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pour obtenir le litre de DOCTEUR
de I’lNSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON

Speciality
Chimie Analytique 6 rr)c

COUPLAGE CHROMATOGRAPHIE LIQUTOE -

SPECTROMETRIE DE MASSE PAR L’INTERMEDIAIRE
D’UNE INTERFACE ELECTROSPRAY.
MICROCHROMATOGRAPHDE LIQUIDE

Soutenue le 6 decembre 1996 devant le jury compose de:

M. C. DUCAUZE Professeur a lTnstitut National Agronomique President

M. P.ARPINO Directeur de recherche au CNRS Directeur de these
Institut National Agronomique
M. J.EINHORN Directeur de recherche Rapporteur
INRA de Versailles
M. R.STOCKLIN Docteur Rapporteur
Laboratoire Athens, Geneve
M. A.BRUCHET Directeur de recherche Examinateur
Lyonnaise des Eaux
M. H.VIRELIZIER Chef du groupe L.A.M.O.G.
Centre d’Etudes Nucleaires de Saclay
 THESE

presentee par

Cecile GILLARD FACTOR

pour obtenir le titre de DOCTEUR

de l’lNSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON

Speciality
Chimie Analytique

COUPLAGE CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE -

SPECTROMETRIE DE MASSE PAR L’INTERMEDIAIRE
D UNE INTERFACE ELECTROSPRAY.
MICROCHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

Soutenue le 6 decembre 1996 devant le jury compose de :

M. C. DUCAUZE Professeur a l’lnstitut National Agronomique President

M. P.ARPINO Directeur de recherche au CNRS Directeur de these
Institut National Agronomique
M. J.EINHORN Directeur de recherche Rapporteur
INRA de Versailles
M. R.STOCKLIN Docteur Rapporteur
Laboratoire Athens, Geneve
M. A.BRUCHET Directeur de recherche Examinateur
Lyonnaise des Eaux
M. H.VERELIZIER Chef du groupe L.A.M.O.G. Examinateur
Centre d’Etudes Nucleaires de Saclay
 DISCLAIMER

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Ce travail cofinance par la Lyonnaise des Eaux-Dumez, a ete effectue au Centre d’Etudes
Nucleaires de Saclay dans le Departement des procedes d’Enrichissement dirige par
Monsieur Y. Lapierre, dans le Service de Monsieur M. Cavedon et la Section de Monsieur E.
Eliot. Je les remercie de leur accueil et pour m ’avoir permis de realiser cette these dans
d’excellentes conditions.

Monsieur P. Arpino, de I’Institut National Agronomique, a suivi tous les developpements de

ce travail. Je tiens a lui exprimer toute ma reconnaissance pour I’interet qu ’il a porte a mon
travail pendant ces trois annees.

J’exprime ma profonde gratitude a Monsieur H. Virelizier pour son accueil dans le

Laboratoire des Molecules Organiques et des Gaz, ainsi que pour son aide, sa disponibilite et
son devouement constants tout au long de ce travail.

Je remercie Monsieur A. Bruchet, Directeur de recherche a la Lyonnaise des Eaux-Dumez,

pour le suivi de I’avancement des recherches et I’interet qu’il a porte a ce travail. Que les
autres membres de son laboratoire soient egalement remercies pour leur gentillesse.

Je tiens a remercier Messieurs C. Ducauze, Professeur a I’Institut National Agronomique J.

Einhom, Directeur de recherche a I'Inra de Versailles et R. Stocklin de la societe Atheris. Ils
m ’ontfait Vhonneur d’accepter de juger ce memoire en tant que president et rapporteurs.

Je temoigne id toute ma sympathie a tous mes collegues de laboratoire : Denis, Valerie,

Sebastien, Suzy, Christel, Franqoise, Marie-Therese, Sylvie, Daniel et Gerard, ainsi qu’a
Michel pour sa precieuse aide en informatique. Enfin, je tiens a remercier les personnes du
batiment 391 pour leur gentillesse et accueil tres sympathique qu ’ils m ’ont reserve.

