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Facult de Mdecine et de Pharmacie de Rabat Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie Pr.

YAHYA CHERRAH

TRAVAUX PRATIQUES
TOXICOLOGIE I
2me ANNEE DE PHARMACIE

ANNEE : 2011-2012

Pr. Y. CHERRAH Pr. A. ZELLOU Pr. S. SERRAGUI Pr. Y. BOUSLIMAN Pr. R. EL JAOUDI Pr. M. AIT EL CADI

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RECOMMANDATIONS AUX TUDIANTS

. Il est impratif de respecter la rpartition des groupes de TP . Le port de la blouse blanche est obligatoire pendant les sances.
. Chaque tudiant avant de quitter la salle doit nettoyer sa Paillasse ainsi que le matriel utilis.
- Les comptes rendus doivent tre rdigs par binme.

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SOMMAIRE

SCRENNING TOXICOLOGIE DURGENCE4 RECHERCHE DES BENZODIAZEPINES.......10 DOSAGE DES SALICYLES..... 13 DOSAGE DU PARACETEAMOL SERIQUE PAR HPLC...16 RECHERCHE TOXICOLOGIQUE DES ANTICOAGULANTS....21 DOSAGE DES BARBITURIQUES...24 DOSAGE DES PHENOTHIAZINES .. 27

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SCREENING EN TOXICOLOGIE DURGENCE Introduction : La toxicologie durgence est base sur la notion dexploration dun trs vaste domaine de substances chimiques. Les mthodes colorimtriques et

spectrophotomtriques sont des mthodes de dpistage au champ dapplication limit, dont lintrt est dapporter rapidement une orientation sur lorigine de lintoxication. Elles se placent dans un contexte durgence et ne ncessitent pas dinvestissement spcifique en matriel ou en ractifs. Ce sont des techniques adaptables toutes structures. Principe : Le principe se base sur lextraction des toxiques dans diffrentes matrices suivi de leur identification Extraction : Il s'agit d'utiliser les proprits basiques et acides des espces chimiques extraire. Ces espces doivent pouvoir se prsenter sous forme de sels (en milieu acide) et donc tre solubles dans les solvants polaires, et sous forme basique (free base) et donc tre solubles dans les solvants apolaires. Identifications : Aprs vaporation du solvant de lextraction, on procde une batterie de tests pour identifier les toxiques suspects. Pour lextrait acide, on procde la recherche des salicyls par raction de TRINDER, et des
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barbituriques par raction de PARRI et pour lextrait basique on recherche les Imipramines par ractif de FORREST et les Phnothiazines par ractif FPN. Matriel : A) Ampoules dcanter Verres pied de 100ml Bchers de 100 ml Erlenmeyers Tubes essais Porte tubes essais Porte ampoule dcanter pipettes Entonnoirs Extraction :

a- Extraction acide : Dans une ampoule dcanter de 250 ml on introduit : Urine: 5 ml Dichloromthane : 15 ml HCl (d=1.18): Quelques gouttes

Agiter nergiquement pendant 2 min. Laisser dcanter et liminer de la phase aqueuse. Rcuprer la phase organique dans un erlenmeyer en filtrant sur un filtre

contenant du sulfate de sodium anhydre.

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Rpartir la solution filtre en 2 bchers, vaporer au bain marie le dichloromthane. Effectuer les recherches sur les rsidus dvaporation.

b- Extraction basique : Dans une ampoule dcanter on introduit : - Urine: 5 ml - Na OH 40 %: 1 ml - Dichloromethane: 15 ml Agiter nergiquement pendant 2 min, laisser dcanter et liminer la phase aqueuse. Filtrer la phase organique laide du Sulfate de Na anhydre dans un erlenmeyer. Rpartir la solution en 2 bchers, vaporer lextrait organique. Effectuer les recherches sur les rsidus dvaporation. B- Identification des toxiques acides Sur les bchers obtenus partir de lextraction acide, effectuer les recherches suivantes : 1- Identification des Salicyls par la raction de TRINDER Principe : En prsence de sels ferriques, lion salicylique forme un complexe chlat de coloration violette. Ractif de Trinder (ractif I): Chlorure mercurique .40g
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Eau distille.850 ml Chauffer pour dissoudre. Aprs refroidissements, ajouter :

