Analyses en microbiologie

Produits non stériles

par Yves ROCHÉ
Docteur ès Sciences pharmaceutiques
Directeur qualité, CENEXI
et Philippe NIEL
Maître de conférences, Faculté des sciences pharmaceutiques, Université Paris V

1. Techniques classiques de la Pharmacopée européenne ............... P 3 352 - 2

1.1 Méthodes quantitatives .............................................................................. — 2
1.2 Recherche de germes spécifiés .................................................................. — 5
2. Techniques rapides de contrôle microbiologique ........................... — 5
2.1 Amélioration d’une technique classique ................................................... — 6
2.2 Techniques alternatives de détection rapide ............................................. — 6
2.3 Applications des principales techniques alternatives
dans l’industrie pharmaceutique................................................................ — 8
Références bibliographiques ......................................................................... — 9

a microbiologie est la science qui s’intéresse aux bactéries, levures,

L moisissures et virus : cette définition du dictionnaire livre le champ d’inves-
tigations auquel devrait s’appliquer le contrôle des produits non stériles. Il est
singulier, à ce jour, de constater que les principales normes ou monographies
en vigueur s’adressent principalement aux bactéries, levures et moisissures et
peu aux virus.
Pourtant, l’eau, par exemple, matière première de nombreuses formules ou
procédés de fabrication, agent de nettoyage, est un parfait vecteur de transport
de ce type de micro-organismes. Nous nous limiterons donc, dans cette étude,
à la quantification des trois premiers types de micro-organismes, laissant à la
virologie le soin de combler ce vide.
La présence de la flore mésophile doit être réglementairement, ou pour des
raisons économiques, recherchée et quantifiée sur de très nombreux produits
qui concernent les produits de santé : médicaments et leurs matières premiè-
res de départ ou de process, produits cosmétiques et leurs matières premières
de départ ou de process, produits diététiques, alicaments et enfin dispositifs
médicaux.
La démarche est, quels que soient les textes réglementaires suivis, la même
et nous allons décrire successivement les méthodes quantitatives utilisées, les
techniques de recherche de germes spécifiés, les solutions et milieux de culture
utilisés et enfin les agents neutralisants nécessaires lorsque le produit étudié
possède un pouvoir antimicrobien, puis nous aborderons les différentes tech-
niques rapides ainsi que les conservateurs.

Nota : le dossier « Analyses en microbiologie » se compose de quatre parties :

— Produits non stériles [P 3 352] ;
— Antibactériens [P 3 353] ;
— Produits stériles [P 3 354] ;
— Contrôles de l’environnement [P 3 355].

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ANALYSES EN MICROBIOLOGIE ___________________________________________________________________________________________________________
1. Techniques classiques
de la Pharmacopée
européenne
par Yves ROCHÉ
1.1 Méthodes quantitatives
Les essais décrits pour le contrôle microbiologique des produits
non stériles (dénommé aussi « dénombrement des germes
aérobies viables totaux » – Monographie 2.6.12 de la Pharmacopée
européenne) permettent le dénombrement des bactéries méso-
philes, des moisissures et levures capables de se développer en
aérobiose.
Ces essais servent avant tout à déterminer si un produit est
conforme aux exigences microbiologiques spécifiées de sa mono-
graphie, à la Pharmacopée.
Cependant, pour la Pharmacopée européenne (chapitre 2.6.12),
ces techniques peuvent également être mises en œuvre pour véri-
fier l’efficacité de la conservation antimicrobienne (voir chapitre
conservateurs) ainsi que dans le cadre de la surveillance du niveau
de qualité des matières premières ou de préparations pharmaceu-
tiques.
Des précautions sont nécessaires pour la bonne exécution de ces
contrôles :
— la manipulation doit éviter toute contamination accidentelle
du produit à examiner ;
— les micro-organismes éventuellement présents ne doivent
pas être altérés par les précautions prises pour éviter la
contamination ;
— la neutraliser de l’activité antimicrobienne du produit,
lorsqu’elle est nécessaire, en validant l’activité et l’efficacité des
agents neutralisants vis-à-vis des micro-organismes considérés.
Les trois techniques les plus couramment utilisées sont la méthode
de filtration sur membrane, la méthode de dénombrement sur
plaque et la méthode du nombre le plus probable. Cette dernière
est généralement appliquée quand l’une des deux précédentes ne
peut l’être du fait du produit lui-même (solide soluble ou non, corps
gras...) ou du nombre de micro-organismes.
Les textes réglementaires précisent généralement que, quelle
que soit la technique utilisée, il est nécessaire de la valider.
1.1.1 Échantillonnage et préparation
de l’échantillon
■ Échantillonnage
Le prélèvement doit être effectué par du personnel formé aux
techniques de prélèvements microbiologiques afin d’éliminer tout
risque de contamination accidentelle du produit. Le plan d’échan-
tillonnage dépend de nombreux paramètres tels que taille du lot,
caractéristiques du produit, niveau de contamination présumé du
produit, homogénéité de distribution des micro-organismes.
Dans ce dernier cas, la Pharmacopée européenne (2.6.12) donne
un exemple de plan d’échantillonnage dit à trois niveaux :
« Cinq échantillons sont prélevés dans chaque lot et examinés
séparément : les trois niveaux sont définis comme suit :
(i) échantillons acceptables, c’est-à-dire contenant moins de m
unités formant colonie (UFC) par gramme ou par millilitre, m étant
la limite spécifiée ;
(ii) échantillons marginaux, c’est-à-dire contenant plus de m UFC
mais moins de 10 m UFC par gramme ou par millilitre ;
(iii)échantillons non conformes, c’est-à-dire contenant plus de
10 m UFC par gramme ou par millilitre.
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La taille de l’échantillon (ou des échantillons) est variable selon
le produit à examiner et doit tenir compte du produit, du niveau de
contamination présumé et peut être obtenue par mélange de n
récipients si nécessaire pour obtenir la quantité requise.
Dans le cas de dispositifs, le nombre d’éléments prélevés devra
être représentatif du lot.
■ Préparation de l’échantillon
● Produits hydrosolubles
En général, une solution est préparée en diluant la quantité pré-
levée dans un diluant (solution tampon peptonée au chlorure de
sodium pH 7,0 par exemple ou tout autre diluant approprié). Le rap-
port de dilution le plus fréquent est de 1/10 mais il peut être adapté
aux caractéristiques du produit ou à une sensibilité requise diffé-
rente.
Si le produit possède un pouvoir antimicrobien, un agent
neutralisant peut être ajouté au diluant en prenant soin d’ajuster
ensuite le pH à 7 environ si nécessaire.
● Produits de nature non lipidique insolubles dans l’eau
La préparation est identique à la précédente hormis le fait qu’un
agent tensioactif peut être ajouté au diluant pour une meilleure
mise en suspension. Le tensioactif le plus couramment utilisé est
le polysorbate 80. De même que précédemment, si le produit
possède un pouvoir antimicrobien, un agent neutralisant peut être
ajouté dans les mêmes conditions.
● Produits de nature lipidique
La présence d’un agent tensioactif est ici nécessaire. Il est ajouté
en quantité égale à la moitié de la masse du produit à examiner
maximum, et mélangé en chauffant si nécessaire à une tempé-
rature maximum de 40 oC. Le mélange ainsi obtenu est ensuite
amené à dilution au 1/10 avec le diluant déjà décrit à la même
température.
● Dispositifs médicaux
Les dispositifs médicaux, comme par exemple les cuillères
doseuses, les compte-gouttes, les trocards de transvasement...
sont immergés dans le diluant précédemment décrit, par exemple.
● Dispositifs transdermiques
Après retrait du film protecteur, les dispositifs transdermiques
sont placés :
— pour moitié de l’échantillon, dans une solution de tampon
peptonée au chlorure de sodium pH 7,0 pouvant contenir des
inactivateurs appropriés. Ils sont ensuite soumis à une agitation
énergique pendant 30 min au moins (préparation A) ;
— pour l’autre moitié de l’échantillon, dans du milieu liquide D
et soumis également à une agitation énergique pendant 30 min
(préparation B : recherche des entérobactéries et autres bactéries
gram-négatives).
1.1.2 Examen des échantillons : méthodes utilisées
En règle générale, le contrôle microbiologique des produits non
stériles est réalisé soit par la méthode de filtration sur membrane,
soit par la méthode de dénombrement sur plaque. On utilisera la
méthode du nombre le plus probable quand le dénombrement
microbien ne peut être réalisé par l’une des deux premières, du fait
de la nature du produit ou du nombre de micro-organismes
présumé.
■ Méthode de filtration sur membrane
L’isolement des micro-organismes est réalisé par la filtration sur
des membranes filtrantes de porosité nominale de 0,45 µm pour
lesquelles l’efficacité de rétention bactérienne a été montrée.
Une attention toute particulière doit être apportée au matériau
constituant la membrane. En effet, le produit à examiner ou l’un de
ses constituants ne doit pas modifier l’efficacité de rétention
bactérienne.
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De nombreux solvants dans les produits pharmaceutiques par