A mon mari et a mafamille

 RESUME

L’objectif de ce travail a consiste en la realisation d’un couplage chromatographie

liquide-spectrometrie de masse par Vintermediate d’une interface electrospray et revaluation
des performances de cet outil analytique pour fetude de polluants dans 1’eau, et plus
particulierement des pesticides dont la concentration maximale admissible dans une eau potable
est de 0,1 gg/1.
Les debits liquides acceptes par rinterface etant de quelques pl/min en rabsence
d’assistance pneumatique, les separations chromatographiques ont ete effectuees a l’aide d’une
microcolonne de 300 pm de diametre interieur. Les difficultes inherentes a la
microchromatographie liquide (limitation des volumes mort, gradient d’elution a quelques
pl/min) ont ete resolues avec un detecteur UV equipe d’une cellule en Z specifique a la
microchromatographie. Les differents parametres de la source d’ionisation (debit liquide, flux
d’azote chauffe, difference de potentiel dans la region a pression reduite entre l’extremite du
capillaire de transfert et le premier ecorceur,...) ont ete optimises par introduction directe a
l’aide d’un pousse-seringue a partir de solutions etalons. Pour un volume d’injection de 60 nl,
les limites de detection pour un grand nombre de pesticides sont voisines de 0,1 mg/1 par
pLC/ESI/MS. Une preconcentration des solutes en tete de colonne, pendant la duree de
1’injection, a permis d’atteindre les limites de concentrations maximales admissibles des s-
triazines dans une eau potable. Pour un pesticide plus polaire comme l’aminotriazole, les
limites de detection sont de quelques gg/1. Avec ces conditions operatoires, nous avons pu
mettre en evidence, directement dans une eau de riviere, la presence de s-triazines (la simazine
et l’atrazine) a partir des ions parents et du motif isotopique de ces composes, et estimer leurs
concentrations.
Apres avoir montre l’interet de cette technique pour l’analyse de pesticides dans l’eau
(dont les masses moleculaires sont inferieures a 400 Da), nous nous sommes interesses a
evaluer l’utilite de notre systeme pour la detection de composes de hautes masses moleculaires
susceptibles d’etre presents egalement dans les eaux. Les venins de serpents, qui represented
une source inestimable de proteines, ont ete choisis comme modele pour cette deuxieme etude.
En raison des risques de bouchage des microcolonnes, les separations ont ete realisees a l’aide
d’une colonne de petit calibre (de 1 mm de diametre interieur). La source etant equipee d’une
assistance a la nebulisation (de type pneumatique), la colonne de separation a ete directement
couplee au spectrometre de masse, sans division de V effluent chromatographique. Un certain
nombre de proteines de masses moleculaires comprises entre 6 et 8 kDa ont ete identifies et
attribuees a des toxines connues, avec un ecart maximal entre les masses moleculaires
mesurees et les masses moleculaires calculees de 1,6 Da.
En conclusion, cette etude a permis de mettre en evidence l’interet du mode
d’ionisation par electronebulisation dans un couplage LC/MS pour retude de polluants dans
l’eau, en particulier pour l’identification et la quantification de pesticides a l’etat de traces, sans
traitement de l’echantillon. Enfin, il a ete demontre l’utilite de cet outil analytique pour la
detection de molecules de masses moleculaires elevees.
 PLAN GENERAL

INTRODUCTION GENERATE 1

ETUDE THEORIQUE ET BIBLIOGRAPHIQUE 5

CHAPITRE 1 : COUPLAGE CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE - S PE CTROMETRIE

DE MASSE 6

A : GENERALITES SUR LES INTERFACES POUR COUPLAGE LC/MS 7

1 - Definition du probleme 7
2 - Developpement des interfaces 8
2. a - Les separateurs de solvants 10
2.b - Les couplages directs 11

B : L'lNTERFACE ELECTROSPRAY 20
1 - Presentation de l'interface electrospray 20
2 - Description du processus d'ionisation 22
2.a - La formation de gouttelettes chargees 22
2.b - Le transfer! des ions de la phase liquide vers la phase gazeuse 30
2.c - Schema general du processus d'ionisation 38
3 - Les interets de ce mode d'ionisation 41
4 - Les spectres de masse de molecules de hautes masses moleculaires 45
5 - Les sources d’ionisation par electronebulisation 51

CHAPITRE 2 : MICROCOLONNES ET COLONNES DE PETIT CALIBRE EN

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE 54

A : PRESENTATION DES MICROCOLONNES ET DES COLONNES DE PETIT

CALIBRE 55

B : INTERETS DE LA MICROCHROMATOGRAPHIE LIQUIDE 57

1 - Dilution du solute dans la colonne et limite de detection 57
2 - Performances des colonnes 59
2.a - Influence du diametre interieur de la colonne sur son efficacite 63
2.b - Obtention de tres grandes efficacites 65