Nitrate ferrique (NO3) 3Fe, 9H2O40g HCI N ..120 ml

Mode opratoire : Reprendre le rsidu sec par 2 ml de mthanol, puis ajouter quelques gouttes du ractif de Trinder. Si l'addition de ce ractif se traduit par une coloration violette, on en conclut la prsence des salicyls. 2Principe : En prsence de ractif de Parri les barbituriques donnent une coloration violette stable. Ractifs : Ether thylique. Acide chlorhydrique (d=1,18). Sulfate de sodium anhydre. Alcool absolu. Solution alcoolique de nitrate de cobalt 3%. Solution alcoolique de dithylamine 3%. Identification des Barbituriques par la raction de PARRI

Mode opratoire : Reprendre le rsidu sec par 1 ml d'thanol, ajouter 1 ml de solution alcoolique de nitrate de cobalt 3% et 1 ml de la solution de dithylamine 3%. La prsence de barbituriques se traduit par une coloration violette et stable.
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D- Identification des toxiques basiques Sur les bchers obtenus partir de lextraction basique, effectuer les recherches suivantes : 1- Identification des imipramines par la raction de Forrest Principe : En prsence de ractif de Forrest, les imipramines donnent en 20 secondes une coloration bleu verte plus au moins intense. Ractif : - Solution aqueuse d'acide sulfurique (d = 1,83) 30% en volumes 50 ml - Solution aqueuse d'acide nitrique (d=1,38) 50%en volume - Solution aqueuse de bichromate de potassium 0,2g/100ml 50 ml 50 ml

-Solution aqueuse dacide perchlorique (d=1,67 20%en volume 50 ml Mode opratoire : Sur le premier bcher en reprend le rsidu sec par 2 ml de mthanol puis en additionne 4 ml de ractif Forrest. Lapparition en 20 secondes d'une coloration bleu vert plus au moins intense traduit la prsence des imipramines.

2- Identification des Phnothiazines par la raction de FPN Principe : En prsence de ractif de FPN, les drivs phnothiaziniques donnent un compos se traduisant par une coloration rouge en moins de dix secondes. Ractif : FPN

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- Solution aqueuse d'acide nitrique (d = 1,38) 50% en volumes - Solution aqueuse d'acide perchlorique (d=1,67) 20%en volume - Solution aqueuse de chlorure ferrique 5 g/100ml

50 ml 45 ml 5 ml

Mode opratoire Sur le deuxime bcher, reprendre le rsidu sec par 2 ml de mthanol, ajout 2 ml de ractif de FPN. La prsence des phnothiazines est rvle par lapparition dune coloration rouge.

3- INTERPRETER LES RESULTATS

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RECHERCHE DES BENZODIAZEPINES


I- Recherche des benzodiazpines par coloration Les benzodiazpines constituent une famille de

mdicaments caractriss par la prsence des degrs diffrents des proprits anxiolytique, hypnotiques, anti convulsivantes et myorelaxantes. Ce sont des mdicaments trs prescrits du part le monde ce qui augmente la frquence des intoxications par ces molcules.

1 -Principe : Aprs hydrolyse acide partir d'urines, les benzodiazpines forment avec le ractif de Trfoul un anneau de coloration violette. 2-Ractifs : - Acide chlorhydrique 6N. - Nitrite de sodium. - Sulfamates d'ammonium. - Ractif de Trfoul (Sol.aqueuse de chlorhydrate de N-alpha- Naphtyl N, N diethylpropylne 0,1%) 3-Matriel : - Tubes essais - Porte tubes essais - Pipettes
-

Eprouvettes de 10ml

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4- Technique : Mettre dans trois tubes essai 1ml d'urine et 1 ml d'acide chlorhydrique 6N. Introduire les deux derniers au bain marie bouillant pendant 10 minutes. Refroidir ces derniers sous un courant d'eau froid puis ajouter dans chaque tube 0,5 ml de sulfamates d'ammonium et 0,5 ml du ractif de Trfoul. La prsence des benzodiazpines se traduit par l'apparition d'un spot violet. II- Dosage des benzodiazpines Par spectrophotomtrie: 1-Principe : Les benzodiazpines sont extraites partir du sang en milieu acide PH=6,7 par l'ther. Le dosage consiste rechercher le maximum d'absorption. 2- Ractifs: - Ether. - Solution tampon pH =6,7. - Soude 0,1N. - Acide chlorhydrique 2N. 3-Matriel: - Tubes essais - Porte Tubes essais - Ampoule dcantation - Verre pied - Micropipettes de 1 ml - Pipettes