exemple, tels que alcool benzylique, propylèneglycol, solutions Tableau 1 – Valeurs du nombre le plus probable
fortement alcooliques... doivent conduire au choix de membranes de bactéries (Pharmacopée européenne)
spécifiques. Ces dernières sont généralement constituées d’acétate
de cellulose. Trois tubes pour chaque niveau de dilution
Pour les solutions acqueuses, huileuses, faiblement alcooliques, Nombre de tubes Catégorie
les membranes en nitrate de cellulose sont couramment utilisées. positifs NPP (1) Limites
par de confiance
Le mode opératoire pour cette technique consiste à filtrer sur gramme à 95 %
deux filtres à membrane respectivement l’équivalent d’environ 1 g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 1 2
de produit. Chaque membrane est ensuite rincée avec trois fois
100 ml du diluant utilisé pour la préparation de l’échantillon et 0 0 0 <3 – –
décrit précédemment, par exemple. 0 1 0 3 x <1 17
Une des deux membranes est déposée ensuite sur un milieu 1 0 0 3 x 1 21
gélosé approprié au développement des bactéries. La boîte de
milieu gélosé est incubée à 30-35 oC pendant 5 jours. La seconde 1 0 1 7 x 2 27
membrane est déposée sur un milieu gélosé permettant le déve- 1 1 0 7 x 2 28
loppement des moisissures et levures. L’incubation de cette boîte
est réalisée à 20-25 oC pendant 5 jours. Le nombre d’unités for- 1 2 0 11 x 4 35
mant colonie par gramme ou millilitre est alors calculé en utilisant 2 0 0 9 x 2 38
les plaques dont le nombre de colonies est inférieur à 100.
2 0 1 14 x 5 48
Pour les dispositifs transdermiques, la préparation A est filtrée
respectivement sur deux membranes stériles. La première est 2 1 0 15 x 5 50
transférée sur milieu gélosé B pour le dénombrement des germes 2 1 1 20 x 8 61
aérobies viables totaux, la seconde sur milieu gélosé C, pour le
dénombrement des moisissures et des levures. 2 2 0 21 x 8 63
3 0 0 23 x 7 129
■ Méthode de dénombrement sur plaques
3 0 1 38 x 10 180
Deux techniques sont possibles pour la réalisation de cette
méthode, soit par ensemencement en profondeur, soit par 3 1 0 43 x 20 210
étalement en surface. 3 1 1 75 x 20 280
● Par ensemencement en profondeur
3 2 0 93 x 30 390
L’échantillon (de l’ordre de 1 ml) est introduit dans une boîte de
Petri puis mélangé à un milieu gélosé liquéfié adapté soit à la 3 2 1 150 x 50 510
culture des bactéries soit à la culture des moisissures et des 3 2 2 210 x 80 640
levures à une température ne dépassant pas 45 oC.
3 3 0 240 x 100 1 400
La quantité de milieu employé sera adaptée à la taille de la boîte
de Petri utilisée. Le test est réalisé en double pour chaque milieu 3 3 1 460 x 200 2 400
et chaque dilution. Les boîtes sont incubées 5 jours dans les 3 3 2 1 100 x 300 4 800
conditions de température décrites précédemment pour les
bactéries d’une part et les levures-moisissures d’autre part. 3 3 3 > 1 100 – –
Le dénombrement s’effectue sur les boîtes présentant le plus (1) Catégorie 1 : résultats normaux obtenus dans 95 % des cas.
grand nombre de colonies inférieur à 300 (100 pour les levures et Catégorie 2 : résultats moins probables obtenus dans seulement 4 %
des cas. Il est déconseillé d’utiliser ces résultats pour les décisions
moisissures). La moyenne arithmétique des dénombrements
importantes. Les résultats encore moins probables que ceux de la
permet le calcul du nombre d’unités formant colonie par gramme catégorie 2 ne sont pas mentionnés et ne sont en aucun cas
ou par millilitre. acceptables.
● Par étalement en surface

L’échantillon de 0,1 ml au moins est étalé à la surface de boîtes

de Petri dans lesquelles auront été coulés puis solidifiés des
milieux gélosés appropriés à la culture des bactéries ou des
moisissures et levures.
Tout comme dans le cas de l’ensemencement en profondeur,
deux boîtes de Petri par milieu et par dilution sont préparées. De
même, les conditions d’incubation et les calculs seront effectués
comme précédemment.
Les tubes sont incubés à 30-35 oC pendant 5 jours.
Pour chaque dilution, on notera le nombre de tubes présentant
une pousse microbienne. Pour la Pharmacopéé européenne, on se
reportera par exemple au tableau 1 (tableau 2.6.12.-1 de la Pharma-
copée – Valeurs du nombre le plus probable de bactéries) pour
déterminer le nombre le plus probable de bactéries par gramme ou
millilitre de produit à examiner.