C : SPECIFICATIONS INSTRUMENTALES 72
1 - Injection 76
2 - Systeme de pompage 83
 2.a - Elution isocratique 83
2.b - Elution par gradient de solvant 84
3 - Detection 89
4 - Couplage LC/ESI/MS 96

CHAPITRE 3 : OBJECTIF DE NOTRE ETUDE 98

1 - Traitement de l’eau - Controle de la qualite de l’eau destinee a la distribution 99

2 - Pesticides et reglementations 101
3 - Problematique posee 113

ETUDE EXPERIMENTALE 115

CHAPITRE 4 : APPLICATION AUX PEHTES MOLECULES - ETUDE DE

PESTICIDES PRIORITAIRES 116

A : INTRODUCTION DIRECTE 117

1 - Appareillage - Description de la source d’ionisation 117
2- Resultats et Discussion 119
2. a - Influence du debit liquide 119
2.b - Influence du debit d’azote chauffe 123
2.c - Influence de la composition de la phase mobile 125
2 d - Etude des fragmentations induites par collision (CID) 127
2.e - Courbe d’etalonnage et sensibilite 141
CONCLUSION 155

B : COUPLAGE 156
1 - Description du montage 156
2 - Resultats et Discussion 159
2.a - Mise au point de la methode d’analyse 159
2.b - Application a des echantillons reels 191
CONCLUSION 208

CHAPITRE 5 : APPLICATION AUX MOLECULES DE HAUTES MASSES

MOLECULAIRES - ETUDE DE VENINS DE SERPENTS 210

A : DEFINITION DU PROBLEME POSE 211

B : RESULTATS EXPERIMENTAUX 216

1 - Etude en introduction directe 218
2 - Analyse de venins de serpents 223
3 - Ameliorations envisagees 232
CONCLUSION GENERALE ET PERPECTTVES 235

LISTE DES SYMBOLES 241

ANNEXE EXPERIMENTALE 244

ANNEXE 1: Formulas developpees des pesticides 250

ANNEXE 2 : Toxicite des pesticides 254

ANNEXE 3 : La source APCI 258

ANNEXE 4 : Formulas chromatographiques utilisees 262

ANNEXE 5 : Parametres d’acquisition des figures 4.22 et 4.23 263

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 264

INTRODUCTION GENERATE

1
 INTRODUCTION GENERALE

Les succes remarquables remportes par la chromatographic gazeuse (GC) dans la

separation des melanges complexes sont bien connus. Pourtant, on estime que 20 % seulement
des substances organiques connues sont justiciables de la GC sans modification chimique
prealable de l’echantillon.
La GC presente des limitations dans trois cas :
- substances peu volatiles, ce qui est le cas souvent de celles dont la masse moleculaire est
superieure a 300 Da environ.
- substances sensibles a une elevation, meme moderee, de la temperature (ce qui est le cas de
nombreux composes d’interet biologique).
- substances ionisees (car elles sont en general tres peu volatiles).
Au contraire, la chromatographic liquide (LC) n’est limitee ni par la volatility de
l’echantillon ni par sa stability thermique. De plus, elle est souvent plus efficace que la GC dans
le cas de separations difficiles pour trois raisons :
1) H n’y a en GC que des interactions du solute avec la phase stationnaire alors qu’en LC il
existe des interactions du solute avec la phase stationnaire et avec la phase mobile.
2) Les phases stationnaires de la LC sont beaucoup plus varices qu’en GC.
3) La temperature moins elevee en LC favorise les interactions moleculaires [1].

Le couplage chromatographic liquide-spectrometrie de masse (LC/MS) constitue un

outil analytique puissant d’identification et de detection. Le spectrometre de masse est un
detecteur sensible, universe! et autorise une identification des composes inconnus, meme dans
le cas d’une mauvaise resolution chromatographique. Cependant, deux caracteristiques de la
LC rendent ce couplage difficile. Tout d’abord le domaine de predilection de la LC est
1’analyse de composes thermosensibles ou peu volatils. Or les methodes d’ionisation
conventionnelles de la spectrometrie de masse necessitent que l’echantillon soit vaporise sous
un vide pousse, d’ou un risque de decomposition du compose. Le probleme est complique par
1’introduction dans la chambre du spectrometre d’une quantity de phase mobile beaucoup plus
grande que celle pouvant etre raisonnablement acceptee, notamment par un systeme de
pompage classique.

