaisseur `de solution du composé X de concentration c
qui absorbe la lumière partiellement. L’intensité transmise est A = Σi Ai = Σ εi(λ) · ℓ · ci donc A = ℓ · Σi εi(λ) · ci
It(λ) < I0(λ). où ℓ est la longueur de la cellule traversée, ci la concentration
Curve contenant la de l’entité Xi et εi(λ) le coefficient d’absorption molaire de
solution de composé
absorbant l’espèce Xi.

Faisceau Faisceau Limites

incident émergent
La valeur de A est comprise entre 0 y +∞, or expérimentalement
on ne peut pas exploiter toutes les valeurs d’absorbance.
Intensité Intensité
I0(λ) It(λ) Vers les petites valeurs de A:
Plus les valeurs de A sont petites plus le détecteur reçoit
Longueur de la cuve: ℓ
de lumière et plus la différence entre l’intensité incidente et

12 L’ANALYSE DES CAROTENOÏDES DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS

 l’intensité transmise est faible. Les valeurs se rapprochent
de la valeur de l’incertitude intrinsèque de l’appareil et ne
peuvent être exploitées.
Vers les grandes valeurs de A:
Il existe deux limites quand les valeurs de A augmentent.
• La première est due au spectrophotomètre en lui-même, plus
A est grande moins le détecteur reçoit de lumière, quand on
se rapproche de la limite de détection le détecteur ne peut
plus distinguer deux valeurs proches de A. Vous verrez
apparaître un écrêtage de la courbe, on parle de saturation
de l’appareil même si le terme est mal choisi (il pourrait faire
croire que le détecteur reçoit trop de lumière, mais c’est
l’inverse). Cette limite dépend de l’appareil utilisée.
• La deuxième limite se situe au niveau de la loi de Beer-Lambert.
Cette dernière n’est plus vérifiée quand la concentration en
espèces absorbantes est trop importante (les molécules ne
se comportent plus indépendamment les unes des autres).
La limite dépend des molécules absorbantes.
Expérimentalement, avec les spectrophotomètres du labo,
pour des mesures raisonnables nous resterons dans le
domaine suivant: 0, 1 < A < 1.
3. PRATIQUE EXPÉRIMENTALE
Si l’on fixe ℓ et c, on obtient la courbe A (λ) qui est baptisée
spectre d’absorption de X.
Si l’on fixe λ, A doit être proportionnelle à c à ℓ constant ; on
trace donc la courbe A = f(c) pour voir si la loi de Beer-Lambert
est vérifiée (courbe d’étalonnage).
Pour une solution ne contenant qu’une seule espèce
absorbante, la mesure de la densité optique est donc une
méthode non destructive de la mesure de la concentration de
l’entité en question. On peut donc utiliser la spectrophotométrie
dans des études de cinétique ou comme méthode analytique
de détermination des concentrations.
Choix de la longueur d’onde de travail
Pour augmenter la précision et limiter l’incertitude sur les
mesures on se place à la longueur d’onde pour laquelle le
coefficient d’absorption molaire de la substance est maximum.
Remarque 1: Lorsque le maximum d’absorption conduit à une
absorbance trop élevée (saturation, sortie du domaine de validité
de la loi de Beer-Lambert), on peut se placer à un maximum relatif
d’absorbance plus faible, ou encore à un épaulement du spectre.
Remarque 2: Si plusieurs substances colorées sont
susceptibles d’absorber la lumière incidente, on essayera de
se placer à une longueur d’onde pour laquelle une seule des
espèces absorbe la lumière. On pourra alors suivre l’évolution
de sa concentration, sans tenir compte des autres espèces.
Nécessité de faire un blanc
Si l’on veut mesurer uniquement l’absorbance du composé
étudié il faut s’affranchir de toutes les autres sources
d’absorption : les parois de la cuve et le solvant.
Voici la marche à suivre pour une mesure à λ fixé:
1. Placer dans l’appareil une cuve de mesure (dite cuve de
référence) ne contenant que le solvant.
2. Relever l’absorbance, et calibrer l’appareil pour lui signifier que
cette absorbance doit être nulle (ceci se fait automatiquement
avec les appareils numériques dont vous disposez).
3. Retirer la cuve de référence et placer la cuve contenant la
substance absorbante. Relever la mesure. Pour le balayage
en longueur d’onde, il suffit de placer la cuve de référence
pour que l’appareil mesure son absorbance à chaque λ. Il
soustraira la courbe obtenue à celle de l’échantillon.
Utilisation des cuves
• Lorsqu’elles existent, on maintient les cuves par les faces dépolies.
• Il faut veiller à éliminer les fines bulles d’air qui pourraient se
former lors du remplissage des cuves.
• Il faut essuyer soigneusement avec du papier Joseph les
faces des cuves traversées par le faisceau lumineux afin
d’éliminer toutes traces de doigts.
• Si la cuve est en plastique, il faut la jeter si elle présente des rayures.
La spectrophotométrie exige beaucoup de
précision dans la préparation des solutions;
c’est en effet une méthode très sensible.
EMBRAPA 2019 13
Assurance qualité et contrôle de
la qualité
Les bonnes pratiques prévoient la mise en œuvre de procédures
d’assurance de la qualité et de contrôle de la qualité (AQ/CQ)
lors de la compilation de ces inventaires.
On entend par Contrôle de la qualité (CQ) un système d’activités
techniques systématiques, destinées à mesurer et contrôler la