■ Méthode du nombre le plus probable 1.1.3 Efficacité des milieux de culture

Comme nous l’avons déjà mentionné, cette méthode ne doit être
utilisée que lorsque l’emploi des deux autres est impossible du fait
d’une fidélité et d’une exactitude inférieure. De plus, les résultats
obtenus pour le dénombrement des moisissures sont peu fiables.
La méthode repose sur une série d’au moins trois dilutions au
1/10 successives du produit (décrit dans le paragraphe Préparation
de l’échantillon). On prélèvera ainsi trois fois 1 g ou 1 ml de chaque
dilution que l’on transférera dans trois tubes contenant chacun 9 à
10 ml d’un milieu liquide approprié additionné si nécessaire d’un
tensioactif ou d’un agent neutralisant. (0)
et validité de la méthode du dénombrement
L’efficacité des milieux de culture doit être montrée. Pour cela,
des souches de référence sont utilisées pour préparer des sus-
pensions témoins contenant environ 100 unités formant colonie
par millilitre. Ces suspensions des divers micro-organismes sont
mises en œuvre comme témoins pour les méthodes de dénom-
brement décrites en présence et en l’absence du produit à étudier.
Pour les deux premières méthodes décrites dans le para-
graphe 1.1.2, le nombre de colonies obtenues ainsi ne doit pas dif-

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férer de plus d’un facteur 5 de la valeur calculée à partir de la

solution témoin pour chaque micro-organisme de référence. Tableau 2 – Qualité microbiologique
Pour la méthode du nombre le plus probable, la valeur calculée
des préparations pharmaceutiques
à partir de la solution témoin doit être comprise dans l’intervalle de
confiance de 95 % des résultats obtenus. Préparation Pharmaceutique Limite de contamination
La validité de la méthode est donnée par le contrôle de la stéri- Catégorie 1 Essai de stérilité
lité du milieu, du diluant, de l’efficacité des conditions d’asepsie en
appliquant la méthode avec la solution tampon peptonée au Catégorie 2
chlorure de sodium pH 7,0 stérile, par exemple, comme préparation Germes aérobies viables totaux Max. 10 2 micro-organismes
à examiner. On ne doit observer aucune croissance microbienne. (bactéries
aérobies + moisissures et
levures) par gramme (g) ou
1.1.4 Interprétation des résultats millilitre (ml) ou par dispositif
et limites de contamination transdermique (film protecteur
et couche support compris)
Le nombre de germes viables totaux correspond à la somme du Entérobactéries et certaines Dispositifs transdermiques :
nombre de bactéries et du nombre de moisissures et levures autres bactéries gram négatives Absence de bactéries, vérifiée
(supposés égaux aux nombres d’unités formant colonie). sur 1 dispositif
Il peut s’avérer que certains micro-organismes se développent Autres préparations : Max. 1
par g ou par ml
sur les deux milieux utilisés. Dans ce cas, la valeur obtenue peut
être corrigée. Pseudomonas aeruginosa Absence dans 1 g ou 1 ml ou
Dans le cas de la méthode du nombre le plus probable, la valeur 1 dispositif (film protecteur et
donnée représente le nombre de bactéries. couche support compris)
Des limites de contamination microbienne sont, en règle Staphylococcus aureus Absence dans 1 g ou 1 ml ou
générale, données soit en tant que limites prescrites dans les 1 dispositif (film protecteur et
monographies, soit en tant que recommandations. C’est le cas des couche support compris)
préparations pharmaceutiques, pour lesquelles le chapitre 5.1.4. est Catégorie 3 A
publié « à titre d’information » dans la Pharmacopée européenne
(voir tableau 2). (0) Germes aérobies viables totaux Max. 10 3 bactéries par g ou
par ml
Quatre catégories sont définies :
● Catégorie 1 : Préparations obligatoirement stériles aux termes Max. 102 moisissures et levures
de la monographie de la forme pharmaceutique correspondante et par g ou par ml
autres préparations étiquetées stériles. Escherichia coli Absence dans 1 g ou 1 ml
L’essai de stérilité est appliqué pour cette détermination.
Catégorie 3 B
● Catégorie 2 : Préparations pour application locale ou pour
administration dans les voies respiratoires à l’exception des prépa- Germes aérobies viables totaux Max. 10 4 bactéries par g ou
rations obligatoirement stériles, et dispositifs transdermiques. par ml
● Catégorie 3 :
Max. 102 moisissures et levures
A : Préparations pour administration par voie orale ou rectale. par g ou par ml
B : Préparations pour administration orale contenant des Entérobactéries et certaines Max. 10 2 bactéries par g ou
matières premières d’origine naturelle (animale, végétale ou autres bactéries gram-négatives par ml
minérale) lorsqu’un prétraitement antimicrobien est impossible et
que l’autorité compétente admet une contamination microbienne Salmonelles Absence dans 10 g ou 10 ml
des matières premières supérieure à 103 micro-organismes viables Escherichia coli Absence dans 1 g ou 1 ml
par gramme ou par millilitre. Sont exclus les médicaments à base
de plantes décrits dans la catégorie 4. Staphylococcus aureus Absence dans 1 g ou 1 ml
● Catégorie 4 :
Catégorie 4 A
Médicaments à base de plantes exclusivement composés d’une ou
plusieurs drogues végétales (entière, en fragments ou en poudre). Germes aérobies viables totaux Max. 10 7 bactéries par g ou
par ml
A : Médicaments à base de plantes dont l’emploi fait intervenir
de l’eau bouillante. Max. 105 moisissures et levures
par g ou par ml
B : Médicaments à base de plantes dont l’emploi ne fait pas
intervenir d’eau bouillante. Escherichia coli Max. 102 E. coli par g ou par ml
Les limites de contamination données en exemple doivent être Catégorie 4 B
interprétées comme suit : lorsque la valeur est de 102 micro-orga-
nismes, la valeur maximale acceptable est de 5 × 102 ; lorsqu’elle Germes aérobies viables totaux Max. 10 5 bactéries par g ou
est de 103 micro-organismes, la valeur maximale acceptable est de par ml
5 × 103, est ainsi de suite.
Max. 104 moisissures et levures
Dans le cas d’un plan d’échantillonnage à 3 niveaux après calcul par g ou par ml
du nombre de germes viables totaux pour chacun des échantillons,
le produit satisfait à l’essai si : Entérobactéries et certaines Max. 10 3 bactéries par g ou
autres bactéries gram-négatives par ml
— aucun des résultats individuels obtenus n’est supérieur d’un
facteur 10 ou plus à la limite prescrite ; Escherichia coli Absence dans 1 g ou 1 ml
— le nombre de résultats individuels se situant entre la limite
Salmonelles Absence dans 10 g ou 10 ml
prescrite et 10 fois cette limite est inférieur à 2.