2
 Nous pouvons resumer ci-dessous les qualites d’une "bonne" interface pour realiser le
couplage LC/MS :
- transmettre integralement et quantitativement les constituants a analyser,
- ne pas degrader les molecules par un temps de residence excessif ou par chauffage,
- eliminer la phase mobile ou au moins l’enrichir en solute,
- ne pas alterer la separation chromatographique,
- ne pas modifier la structure chimique des solutes,
- ne pas adsorber sur les parols les quantites faibles de produits.
De nombreuses interfaces ont ete developpees depuis un vingtaine d’annees, parmi lesquelles
rinterface a ruban mobile, l’interface thermospray, (’interface APCI, f interface particle beam
et 1'interface electrospray. Nous reviendrons plus en details sur chacune de ces interfaces dans
le chapitre 1.

Par son mode d’ionisation doux, 1'interface electrospray (ou interface a ionisation par
electronebulisation) a ete choisie pour realiser le couplage LC/MS dans le cadre de cette these.
L’ionisation des produits dans la gamme de masse moleculaire 100 a 1500 Da conduit a la
formation d’especes mono- ou di-chargees alors que l’ionisation des produits de masses
moleculaires plus import antes conduit a la formation d’ions multicharges (par addition de
protons ou d’especes alcalines, selon la composition de la solution analysee).
Les debits liquides compatibles avec cette interface sont de quelques pl/min. Pour
satisfaire a cette condition operatoire, une division de 1’effluent chromatographique en sortie
de colonne est indispensable, a moins de realiser les separations avec des microcolonnes
(tableau 1 ).

Type de colonne diametre interieur D (gl/min)

classique 4,6 mm 500-2000

petit calibre 1 mm 10-50
microcolonne 50-500 pm 0,5-10

Tableau 1 : Debit de phase mobile selon le diametre interieur de la colonne.

Le spectrometre de masse etant connu pour etre un detecteur de masse, il semble

preferable d’injecter la totalite de 1’effluent chromatographique dans la chambre d’ionisation

3
afin d'obtenir un maximum de sensibilite. De plus, la microchromatographie liquide presente un
interet par rapport a la chromatographie liquide classique dans les cas suivants :
- analyse d’un echantillon de volume limite (< 1 pi),
- separation de melanges complexes necessitant un grand nombre de plateaux theoriques (>
50000),
- economic de phase mobile, ce qui permet la mise en oeuvre de separations avec des solvants
onereux.

Cependant, en microchromatographie, compte tenu des volumes tres faibles mis en jeu,
les effets dispersifs dus aux volumes exterieurs a la colonne (ou effets extra-colonne) prennent
tres vite une importance critique. Un materiel specifique a la microchromatographie a done ete
developpe, et nous etudierons les aspects technologiques en ce qui conceme {’injection et la
detection. Nous decrirons egalement les systemes de pompage et plus particulierement la
realisation de gradient d’elution a des debits de quelques gl/min.

L’objectif de notre travail experimental est d'optimiser le couplage chromatographie

liquide-spectrometrie de masse avec une interface electrospray afin de preciser ses
performances dans le cadre de 1’analyse de polluants dans I’eau. II est a signaler que la
concentration des pesticides dans une eau potable ne doit pas depasser 0,1 pg/1 (par substance
individualisee). Le but principal de notre etude consiste a mettre au point une methode
d’analyse sensible et rapide pour un certain nombre de pesticides "prioritaires" de famille
chimique et de polarite differentes. Le critere de rapidite s’avere particulierement interessant en
cas de pollution accidentelle afin d’etablir rapidement un premier diagnostic.
Une grande partie de notre travail conceme l’analyse de pesticides dans l’eau, ayant des
masses moleculaires inferieures a 400 Da. Cependant, une eau naturelle contient non seulement
des pesticides, mais aussi beaucoup d’autres composes dissouts inorganiques et organiques
d’origine naturelle ou synthetique, certains etant caracterises par des masses moleculaires tres
elevees (par exemple les proteines et les substances humiques).
Cette constatation nous a conduit dans un deuxieme temps a evaluer les performances
de notre outil analytique pour 1’identification de composes de hautes masses moleculaires.