qualité de l’inventaire pendant son élaboration. Un système CQ
a pour objet: (i) De fournir des vérifications systématiques et
cohérentes pour garantir l’intégrité, l’exactitude et l’exhaustivité
des données ; (ii) D’identifier et rectifier les erreurs et omissions;
(iii) De documenter et archiver le matériel des inventaires et
consigner toutes les activités CQ. Les activités de Contrôle de
la qualité (CQ) incluent des méthodes générales, telles que des
contrôles de l’exactitude de l’acquisition des données et des
calculs et l’utilisation de procédures standard. Les activités
d’Assurance de la qualité (AQ) incluent un système planifié
de procédures d’examen mises en œuvre par des personnes
n’ayant pas participé directement à la compilation ni au
développement de l’inventaire.
Considerations pratiques pour le
developpement de systemes AQ/CQ
En pratique, le système AQ/CQ n’est qu’un des composants
du processus d’établissement d’inventaire, et les organismes
chargés des inventaires ne disposent pas de ressources
illimitées. On doit concilier les besoins de contrôle de la qualité,
d’amélioration de l’exactitude et de réduction des incertitudes et
les besoins de rapidité d’exécution et de rentabilité. Un système
conforme aux bonnes pratiques vise à équilibrer ces besoins et
permettre l’amélioration continue des estimations des inventaires.
La norme de qualité assurance attend du laboratoire qu’il
s’engage à travailler dans le respect des bonnes pratiques
professionnelles et de la réglementation, ce qui doit l’amener à
offrir un cadre de travail sécurisé aux opérateurs.
Organisation
Le laboratoire doit avoir prévu et formalisé les précautions
prises pour assurer la constance des équipements utilisés sur
14 L’ANALYSE DES CAROTENOÏDES DES ALIMENTS BIOFORTIFIÉS
le site ou dans ses laboratoires mobiles (transport, stockage,
utilisation, etc.).
Validation des méthodes
Les explicitations des exigences de validation des méthodes
ou recommandations sur ce même sujet dans des domaines
techniques particuliers peuvent être données dans les guides
techniques d’accréditation ou les documents d’exigences
spécifiques associés aux domaines techniques en question.
Accreditation de laboratoires
L’accréditation de laboratoires suivant les normes
internationales a pour but d’attester de la compétence des
laboratoires à réaliser des étalonnages ou des essais avec des
moyens spécifiés. Les comparaisons interlaboratoires sont un
des outils fiables et performants pour atteindre ce but.
Les résultats des comparaisons interlaboratoires permettent
également aux organismes d’accréditation comme le Cofrac
de s’assurer de la cohérence des résultats des essais et des
étalonnages entre les laboratoires, tant au niveau national
qu’au niveau international.
Comparaisons interlaboratoires
Les laboratoires accrédités doivent participer aux comparaisons
interlaboratoires, pour démontrer leur compétence et assurer
la qualité de leurs résultats, lorsque c’est approprié. Le
laboratoire accrédité doit établir un plan de participation aux
comparaisons interlaboratoires en déterminant les circuits
représentatifs de l’ensemble des domaines d’activité liés
à sa portée d’accréditation. La fréquence de participation
découle d’une analyse de besoins qui prend, notamment,
en considération d’autres mesures d’assurance de la
qualité. Ce plan est revu régulièrement en fonction des
changements influents, par exemple changements de
méthodes, d’équipement, de personnel. Il faut participer à des
comparaisons interlaboratoires parce qu’elles constituent un
outil de progrès pour les laboratoires et qu’elles peuvent être
utilisées comme un élément, parmi d’autres, de démonstration
de leur compétence. Dont sont issus les échantillons ne peut
être donné sous accréditation.
Situations où le laboratoire realise les essais mais pas
Matériaux et réactifs
l’echantillonnage
Lorsque le laboratoire réalise hors accréditation l’opération Nombre Article Détail Quantité
d’échantillonnage et sous accréditation les essais sur l’(les) Matériel de lavage,
1
échantillon(s) prélevé(s), et qu’il rapporte sur un rapport brosses, mousses
unique le résultat des opérations d’échantillonnage et 2 Couteau
d’essais, les résultats des essais ne peuvent être rapportés
comme couverts par l’accréditation que s’ils sont assortis 3 Bouteille de lavage 500 ml
d’une mention restrictive indiquant qu’ils ne se rapportent Pipettes
4 1, 5, 10 ml
qu’aux échantillons soumis à essais. En corollaire, dans cette volumétriques
situation, tout avis ou déclaration de conformité extrapolant 5 Matrax Volumétrique 25, 50, 100 ml,
les résultats à l’objet dont sont issus les échantillons ne peut
Kitassato
être donné sous accréditation. 6 250, 2000 ml
(Filtering Erlenmeyer)
Maitrise des enregistrements 7 Tube à essai 50 ml
La durée de conservation des enregistrements doit satisfaire à la
8 Entonnoir de séparation 500 ml
fois les besoins du laboratoire, des clients, de la Direction Générale,
des Pouvoirs Publics et ne peut être inférieure à 18 mois. 9 Entonnoirs