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1.1.5 Solutions et milieux de culture recommandés
La composition des solutions et des milieux de culture est
parfois donnée à titre d’information ou de recommandation. Il est
de la responsabilité de l’utilisateur de montrer que leurs propriétés
nutritives et sélectives sont satisfaisantes pour l’essai concerné.
Cependant, le choix est primordial dans la mesure où l’on peut
dans certains cas aboutir à des résultats sensiblement différents
pour une même méthode et des milieux différents. C’est pour cette
raison que dans le domaine pharmaceutique, par exemple, un
travail d’harmonisation internationale a été conduit sur la base
d’une comparaison des méthodes, critères d’acceptation et
milieux, solutions tamponnées et agents neutralisants des mono-
graphies des Pharmacopées européenne, américaine et japonaise.
1.1.6 Agents neutralisants
Nous avons vu qu’il peut parfois être nécessaire de neutraliser
un possible pouvoir antimicrobien en additionnant le diluant
d’agents neutralisants.
Ainsi, par exemple, le jaune d’œuf est utilisé pour neutraliser les
composés à fonction ammonium quaternaire, le thiosulfate de
sodium pour neutraliser les composés halogénés, le thioglycolate
de sodium pour annuler les effets des composés organo-mercuriels
et un mélange de laurylsulfate de sodium, polysorbate 80, lécithine
et jaune d’œuf pour neutraliser les composés phénoliques.
Les teneurs en agents neutralisants peuvent être augmentées si
nécessaire mais, dans tous les cas, l’efficacité et la non-toxicité à
l’égard des micro-organismes considérés doivent être prouvées.
1.2 Recherche de germes spécifiés
Dans certains cas, il est demandé de rechercher, en parallèle à la
flore mésophile, des germes spécifiés, soit témoins d’un niveau de
contamination, soit dont la présence est indésirable.
Lors de cette recherche, il est nécessaire de revivifier les
micro-organismes dans la mesure où l’utilisation de milieux
sélectifs employés n’autorise pas la mise en évidence de
micro-organismes ayant subi des lésions sublétales.
Les milieux utilisés pour l’étape de revivification ou de culture,
tout comme les températures d’incubation préconisées sont
primordiales dans cette recherche.
■ Entérobactéries et certaines
autres bactéries Gram-négatives
L’essai décrit dans la monographie de la Pharmacopée
européenne, par exemple, permet la mise en évidence de bactéries
de la famille des Enterobacteriaceae mais aussi d’autres types de
bactéries comme les Aeromonas et Pseudomonas.
Deux essais peuvent être conduits : l’absence de croissance de
colonies de bactéries Gram-négatives sur plaque ou l’évaluation
quantitative.
Dans les deux cas, les entérobactéries sont isolées à partir de
sub-cultures sur milieu gélosé sélectif.
Pour l’évaluation quantitative, des dilutions successives sont
réalisées avant sub-culture et le nombre probable de bactéries est
calculé sur la base de la plus petite quantité de produit ayant
donné un résultat positif et la plus grande quantité de produit
ayant donné un résultat négatif (tableau 3 tiré du tableau 2.6.13.-1).
Pour l’examen de dispositifs transdermiques, une partie aliquote
de préparation B (décrite au paragraphe 1.1.1) est filtrée sur
membrane stérile qui est transférée dans un milieu enrichi. Après
incubation, ce dernier est étalé sur gélose spécifique pour cette
recherche. (0)
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ANALYSES EN MICROBIOLOGIE
Tableau 3 – Évaluation du nombre probable de bactéries
Résultat obtenu avec une quantité
de produit de Nombre probable
de bactéries par gramme
0,1 g 0,01 g 0,001 g de produit
ou 0,1 ml ou 0,01 ml ou 0,001 ml
+ + + Plus de 103
+ + – Moins de 103 et plus de 102
+ – – Moins de 102 et plus de 10
– – – Moins de 10
■ Escherichia Coli, Salmonelles, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus
Les essais décrits pour ces micro-organismes sont en règle
générale, pour les produits pharmaceutiques et cosmétiques, des
tests négatifs. Il ne doit pas être observé de colonies du type décrit
ou si croissance il y a, les tests biochimiques et sérologiques de
confirmation sont négatifs.
Chacun de ces micro-organismes est isolé par réalisation de
sub-cultures sur des milieux gélosés spécifiques, à des tempé-
ratures d’incubation précises et pendant des périodes d’incubation
allant de 18 à 72 heures.
La recherche de Pseudomonas aeruginosa et de Staphylococcus
aureus sur les dispositifs transdermiques est réalisée sur une part
aliquote de la Préparation A, avec une étape de revivification et
repiquage sur milieux gélosés spécifiques à la mise en évidence de
chacun de ces germes.
■ Propriétés nutritives et sélectives des milieux
et validité de l’essai
Tout comme pour les méthodes de dénombrement de la flore
mésophile, chaque lot de milieu déshydraté utilisé doit montrer son
aptitude à permettre le développement des micro-organismes consi-
dérés. Des souches de référence seront donc utilisées et dans ce cas,
un résultat positif doit être obtenu pour chaque micro-organisme.
■ Clostridies
Deux types d’essais peuvent être aussi menés dans la recherche
de ces micro-organismes : le premier est destiné aux produits pour
lesquels il est impératif d’exclure des clostridies pathogènes et
donc d’en vérifier l’absence, le second destiné aux produits pour
lesquels le nombre de ces germes détermine un niveau de qualité.
La mise en évidence de Clostridies se fait par incubation en
anaérobiose puis sub-cultures sur milieu spécifique additionné de
Gentamicine.
La distinction entre Clostridies et certaines espèces de Bacillus
est possible grâce au test catalase qui sera positif pour les Bacillus
et négatif pour les Clostridies.
Le dénombrement de Clostridium perfringens est conduit en
effectuant des dilutions au 1/100 et au 1/1 000 du produit et en
évaluant le nombre le plus probable au moyen du tableau 1.
2. Techniques rapides
de contrôle microbiologique
par Philippe NIEL
Les techniques de contrôle microbiologique mises en œuvre
dans l’industrie pharmaceutique sont standardisées par les
Pharmacopées. Elles ont souvent un temps de réponse relative-
ment long et sont difficilement automatisables. D’autres indus-
tries, alimentaires [1], cosmétiques, ont déjà pu bénéficier de
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techniques alternatives. Sous réserve d’une validation, certaines de
ces techniques semblent pouvoir être adaptées au domaine phar-
maceutique, soit pour des protocoles de la Pharmacopée euro-
péenne (contamination initiale, étude des eaux, essai d’efficacité
des conservateurs, dosage des antibiotiques, etc.), soit pour des
contrôles « in process » permettant le cas échéant de prendre des
mesures correctives à temps.
Nous allons aborder sans prétendre être exhaustif les techniques
de détection et de dénombrement bactérien. Les techniques
d’identification ne seront pas abordées ici. Nous pouvons
distinguer deux groupes de techniques : celles correspondant à
l’amélioration d’une méthode classique détectant une croissance et
les techniques alternatives de détection rapide.
2.1 Amélioration d’une technique classique
Certaines étapes des techniques classiques de contrôle micro-
b i o l o g i q u e p e u v e n t b é n é fi c i e r d ’ a m é l i o r a t i o n s q u i vo n t
grandement faciliter la mise en œuvre de ces protocoles, mais le
gain de temps ne touchera pas la phase de croissance des
micro-organismes et sera donc limité.
2.1.1 Préparation des échantillons
Les échantillons solides pourront subir un broyage de type
Stomacher (appareil à marteaux), éventuellement après avoir subi
une dilution automatisée dans du milieu de culture dans des
dilueurs de type Dilumat. Toutes ces opérations sont réalisées dans
un sac plastique stérile scellé jetable, ceci préservant la propreté
du système de broyage.
2.1.2 Milieux de culture et souches bactériennes
La préparation des milieux de culture peut être soit simplifiée
par l’emploi de milieux déshydratés et d’un répartiteur automati-
que de milieux, soit supprimée par l’achat de milieux prêts à
l’emploi. Cette dernière solution, la plus simple et la plus onéreuse,
doit être entreprise avec un fabricant capable de fournir un certifi-
cat d’analyse garantissant la conformité de chaque lot de milieux.
La fertilité des milieux de culture peut être validée par l’uti-
lisation d’inoculums bactériens précalibrés commerciaux. Ceci
dispense l’utilisateur du maintien en collection de ces souches et
de la préparation des inoculums.
2.1.3 Méthodes d’ensemencement
■ Ensemenceur SPIRAL
Une microseringue étalon à débit variable et contrôlé commande
le dépôt de l’échantillon liquide à la surface de la gélose d’une
boîte de Petri en rotation. Le stylet distributeur de l’ensemenceur,
monté sur un chariot mobile, se déplace simultanément du centre
de la boîte vers sa périphérie ; l’échantillon est ainsi déposé en
forme de spirale d’Archimède dans la boîte de Petri. Le volume
distribué est parfaitement calibré et assure la répartition de