4
ETUDE THEORIQUE ET BIBLIOGRAPHIQUE
 CHAPITRE 1

COUPLAGE CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

- SPECTROMETRIE DE MASSE

6
A : GENERALITES SUR LES INTERFACES POUR COUPLAGE LC/MS

1 - DEFINITION DU PROBLEME

La difficult^ du couplage de la chromatographic liquide a un spectrometre de masse

provient en partie de la nature meme des composes a analyser. En efFet, la chromatographic
liquide est generalement utilisee pour V analyse des substances peu volatiles et/ou
thermolabiles, se pretant mal a la chromatographie gazeuse, sauf dans certains cas ou une
derivation de certaines des fonctions chimiques presentes dans leur structure est possible. Et, il
est a rappeler qu’en spectrometrie de masse, l’ionisation de la substance etudiee est le plus
souvent precedee d’une etape de volatilisation.
Le probleme est de plus complique par l’incompatibilite entre les debits liquides utilises
dans la plupart des separations chromatographiques et le vide a maintenir dans l’analyseur.
Pour illustrer ce propos, considerons un debit liquide d’effluent de 1 ml/min. H libere apres
vaporisation un debit gazeux de 100 a 1000 ml/min, dependant du solvant utilise. Or, lors d’un
fonctionnement normal, le vide dans l’analyseur ne doit pas exceder une pression de 10'5 Torr.
Et les equipements de pompage acceptent, en general 1 a 10 ml/min de debit gazeux (valeur
dependant de la nature de la vapeur et de la qualite des pompes), soit 10 a 100 fois moins que
la quantite requise par la vaporisation de la totalite de la phase mobile eluee.
Enfin, la nature de la phase mobile peut poser des difficultes supplementaires lors d’un
couplage, en particulier si les solvants sent peu volatils ou si elle contient des additifs ou sels
non volatils.

Differentes methodes ont ete utilisees avec des succes varies pour surmonter ces
problemes. Certaines d’entre elles comme 1’interface a ruban mobile ou 1’interface particle
beam (PB) sont basees sur 1’elimination selective du solvant d’elution avant 1’introduction dans
la source d’ionisation du spectrometre. D’autres comme 1’interface a introduction directe de
liquide (DLI) necessitent une reduction du debit de liquide introduit dans Pinterface afin qu’il
soit compatible avec le systeme de pompage. Pour un certain nombre d’interfaces comme

7
I’interface thermospray (TS) et l’interface a decharge couronne a pression atmospheiique
(APCI), il est possible d’introduire sous certaines conditions la totalite de 1’effluent.

2 - DEVELOPPEMENT DES INTERFACES

Le schema ci-dessous presente differentes interfaces developpees pour le couplage

LC/MS I2'12]. Nous pouvons les classer en deux categories distinctes : Les separateurs de
solvants et les couplages directs. La figure 1.2 donne le domaine d’application des principales
methodes de couplage en fonction de la masse et la nature de la substance eluee.

Les separateurs de solvants Couplages directs

-separateurs a jet moleculaire
-separateurs a membrane
-interfaces a transport de solution
(interface a ruban mobile)

Nebulisation des solutions sous vide Nebulisation des solutions a pression

atmospheiique
-interfaces a introduction directe de liquide -nebulisation pneumatique
-nebuliseurs a tube capillaire -interface particle beam
-nebuliseurs 4 diaphragme -interface APCI
-nebuliseurs a metal fritte -nebulisation dans un champ electrique
-interface thermospray -interface electrospray

Figure 1.1 : Les differentes techniques de couplage LC/MS.

8
 IONIQUE

ELECTROSPRAY

MASSE MOLECULAIRE

Figure 1.2 : Estimation des domaines d’application des differentes methodes de couplage.
 2.a - Les separateurs de solvants

Dans le cas des separateurs de solvants, une premiere etape consiste a vaporiser et
eliminer de maniere selective le solvant, le solute est ensuite volatilise et introduit dans le
spectrometre de masse sans perte, ni degradation. L'interface a ruban mobile fut la premiere a
etre commercialisee. L'un des premiers montages est represente ci-dessous fl3,_ Son principe de
fonctionnement est le suivant. Apres depot de la solution sur un ruban mobile, le solvant est
evapore sous vide primaire par chaufFage. Les solutes sont ensuite desorbes du ruban et
introduits dans la source ou ils sont ionises par impact electronique (El) ou ionisation chimique
(Cl). Le ruban est ensuite nettoye afin de le debarrasser des restes d’echantillons et
d’impuretes non volatils. Cette demiere etape permet de reutiliser le ruban pour un nouveau
cycle d’introduction. Dans les versions ulterieures, le ruban penetre a rinter!eur de la source.