Assurance qualité 10 Mortier et pistil

Le controle des stocks 11 Entonnoir en verre fritté

• Nettoyage de la verrerie. Réactifs et produits chimiques

• Contrôle des stocks des solvants organiques.
1 Celite HyFlo Super Cel
• Contrôle de l’inventaire de la verrerie.
• Qualité des réactifs utilisés: Équipement
1. Caractéristiques du produit, du solvant utilisé dans le
1 Spectrophotomètre
procédé d’extraction.
2. Certificat ou % pureté (exemple : Spectro UVvis). 2 Balance analytique
3. % Pureté de la celite.
Ultrapure ou
4. Eau distillée ou ultra pure. 3
eau distillée
Documents d’enregistrements et conservation des archives 4 Pompe à vide
Échantillons pour l’analyse de caroténoïdes: Achats locaux
• Il faut les enregistrer et associer un numéro, un code, une
Réactifs et produits chimiques
classification.
• Nombre d’échantillons - une description / origine. 1 Acétone
• Noter la description de chaque échantillon, c’est-à-dire, origine,
responsable, date de récolte, le poids, etc. 2 Éther de pétrole
• Un technicien doit être responsable pour chaque activité.
Sulfate de sodium
3
anhydre

EMBRAPA 2019 15
HarvestPlus est un chef de file d’une initiative mondiale visant à améliorer la nutrition
et la santé publique grâce au développement et à la mise en œuvre de cultures
vivrières riches en vitamines et en minéraux, et fournit un leadership mondial en
matière de preuves et de technologie en matière de biofortification. HarvestPlus fait
partie du Programme de Recherche du CGIAR sur l’Agriculture pour la Nutrition et la
Santé (A4NH).

CIAT, Km 17 Recta Cali-Palmira C.P. 763537

Valle del Cauca, Colombia
Téléphone: +57 2 4450000 Ext. 3662
Email: harvestpluslac@cgiar.org
www.lac.harvestplus.org

© 2019 HarvestPlus