l’échantillon de façon logarithmiquement décroissante. Cette
variation du volume d’échantillon déposé permet d’obtenir une
densité décroissante de colonies bactériennes développées le long
de la spire.
Cette technique permet sans dilution le dénombrement de 10 à
106 Unités Formant Colonie (UFC) par ml analysé. Après incubation
classique (durée, température), le comptage peut s’effectuer soit
par comparaison visuelle à un abaque fourni par le fabricant, soit
par compteur laser (ceci nécessitant un milieu non opaque).
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■ Gélose contact
L’emploi de ce type de gélose est courant pour les contrôles de
surface. L’ensemencement consiste simplement à appliquer la
gélose dont la surface arase la boîte de Petri sur la surface à
analyser puis à mettre à incuber.
■ Système PETRIFILMND
Ce système permet le dénombrement de flore totale ou des
coliformes. Il se présente sous la forme d’un double film enduit de
nutriments déshydratés. Le film inférieur quadrillé sert de support
à un milieu de culture déshydraté et à un agent gélifié avec une
dépression permettant le dépôt de 1 ml d’inoculum. Le film
supérieur souple et translucide est enduit d’un agent gélifiant et
d’un indicateur d’oxydoréduction (tétrazolium). Après incubation,
le comptage des colonies est facilité par la présence du
quadrillage.
■ Système QUANTI-TRAY COLILERTND
Le principe repose sur un modèle statistique identique à celui de
la technique classique de dilution séquentielle dans 15 tubes. Dans
ce système, l’échantillon est fractionné automatiquement par
l’appareil de scellement et ceci dispense des dilutions. La lecture se
fait en consultant la table du MPN (nombre le plus probable).
■ Filtration sur une membrane hydrophobe (ISO-GRIDND)
Pour un échantillon filtrable, ce système, constitué d’une
membrane filtrante carrée quadrillée hydrophobe, permet un
comptage aisé des colonies après incubation, ceci grâce au
quadrillage.
2.1.4 Systèmes de lecture
■ Analyseurs d’image
Ces systèmes, outre leur rapidité et leur fiabilité, donnent des
résultats plus élevés que ceux réalisés classiquement. En effet, des
petites colonies non visibles à l’œil sont comptabilisées par ces
analyseurs. Ces appareils sont connectables à un système infor-
matique permettant de stocker les données acquises.
■ Milieux contenant des substances chromogènes
Ces milieux de « préidentification » mettent en évidence une
activité enzymatique dont la présence est spécifique d’une espèce
bactérienne. La libération d’un composé chromogène permet de
repérer les colonies suspectes sur la boîte de Petri. Si ces milieux
connaissent un intérêt en microbiologie clinique et dans le contrôle
alimentaire, leur utilisation dans le domaine du contrôle pharma-
ceutique semble limitée, car ne dispensant pas d’une identification
classique.
2.2 Techniques alternatives
de détection rapide
Ces techniques alternatives de détection rapide vont causer un
gain de temps en supprimant ou en raccourcissant la phase de
croissance bactérienne nécessaire dans les techniques classiques
pour visualiser les micro-organismes.
2.2.1 Méthodes microscopiques
et méthodes dérivées
■ Dénombrement en cellule de Petroff Hauser
Cette technique rapide de dénombrement nécessite une bonne
expérience de l’expérimentateur. La profondeur de la cellule est de
0,02 mm, ce qui facilite le comptage en diminuant le nombre de
mises au point microscopique (objectif 40).
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■ Méthode de Breed (coloration de Gram, bleu de méthylène)
Le dénombrement de bactéries par l’examen microscopique
dans un volume donné de prélèvement après coloration est long et
le résultat dépend beaucoup de l’opérateur.
■ Utilisation de fluorochrome
● Microscopie à épifluorescence : cette coloration suivie d’un
examen microscopique en UV permet la détection à faible gros-
sissement. De nombreux colorants sont utilisés comme le jaune
d’acridine, la fluorescéine ou l’orange d’acridine. Dans ces
conditions, le seuil de détection est de 105 germes par ml.
La concentration préalable sur membrane filtrante ou par
centrifugation en gradient de densité permet d’atteindre un seuil de
détection de 102 à 103 germes par ml.
La technique DEFT (Direct Epifluorescence Filter Technique )
permet, après filtration, de dénombrer les bactéries et les levures.
L’acridine orange pénètre dans les cellules et se fixe aux acides
nucléiques (ADN et à ARN). La fixation sur l’ADN donne un
complexe fluorescent vert tandis que la fixation sur l’ARN conduit
à un complexe fluorescent rouge-orange. Si la bactérie est en
pleine croissance ou en pleine activité métabolique, le rapport
ARN/ADN est élevé et la bactérie apparaît rouge-orangée. Si la
bactérie est inactive ou morte, le rapport ARN/ADN est faible et la
bactérie apparaît verte. Cette particularité de coloration permet de
contrôler non seulement la qualité hygiénique liée au résultat du
dénombrement mais aussi la quantité de bactéries non viables.
Cette technique rapide (30 min) a un seuil de détection de
103 bactéries par ml.
Il existe des possibilités d’automatisation pour le comptage par
analyseur d’images.
● Cytométrie de flux : les micro-organismes, après extraction des
prélèvements par des solutions tampons, sont marqués par un
composé fluorescent et injectés en continu dans la cellule de mesure
les uns après les autres par un flux coaxial. La lumière émise par cha-
que micro-organisme est analysée par un détecteur. Le seuil de
détection est d’environ 100 cellules par ml ou g de produit.
● Cytométrie à balayage laser sur membrane filtrante : l’échan-
tillon est filtré sur une membrane qui retient les micro-organismes.
Les cellules viables sont ensuite colorées in situ par un marqueur
fluorescent. La surface du filtre est balayée automatiquement par un
faisceau laser, ce qui permet un dénombrement automatisé avec un
seuil de détection de 1 micro-organisme par volume filtré.
2.2.2 Détection de métabolites
■ Méthodes radiométriques
La croissance des micro-organismes peut être mise en évidence
de deux façons. Le micro-organisme peut hydrolyser un substrat
radioactif en un métabolite dont on mesure la vitesse d’apparition.
C’est le cas par exemple de 14CO2 dégagé à partir de 14C glucose.
Le micro-organisme peut aussi incorporer ce substrat marqué et
l’on mesure la radioactivité accumulée dans les micro-organismes.
■ Variation du potentiel rédox
La croissance d’un micro-organisme aérobie strict ou anaérobie
aérobie facultatif va entraîner la variation du potentiel rédox du
milieu. Cette variation peut être mise en évidence par le virage d’un
indicateur d’oxydoréduction ou par électrochimie. Ces deux techni-
ques utilisées dans le domaine agroalimentaire ne connaissent pas
encore de développement dans le domaine pharmaceutique.
■ Bioluminescence
Le dosage de l’ATP (adénosine triphosphate) présent dans toutes
les cellules vivantes peut être effectué de manière simple et rapide
par la réaction de bioluminescence qui est le résultat de l’activation
du système luciférine/luciférase. La quantité d’ATP contenue dans
les cellules vivantes étant extrêmement variable selon la nature de
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ANALYSES EN MICROBIOLOGIE
la cellule et son état physiologique la corrélation entre quantité
d’ATP détectée et dénombrement reste très délicate.
Le dosage de l’ATP qui est présent dans toutes les cellules
vivantes (source d’énergie) et donc dans les bactéries, permet
l’estimation des populations microbiennes (en particulier des
germes vivants car la concentration en ATP diminue très vite après
la mort cellulaire et devient non détectable). Dans la réaction, la
luciférine est décarboxylée en présence d’ATP, de Mg++ et de luci-
férase en oxyluciférine avec production de CO2 , pyrophosphate,
AMP et d’un photon à 562 nm.
On peut donc évaluer le nombre de micro-organismes à partir de
la quantité d’ATP d’origine microbienne présente dans le produit.
Cette quantité au sein d’un micro-organisme varie « peu » en fonc-
tion de la phase de croissance ; l’amplitude de la variation autour de
la moyenne atteint 1,5 fois cette moyenne. Cette quantité d’ATP
intracellulaire varie de 0,3 à 10 · 10–16 g/cellule. Il est donc possible
de déduire de la concentration en ATP un ordre de grandeur du
nombre de bactéries dans un milieu. Si la population est composite,
on adopte comme concentration en ATP par cellule 5 · 10–16 g.
La mesure de l’émission lumineuse peut se faire au moyen d’un :
— fluorimètre (sensibilité de 1 µg ATP/ml) ;
— compteur à scintillations (sensibilité de 10–13 à 10–15 g ATP
soit environ de 1 000 à 10 cellules).
■ Impédancemétrie
Ce procédé consiste à mesurer des variations de conductivité
d’un milieu de culture. Ces variations sont dues à l’activité
métabolique des micro-organismes. La prolifération cellulaire va
entraîner une variation des caractéristiques électriques du milieu
de culture. L’impédance va diminuer. L’impédance est l’opposition