effluent
ruban

vers la
source
d’ions

1U|,FI([*
vers des pompes
a vide

Figure 1.3 : Schema de l'interface a ruban mobile developpee par Me Fadden et coll.[13].

L'utilisation d'un ruban (le plus souvent en polyimide car materiau inerte du point de vue
chimique et stable a haute temperature) de preference a un fil, s'explique par la possibility de
deposer un volume d’echantillon plus important sur l'interface, et done d'obtenir une meilleure
sensibilite. Ainsi, un ruban de 0,32 cm de largueur, se deplagant a la vitesse de 2-4 cm/s permet
un depot de l'effluent chromatographique jusqu’a des debits liquides de 0,85 ml/min (pour des
solvants tels que l'hexane ou le pentane).

10
Le fait de pouvoir ioniser selon les modes El, Cl avec choix du gaz reactif, en raison de
l'elimination prealable du solvant, constitue le grand avantage de cette methode. Ce montage
permet l'etude des substances moyennement volatiles et difiicilement analysables par GC/MS.

De nombreux parametres doivent cependant etre maltrises afin d'optimiser ce systeme. Le debit
de phase mobile qui peut etre totalement elimine depend de plusieurs facteurs dont la nature du
solvant, la vitesse de defilement et la nature du ruban, ainsi que la puissance de chauffage.
D’autre part, la vitesse de defilement du ruban doit etre suffisante pour eviter un remelange des
solutes separes par la chromatographic liquide. La conservation de l’efficacite de la separation
chromatographique depend aussi de la repartition de la solution sur le ruban. Des difficultes
apparaissent avec les solvants polaires et plus particulierement avec les phases mobiles
contenant un fort pourcentage d'eau, pour lesquelles est observe un profil des pics en dents de
scie. Pour ces cas, la nebulisation pneumatique ameliore le depot des solutions aqueuses sur le
ruban et le chauffage du gaz nebuliseur facilite ('elimination de l'eau. Enfin, pour chaque solute,
il existe une temperature optimale pour l'etape de vaporisation. La reference [2] reprend
l'ensemble de ces details techniques. II parait done difficile de trouver des conditions
operatoires uniques pour un fonctionnement de routine.
Une demiere difficulty rencontree avec cette interface conceme les effets memoire du ruban.
Malgre son nettoyage par chauffage, la surface du ruban peut ne pas etre totalement propre.
Pour y remedier, l’etape de nettoyage comprend en plus du chauffage a temperature eleve, un
lavage par solvant et/ou un raclage de sa surface.

2.b - Les couplages directs

Dans les couplages directs, 1'effiuent chromatographique (solute avec solvant) est
introduit directement dans la source a ions. Dans ce cas, le solvant peut participer aux
phenomenes d'ionisation du solute.

11
 - Avec une interface a introduction directe de liquide, seule une fraction de 1’effluent (1
a 5 %) penetre dans le spectrometre de masse par l'intermediaire d'un restricteur : capillaire en
silice fondue ou diaphragme.
Apres nebulisation de la solution, et evaporation des gouttelettes dans la chambre de
desolvatation, les solutes sont ionises dans la source du spectrometre de masse par ionisation
chimique, le solvant sous forme de vapeur jouant le role de gaz reactif. En consequence, la
seule information disponible est le rapport m/z de la molecule protonee. De plus, en raison de
la reduction du debit, cette methode s'accompagne d'un manque de sensibilite. Cependant, le
developpement de la microchromatographie liquide a permis d’ameliorer les performances de
cette interface. En effet, une diminution du diametre interieur de la colonne s'accompagne
d'une diminution du debit liquide. [/utilisation de colonnes de petit diametre (1 mm ou moins),
permet done d’introduire la totalite de l'effluent dans l'analyseur[14*171.
En raison de l'incompatibilite avec les debits de phase mobile des systemes classiques de
chromatographie (colonne de 4,6 mm) et des difficult.es instrumentales telles que les problemes
d'obturation du restricteur, 1’interface DLI a ete beaucoup moins utilisee que l'interface a jet
thermique (connue sous le nom d’interface thermospray) decrite ci-dessous.