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4-Technique : Mlanger dans un tube hmolyse: - 6,5 ml d'ther. - 1 ml de la solution tampon pH =6,7. - 0,5 ml d'eau distille. - 1 ml du sang Agiter au vortex pendant 3 secondes, centrifuger. Mettre le mlange dans une ampoule dcantation, rcuprer la phrase thre puis rincer cette phase avec: 1er avec 3 ml de Na OH 0,1N 2me avec 2 ml d'eau distille. Faire un spectre d'absorption dans L'UV entre 200nm -400 nm contre HCI 2N.

5- Rsultats: - Tracer la courbe DO en fonction de la longueur donde - Chercher le maximum d'absorption. - Calculer le coefficient d'extinction molaire.

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DOSAGE DES SALICYLES


Lacide actyle salicylique (Aspirine ) est un analgsique, antipyrtique, antiinflammatoire et antiagrgants plaquettaire. Il occupe une place primordiale et il constitue le mdicament le plus consomm au monde.

1-Principe : Dosage colorimtrique de lion salicylique en prsence de sels ferriques donne la formation d'un complexe chelat pourpre. 2-Ractifs : Ractif de Trinder (ractif I): Chlorure mercurique .40g Eau distille.850 ml Chauffer pour dissoudre. Aprs refroidissements, ajouter : Nitrate ferrique (NO3 ) 3Fe, 9H2O40g HCI N 120 ml Ce ractif est stable indfiniment.

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Solution aqueuse talon de salicylate de sodium (ractif II): - Salicylate de sodium.580mg - Eau distille.250 ml - Chloroforme..1 ml La concentration de cette solution en acide salicylique est de 2g/l. Elle se conserve plusieurs mois 4C au rfrigrateur. 3-Matriel : - Porte tubes essais..1 - Porte ampoule dcanter 1 - Micropipette de 1 ml .. 1 - Entonnoirs .. 2 - Tubes essais 4- Mode opratoire : Etalonnage : La solution talon de salicylate de sodium est dilue au 1/5 dans l'eau distille (ractif III). La concentration en acide salicylique est alors de 400 mg/l. Prparer comme suit une gamme talon: Ractif III Eau distille Ractif I Concentration dacide salicylique (mg/l) 00 1 5 0 0.2 0.8 5 80 0.4 0.6 5 160 0.6 0.4 5 240 0.8 0.2 5 320 1 0 5 400

Agiter Attendre 5 min Lire les DO au spectrophotomtre 530 nm Dduire la courbe d'talonnage
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5- Rsultats: a) Expliquer comment on a trouv une concentration en ion salicylate de 2g/l en diluant 580 mg de salicylate de sodium dans 250 ml dH2O ? b) Dterminer la concentration en mg/l des salicyls de votre chantillon et interprter.

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DOSAGE DU PARACETAMOL SERIQUE PAR HPLC


1- Introduction : Le Paractamol (N-actyl actyl para aminophnol) est un Analgsique antipyrtique. Administr par voie orale. orale Il donne rapidement des taux plasmatiques levs. Les surdosages exposent une intoxication aigue grave essentiellement hpatique. Le pronostic de lintoxication ication repose sur le dosage de paractamolmie dans les heures qui suivent lingestion. 2- Principe : Le dosage du paractamol est fait par chromatographie liquide haute performance HPLC avec dtection dans lUV 254nm. Une courbe dtalonnage est ralise. La concentration dtermine est reporte sur le nomogramme de RumackRumack Matthew.

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3- Ractifs : - Solution talon du paractamol 1mg/ml dans leau distille - Mthanol (grade HPLC) - Eau pour HPLC

4- Matriel : - Tubes hmolyse - Micropipettes de 1ml rglable ..1 - Micropipette de 100 l ..1 - Agitateur type vortex.1 - Colonne HPLC C8..1 - Chaine HPLC avec un dtecteur UV 254nm...1 - Seringue de 100 l en verre .1

5- Mode opratoire : A partir de la solution talon du paractamol (1g/l), prparer une gamme dtalonnage dans des tubes hmolyse selon le tableau suivant :