à conduire un courant alternatif à travers un milieu conducteur. On
la mesure en faisant passer un courant entre deux électrodes
plongeant dans le milieu.
● Théorie de l’impédancemétrie : l’impédancemétrie peut être
simplement définie comme la mesure de la résistance d’un maté-
riau conducteur au flux d’un courant alternatif.
Lorsque deux électrodes en métal sont immergées dans un
liquide conducteur, le système se comporte comme une résistance
et un condensateur en série.
En conséquence, l’impédance du système intègre l’addition de
deux facteurs : la résistance et la capacitance du milieu.
Le métabolisme microbien conduit habituellement à une dimi-
nution de l’impédance du milieu et donc à une augmentation de la
conductivité du système.
● Technique classique : les électrodes sont en contact avec le
milieu de culture dans lequel se développent les germes que l’on
veut étudier. Les milieux de culture en général, et plus spécialement
ceux développés pour l’impédancemétrie, se composent de
substrats peu chargés qui sont transformés par les voies méta-
boliques normales en produits finaux hautement chargés. À titre
d’exemple, on peut citer la conversion du glucose (substrat non
ionisé) en deux molécules d’acide lactique en présence d’oxygène
qui conduit lui-même à la formation d’ions bicarbonates plus
conducteurs que l’ion lactate.
Un automate de mesure par impédancemétrie peut être
simplement considéré comme un instrument de mesure des
changements de la conductivité du milieu de culture.
● Technique indirecte : la croissance de certains micro-
organismes, et particulièrement de certaines levures et moisissures,
ne provoque pas de grand changement de conductivité. On
considère que cela est dû au fait qu’ils ne produisent pas de méta-
bolites fortement ionisés mais plutôt non ionisés comme l’éthanol.
Des levures peuvent absorber les ions d’une solution ce qui pro-
voque une nette diminution de la conductivité du milieu de culture.
En utilisant la technique indirecte, on peut résoudre ces pro-
blèmes en suivant le métabolisme microbien via la production de
dioxyde de carbone.
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ANALYSES EN MICROBIOLOGIE ___________________________________________________________________________________________________________
Une solution d’hydroxyde de potassium est déposée entre les
électrodes.
La cellule est hermétiquement bouchée de façon à ce que le CO2
produit dans le milieu par le métabolisme microbien soit piégé
dans la solution de potasse.
Le bilan de ces réactions est le remplacement progressif d’ions
hydroxyle par des ions carbonate moins conducteurs. On observe
alors une diminution de la conductivité.
2.3 Applications des principales
techniques alternatives
dans l’industrie pharmaceutique
2.3.1 Appareils utilisés
2.3.1.1 Appareils d’impédancemétrie
■ Constitution des systèmes
Tous les systèmes sont constitués par l’association des éléments
suivants.
● Une cellule de mesure : elle possède plusieurs électrodes. Cette
cellule contient le milieu de culture ainsi que l’échantillon à analyser.
Des membranes filtrantes peuvent être introduites dans la plupart
des cellules lorsque le volume de l’échantillon à analyser est trop
important.
● Un incubateur : c’est à l’intérieur de l’incubateur que l’on place
les cellules de mesure pendant toute la durée de l’analyse. Contrôlé
par microprocesseur, il maintient les cellules à température
constante et assure la lecture des mesures électriques.
● Un système informatique : c’est en général un système
multitâche qui enregistre et traite les données transmises par
l’incubateur. Il interprète automatiquement les résultats obtenus.
Ces résultats peuvent être consultés à tout moment, pendant ou
après l’analyse. Plusieurs incubateurs peuvent être reliés à un
même système informatique.
● Des milieux de culture : ils sont souvent spécialement formulés
pour être utilisés avec ces instruments. Les milieux employés pour
la mesure du signal de conductance contiennent des éléments
nutritifs peu ionisés. Les micro-organismes dégradent ces substrats
en de nombreux produits finaux fortement chargés. Le signal de
capacitance permet d’utiliser des milieux qui, à cause de leur impor-
tance ionique, ne peuvent pas être employés pour la mesure de la
conductance. Des milieux non sélectifs permettent d’effectuer des
tests de détection et/ou de numération de la flore totale. L’utilisation
de milieux plus sélectifs permet de rechercher et, dans certains cas,
de dénombrer des flores spécifiques (coliformes, levures et moisis-
sures, etc.).
Les différences principales entre les appareils d’impédance-
métrie concernent le nombre et le type de signaux électriques
mesurés ainsi que le volume des cellules et leur nombre par unité
d’incubation.
■ Bactometer
Le Bactometer (fabriqué aux États-Unis, distribué par Bio-
Mérieux) mesure soit la conductance soit la capacitance. Ses cellu-
les de mesure se présentent sous forme de modules composés de
16 cuvettes en matière plastique à usage unique.
Chaque cellule est indépendante et contient deux électrodes de
mesure. Les cuvettes ont un volume utile de 2 ml. Les modules de
16 cuvettes sont adaptés pour les grandes séries d’analyses.
L’incubateur comporte deux étuves indépendantes contenant
chacune deux ou quatre modules, soit 32 ou 64 cellules. La tempé-
rature de chaque étuve peut être maintenue entre 8 et 55 oC (effet
Peltier).
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P 3 352 − 8 © Techniques de l’Ingénieur
Le système informatique gère un maximum de quatre incu-
bateurs, ce qui confère au système une capacité de 512 analyses
simultanées jusqu’à huit températures d’incubation différentes.
■ Rabit (Rapid Automated Bacterial Impedance Technique )
Le Rabit (fabriqué en Angleterre par Don Whitley Scientific et dis-
tribué en France par AES Laboratoire) mesure uniquement le signal
de conductance. Les cellules en polypropylène autoclavables et
donc réutilisables, ont un volume utile de 10 ml. Les deux
électrodes de mesure se situent au fond de la cellule. Pour détecter
les micro-organismes produisant peu de métabolites ionisés ou
pour utiliser des milieux ayant une conductance trop importante,
on emploie la méthode indirecte développée sur cet appareil.
L’incubateur comporte un bloc d’aluminium chauffant qui
contient 32 cellules (température maximale à 55 oC).
Le système informatique peut être relié à 16 incubateurs et
permet donc de réaliser en même temps 512 analyses jusqu’à
16 températures différentes.
2.3.1.2 Cytométrie de flux (appareil ChemFlow)
Nous décrirons le système ChemFlow commercialisé par la
société Chemunex, qui aujourd’hui est dédié aux dénombrements
microbiologiques industriels. D’autres appareils de mesure
utilisant la cytométrie en flux existent sur le marché mais ne sont
pas spécialement adaptés à ces types de comptage. Le système est
composé d’un cytomètre analyseur qui peut être équipé d’un
automate de préparation et d’injection d’échantillon.
■ Caractéristiques
● Cellule de mesure : la cellule de mesure est une cellule à flux
laminaire en quartz où l’échantillon est injecté dans un canal avec un
liquide gainant qui évite le contact des micro-organismes de
l’échantillon avec les parois.
Lorsque l’échantillon arrive dans la cellule de mesure, la pression
du liquide de gaine assure le passage des micro-organismes un à
un devant le faisceau laser.
● Système optique : un laser d’argon refroidi à l’air, de 15 mW,
réglé à 488 nm permet l’excitation. L’émission est mesurée à deux
longueurs d’onde (vert à 520 nm et rouge supérieur à 560 nm) par
deux photomultiplicateurs qui convertissent le signal lumineux en
signal électrique. Le système ChemFlow, à la différence d’autres
systèmes ouverts, réalise la lecture à l’intérieur de la cellule de
mesure, le laser traversant la cellule. Les colorants préconisés pour
ce système sont des substrats dérivés de la fluorescéine.
● Traitement des données : l’utilisation de ces deux longueurs
d’onde permet une discrimination des micro-organismes par
rapport au bruit de fond, principalement par comparaison du signal
fluorescent de la particule à celui de la fluorescéine.
Chaque particule détectée est classée sur une échelle relative
d’intensité de fluorescence et l’ensemble des mesures comptabi-
lisé sous forme d’histogramme.
■ Résultats
Le résultat est exprimé en nombre de micro-organismes par
unité de volume. L’automatisation du système permet de répondre
aux besoins de routine. La coloration de l’échantillon, sa filtration
si nécessaire et son injection dans l’analyseur sont effectuées à
raison de 20 à 50 échantillons/ h.
■ Limite de détection
Cette technique permet dans le meilleur des cas de détecter entre
50 et 100 levures-moisissures/ml et 500 bactéries/ml ou g en
détection directe. Pour une recherche qualitative (présence/absence),
une étape d’enrichissement d’environ 24 h est nécessaire.
__________________________________________________________________________________________________________ ANALYSES EN MICROBIOLOGIE