- Dans une premiere approche, Vestal et coll, ont utilise un faisceau laser CO2 de

puissance SOW afin de vaporiser rapidement le solvant et le solute. L’appareillage etait conpu
dans le but de transporter et d’ioniser l'echantillon en limitant les contacts avec les surfaces
solides (pour eviter tout risque de pyrolyse) et comportait un important systeme de pompage
I18]. Get ensemble couteux et encombrant fut par la suite remplace par un systeme beaucoup
plus simple dans lequel le capillaire d’introduction est chauffe electriquement. Une pompe
mecanique placee face au capillaire permet de maintenir un vide correct dans le spectrometre.
Cette interface accepte des debits de phase aqueuse pouvant atteindre 2 ml/min1191 [201.

12
 tube de quadripole
bloc de cuivre
cuivre \ lentilles
capillaire

pompe
effluent mecaniqt

source d'ions
cartouche gouttelettes
chaufFante

Figure 1.4 : Schema d'une interface thermospray avec un nebuliseur thermique[20].

Un jet de vapeur et de fines gouttelettes est forme a la sortie du capillaire chauffe en son
extremite. La desolvatation complete est obtenue dans la chambre d’expansion du bloc source
sous les efifets conjugues du vide et de la temperature.
L'ionisation est essentiellement due a des reactions ion-molecule en phase gazeuse, grace a des
sels volatils (en general de l'acetate d'ammonium) presents dans la solution a une concentration
voisine de 0,1M et pouvant etre rajoutes en sortie de colonne afin de ne pas modifier la
separation chromatographique. On parle alors d’ionisation directe (ou de filament-off mode).
Dans certains cas (composes difficilement ionisables, solvants non miscibles avec l’eau ou
solvants polaires purs), l’efficacite d’ionisation est amelioree par l’utilisation d’un faisceau
d'electrons (filament-on mode) ou d’une decharge electrique (discharge mode).
Cette interface fonctionne avec des debits liquides de 1 a 2 ml/min. Elle est done bien adaptee
au couplage avec la chromatographie liquide conventionnelle. Du point de vue experimental,
les temperatures du vaporisateur et du bloc source sont des parametres tres importants a
optimiser et qui varient selon la nature des produits etudies (la table 1 de la reference [121
regroupe les conditions operatoires pour un certain nombre de composes).
Afin d'obtenir avec l'interface thermospray des renseignements autres que la masse moleculaire,
la possibility de fragmenter les ions pseudo-moleculaires a ete envisagee. L'elevation de la
temperature dans le bloc source s'accompagnant d'un risque de pyrolyse des composes
analyses, la temperature ne peut pas etre choisie comme parametre pour cette etude. Par

13
centre, certaines sources contiennent une electrode acceleratrice (ou repousseur) placee face
au cone d'echantillonnage. Une partie des ions du solute acceleres entre en collision avec des
molecules de gaz residuelles et se ffagmente. II est ainsi possible d’enregistrer un spectre de
masse qui presente a la fois l’ion pseudo-moleculaire et un ou plusieurs ions fragments.
Avant l'apparition des sources a pression atmospherique, r interface thermospray a connu un
essor considerable et a ete utilisee dans la majorite des couplages LC/MS jusqu’en 1992.
Validee pour de nombreux protocoles de dosage, elle reste encore utilisee aujourd’hui, mais se
trouve dans une phase de declin.

- L’interface particle beam est un dispositif congu pour separer le solvant des molecules
a analyser. L’effluent chromatographique, introduit au travers d’un capillaire a un debit voisin
de 0,5 ml/min, est nebulise a l’aide d’un flux concentrique d’helium. L’aerosol traverse alors
une chambre de desolvatation ayant les parois chauffees et ou regne une pression legerement
inferieure a la pression atmospherique. Cette demiere est reliee a un separateur a jet
moleculaire a double etage de pompage. A la sortie de la chambre de desolvatation, le melange
d’helium, de vapeur de solvant et de particules de solute subit une expansion supersonique
dans le premier etage de pompage. Les constituants les plus legers du melange (helium,
solvant) diffusent plus rapidement vers la peripherie du jet, et le coeur du jet s’enrichit done en
solute. L’elimination du solvant est obtenue en "ecremant" les couches peripheriques du jet au
moyen d’un ecorceur. Ce processus est repete dans le second etage de pompage. Ensuite, le
flux de particules enrich! penetre dans la source d’ionisation. Les solutes, vaporises par
collision des particules avec les parois de la source chauffee, sont ionises en mode El ou Cl.
Le principal interet de cette interface est de pouvoir choisir le mode d’ionisation, et dans le cas
d’etude de composes inconnus, de determiner leurs masses moleculaires ainsi que d’avoir des
informations concemant leurs structures.