Concentration g/ml Solution du paractamol (l) Eau distille (l) QSP 1ml

50 50 950

150 150 850

250 250 750

300 300 700

- Agiter au vortex pendant 1min

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A partir de chaque solution, prparer des dilutions selon le tableau suivant : Concentration de la Solution mre du paractamol (g/ml) Solution du paractamol (l) Eau distille (l) QSP 1ml 50 150 250 300 Echantillon

---

333 667

200 800

166 834

X --

- Agiter au vortex pendant 1min - Rincer la seringue avec du mthanol - Injecter les diffrents chantillons dans le chromatographe. Llution est faite par un mlange Mthanol/eau 80/20 (v/v) - Oprer de la mme manire pour lchantillon. - Tracer la courbe dtalonnage (air sous la courbe) AUC en fonction de la concentration et dduire la concentration du Paractamol dans votre chantillon X - Reporter la valeur trouve sur le nomogramme de Rumack-Matthew et interprter 6- Interprtation : Lutilisation du nomogramme de Rumack-Matthew permet de prdire la gravit de lintoxication, le pronostic de lintoxiqu et la conduite tenir. Le nomogramme de Rumack- Matthew est valide dans les conditions suivantes : - Ingestion dune dose unique - Heure de lingestion connue - Prlvement sanguin effectu au del de la 4me heure post ingestion
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- Mthode de dosage du paractamol spcifique.

Risque toxique en fonction de la paractamolmie Risque toxique Hpatite mortelle Hpatite fulminante Pas de risque 4me heure > 300mg/l > 200mg/l < 150 mg/l 15me heure > 45mg/l > 30mg/l < 25 mg/l

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RECHERCHE TOXICOLOGIQUE DES ANTICOAGULANTS


Les anticoagulants utiliss comme raticides sont susceptibles d'entrainer des intoxications chez les animaux domestiques et sauvages. Certains composs peuvent tre utiliss chez l'homme pour leurs proprits anticoagulantes. La recherche toxicologique de ces composs est longue et dlicate. Elle ncessite aprs extraction et purification, l'analyse soit par chromatographie en phase gazeuse, soit par spectrophotomtrie ultraviolette. Cependant lorsque les quantits recherches sont relativement importantes une mthode simple et rapide par chromatographie sur couches minces peut tre mise en uvre. Formules gnrales: a) Les coumariniques: Dicoumarol,Coumafne, Coumachlore

b) Les Indandiones : Chlorophacinone.

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1- Principe : Aprs extraction par le chloroforme, on effectue une sparation et une purification de l'extrait par chromatographie sur couche mince. L'identification de l'anticoagulant se fait par comparaison avec des solutions talons ayant subi la mme chromatographie. 3- Matriel : Plaques de verre recouvertes de silicagel Cuve de dveloppement Lampe ultraviolette Pipette (types Pasteur)

4- Ractifs: - Gel de silice HF. Au cours de cette sance de TP les plaques sont fournies recouvertes du silicagel (paisseur de la couche 0,2mm). Ether. Benzne. Chloroforme. Actone. Solutions talons d'anticoagulants soit dans le chloroforme soit dans la l'actone. - Coumaphne - Fassouk. - Coumachlore - Brodifacoum - Dicoumarol - 4- Hydoxycoumarin 3.(A .Acetonylbenzyl). - Chlorophacinone -Racumin

5- Technique: - Prparer l'luant en mlangeant : Ether: 60 ml. Benzene: 30 ml. Acetone: 20 ml. -Verser l'luant dans la cuve de dveloppement prpare pour travailler en atmosphre sature.
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-Attendre 15 minutes. -Mettre la plaque dans la cuve. -Laisser se dvelopper sur 12 cm environ. -Retirer la plaque, la mettre l'tuve 70C pendant 5 minutes. -Faire un examen direct sous lampe ultraviolette. Reprer les spots. - Dterminer les Rf et dduire la nature de votre chantillon.

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DOSAGE DES BARBITURIQUES


I- Introduction Les barbituriques appartiennent la catgorie des mdicaments psychotropes. Ils sont utiliss pour leurs effets sdatifs et anesthsiques. La formule gnrale est comme suit :

L'absorption Ultra-violette des solutions aqueuses des barbituriques est intimement lie leur pH, les formes non ionises n'absorbent que trs faiblement. A pH 10, l'absorption est maximale 238nm. Ceci est du l'ionisation de la premire fonction acide. A pH 13, on voit apparatre une deuxime bande d'absorption prsentant un maximum vers 260 nm et qui tmoigne de l'ionisation de la seconde fonction acide. I. Principe : La mthode de dosage prvoit une extraction en milieu acide par le dichloromthane ou le chloroforme, un passage en phase aqueuse alcaline par NaOH 0,45 N et une photomtrie diffrentielle avec lecture 260 nm.