2.3.1.3 Cytométrie à balayage laser (appareil Chemscan)
Les éléments optiques et électroniques du système sont réunis
dans un appareil compact commercialisé par la société Chemunex.
■ Caractéristiques
Après filtration de l’échantillon et marquage des micro-orga-
nismes sur le filtre, celui-ci est introduit dans une chambre noire,
sur un support thermostaté.
● Optique : la source d’excitation est un laser d’argon refroidi à
l’eau, réglé à 40 mW et 488 nm. Il effectue un balayage de la totalité
du filtre. Le balayage est induit par deux miroirs oscillants,
l’émission est détectée à deux (ou trois) longueurs d’onde et
collectée par deux ou trois photomultiplicateurs.
● Traitement des données : une série de critères de discri-
mination permet de différencier les éléments fluorescents à
dénombrer et à rejeter. Ce dispositif fait appel aux caractéristiques
optiques du marqueur, à la taille de la particule et à la forme du
signal.
■ Résultats
Le résultat apparaît sous forme de représentation graphique du
filtre avec la position exacte et précise des événements détectés.
Le dénombrement est donné en micro-organismes/ml ou g (par
volume filtré). Un système de vérification des résultats par
observation microscopique directe de la membrane permet une
visualisation des événements détectés.
■ Limites de détection
les contrôles d’hygiène. Elle consiste à restituer le nombre de
photons après transformation logarithmique permettant de définir
des zones de propreté. Cette méthode d’expression n’a pas pour
objectif l’évaluation quantitative des micro-organismes.
■ Appareillage
De nombreux appareils existent actuellement sur le marché et
une description exhaustive ne peut être faite dans ce document.
Certains sont particulièrement destinés aux contrôles d’hygiène
des surfaces et ne peuvent être utilisés pour une évaluation
quantitative ou semi-quantitative de la contamination microbienne
dans un produit. Ces appareils sont en général portables et utili-
sables par des manipulateurs non spécialisés en techniques de
laboratoire. Une infrastructure de laboratoire n’est pas nécessaire
pour leur mise en œuvre.
Les autres appareils, plus généralistes, sont des instruments de
paillasse, qui peuvent recevoir différents types de réactifs et
permettent des développements spécifiques pour le contrôle
microbiologique des produits ou des eaux.
2.3.2 Applications
Pour une étude détaillée des applications réalisées dans
l’industrie pharmaceutique nous conseillons au lecteur de se
reporter aux travaux [2] [3] de la commission de la Société
française des sciences et techniques pharmaceutiques à Paris.
Nous pouvons citer :
● Pour l’impédancemétrie

Cette technique permet, dans le meilleur des cas, de détecter un
micro-organisme par membrane (volume filtré).
2.3.1.4 Bioluminescence
■ Méthode de détection
L’émission lumineuse issue de la réaction de bioluminescence
est détectée grâce à un luminomètre, constitué de différents
éléments intégrés dans un appareil unique.
● Zone d’accueil du milieu réactionnel : il s’agit d’un tube de
réaction unitaire ou disposé sur un passeur d’échantillon, d’une
microplaque ou d’un système intégrant le prélèvement et la cuve
réactionnelle (écouvillons spéciaux utilisés en contrôle d’hygiène
des surfaces).
● Système d’injection : il n’est pas nécessaire dans les réactions
à cinétique lente (contrôles d’hygiène). Pour les systèmes ultra-
sensibles, il est constitué de un à quatre injecteurs destinés à
distribuer les réactifs dans la chambre de mesure. Les volumes
d’injection peuvent être fixes ou variables.
● Système de détection : la lumière émise est reçue et amplifiée
par un photomultiplicateur ou une photodiode. La mesure est
effectuée par intégration des photons émis dans un temps fixe ou
réglable selon les dispositifs. Dans certains cas, une détection
unique du pic d’émission peut être réalisée mais elle accentue le
risque d’interférences par saturation.
● Obtention et présentation des résultats : le signal électrique
obtenu par le photomultiplicateur ou la photodiode est numérisé et
restitué par le module informatique du système en nombre d’URL
(unités relatives de lumière). Une autre approche est utilisée dans
— l’essai de stérilité,
— le titrage microbiologique des antibiotiques,
— le test d’efficacité des conservateurs,
— le test d’efficacité d’antiseptiques et désinfectants,
— le contrôle de la contamination microbienne dans des produits
non obligatoirement stériles et recherche des micro-organismes
spécifiés,
— l’analyse des eaux,
— le contrôle des fermentations ;
● Pour la cytométrie de flux
— le contrôle « in process » d’une boucle d’eau purifiée,
— le contrôle de la contamination microbienne dans des pro-
duits non obligatoirement stériles et recherche des micro-organis-
mes spécifiés (suspension buvable) ;
● Pour la cytométrie à balayage laser
— le contrôle « in process » d’une boucle d’eau purifiée,
— le contrôle de la contamination microbienne dans des pro-
duits non obligatoirement stériles et recherche des micro-organis-
mes spécifiés ;
● Pour la bioluminescence
— les contrôles d’hygiène,
— le contrôle de la contamination microbienne dans des produits
non obligatoirement stériles et recherche des micro-organismes
spécifiés (suspension buvable).
Toutes ces applications ont nécessité d’importants travaux de
validation au sein des unités de recherche et développement d’où
la nécessité de faire son choix de techniques et d’appareils en
fonction de la capacité du fournisseur à contribuer aux dévelop-
pements des applications concernées.

Références bibliographiques

[1] CUQ (J.-L.). – Les méthodes modernes d’ana-
lyse rapide en microbiologie alimentaire.
Agro-Alimentaire Information – (9), CDIUPA
(1993).
[2] PETAT (E.) et col. – Les méthodes alternatives
de contrôle microbiologique. Présentation
des principales techniques rapides. Rapport
d’une commission SFSTP. STP Pharma
Pratiques – (6 : 281-301) (1996).
[3] PETAT (E.) et col. – Les méthodes alternatives
de contrôle microbiologique II. Présentation
des travaux réalisés. Rapport d’une commis-
sion SFSTP. STP Pharma Pratiques – (9 : 5-44)
(1999).

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