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2-Ractifs: - Acide chlorhydrique concentr. Dichloromthane. Sulfate de sodium anhydre. Soude 0,45N. Tampon borate0,6 M H3BO337,2g KCI.4,2g Eau distille q.s.p 1000ml Solution mre de phnobarbital 2g/l

3- Mode opratoire A partir d'une solution mre de phnobarbital 2g/l, prparer une gamme talon comme suit: Tube N Solution PB 2g/ l (ml) Plasma (ml) Volume final (ml) Dichloromthane HCL concentr (gouttes) - Agiter pendant 3 minutes. - Filtrer sur un papier filtre contenant 1g de sulfate de sodium anhydre. - Dans une ampoule dcanter, mettre 15ml du filtrat. - Ajouter 3 ml de soude 0,45N. - Agiter pendant 3 minutes. - Centrifuger la phase sodique (Phase suprieure). 1 0.1 2 .4 2.5 25 3 2 0.15 2.35 2.5 25 3 3 0.2 2.3 2.5 25 3 X 2.5 25 3

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- Pour chaque concentration, prparer les solutions suivant le protocole ci dessous: pH10.1ml de L'extrait 1 ml de tampon borate pH13.1ml de L'extrait 1ml de soude 0,45N

Faire la lecture 260nm pH10 (blanc:1,5ml NaOH 0,45N+ 1,5 ml Tampon borate) et pH 13 (blanc : soude 0,45N) Faire la diffrence des DO. Tracer la droite d'talonnage. Dterminer la concentration inconnue de l'chantillon.

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DOSAGE DES PHETHIAZINES


INTRODUCTION La trs grande utilisation des drivs phnothiaziniques et leur grande diffusion en thrapeutique ambulatoire font que ces mdicaments sont frquemment absorbs des fins suicidaires ou accidentellement. De plus l'association frquente des mdicaments psychotropes conduit un grand nombre d'intoxications mixtes, ce qui justifie leur recherche en toxicologie d'urgence. 1- Principe : Les phnothiazines en prsence du quinhydrone et en milieu acide forment un complexe color en rouge et dos par spectrophotomtrie 527nm. 2- Ractifs : - Solution de chlorpromazine (Largactil ) 25mg/5ml - Dichlormthane - Solution de quinhydrone 10 -3M dans le dichloromthane (1) - Solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 40 grammes pour 100ml - Acide ortho-phosphorique (d = 1,71)

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3- Mode opratoire : Applicable aux urines et au liquide gastrique Extraction : Dans des ampoules dcantation placer respectivement comme suit: Ampoules B 1 2 3 Urines 15 15 15 NaOH 1 1 1 1 Dichloromthane Phnothiazine 15 15 30 15 60 15 90

Agiter nergiquement durant dix minutes. Aprs dcantation, centrifuger grande vitesse la phase organique. Eliminer par aspiration la totalit de la couche aqueuse surnageant. Il est inutile de laver l'extractum organique et de dshydrater par agitation avec du sulfate de sodium anhydre . *Traiter la solution inconnue de la mme manire que les solutions standards.

Raction : Dans l'ampoule dcantation placer : - Extractum organique .10ml - Solution 10-3M de quinhydrone 1ml - Acide ortho-phosphorique (d=1,71)..4ml Agiter nergiquement avec prcaution au dbut en raison de la grande volatilit du dichloromthane durant une minute.

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Aprs dcantation, la plus grande partie de la phase organique suprieure est limine. Le liquide restant est centrifug. Aprs limination par aspiration du solvant surnageant, la phase aqueuse acide colore est soumise l'analyse spectrophotomtrique aprs dilution ventuelle par un volume connu d'acide Phosphorique pur de la phase acide si celle-ci trop intensment colore . Lire l'absorbance 527 nm de tous les tubes

4- Rsultats : Tracer la courbe d'talonnage Dduire la concentration des phnothiazines dans l'chantillon.

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