La principale difficulty rencontree pour la realisation du couplage LC/MS avec des

debits conventionnels etait jusqu’alors liee a I’incapacity que presente un systeme de pompaige
classique a absorber la totalite des vapeurs de solvant resultant de 1’evaporation de V effluent
chromatographique.

14
 Avec les interfaces thermospray ou particle beam, cette difficulty est resolue du fait de
la nebulisation de la solution a pression reduite ou a pression atmospherique, respectivement; la
majorite du solvant est ensuite eliminee au moyen d’un ou plusieurs etages de pompage. Apres
1’etape d’elimination du solvant, les solutes sont ionises.
Une autre solution consiste, apres nebulisation de la solution, a ioniser les solutes a
pression atmospherique. Les ions formes sont ensuite transferes vers l’analyseur a Vaide d’une
serie de lentille. Nous allons dans la suite presenter ces interfaces.

- Dans une source a pression atmospherique, les solutes sont ionises selon deux
methodes:
- L’ionisation chimique. Le melange gazeux resultant de la vaporisation totale
de la solution est ionise par un faisceau d’electrons de 60 keV emis spontanement par
decomposition radioactive du 63Ni ou sous l’effet d’une decharge couronne.
- L’extraction d’ions preformes du liquide vers la phase gazeuse.
Quelque soit la methode d’ionisation mise en jeu, les ions generes a pression atmospherique
sont ensuite analyses sous vide (10‘5 a 10"6 Torr) par le spectrometre de masse. Pour atteindre
ces conditions, deux configurations sont envisageables. L’instrument API-MS peut etre equipe
d’un seul etage de pompage (figure 1.5a). Dans ce cas, le melange d’ions et de vapeur de
solvant penetre dans la region sous vide par l’intermediaire d’un orifice. Les ions sont ensuite
localises vers l’analyseur grace a un dispositif de lentilles ou un quadripole sur lequel est
applique la haute frequence, tandis que les molecules de solvant residuelles sont eliminees par
pompage. Selon les capacites de la pompe, le diametre de 1’orifice varie de 20 pm a 120 pm
selon que l’on utilise une pompe a diffusion (1000 1/s) ou une pompe cryogenique (100000 1/s).
Cependant, la majority des instruments API-MS sont equipes d’un systeme de pompage a
plusieurs etages. La figure 1.5b presente une source API couplee a un analyseur par
1’intermediate de trois etages de pompage. Apres avoir traverse 1’orifice d’echantillonnage (en
general un ecorceur, un tube en verre ou un tube metallique), le melange d’ions et de vapeur de
solvant se detend sous la forme d’un jet supersonique dans le premier etage (ou regne une
pression approximativement de 0,7 Torr). Les couches peripheriques du jet s’enrichissent en
constituants legers, c’est a dire en molecules de solvant. Elies sont "ecremees" au moyen d’un

15
ecorceur. Les ions penetrent dans le second etage de pompage (ou regne une pression
inferieure a 10"3 Torr) et sont focalises vers 1’entree de l’analyseur.

L’expansion du gaz dans le premier etage de pompage s’accompagne d’un refroidissement. Ce

refroidissement favorise la formation de "clusters" de type ion-solvant, notamment en presence
de solvants polaires, symbolises par X^(SI)n. Le chauffage de la source ou du tube metallique
(orifice d’echantillonnage) limite la formation de ces "clusters". La figure 1.6a presente une
autre solution a ce probleme. Une circulation d’azote sec a contre-courant a pression
atmospherique gene r entree de molecules de solvant dans le premier etage de pompage, tandis
que les ions migrent sous 1’effet du champ electrique vers 1’orifice d’echantillonnage en
presence d’azote sec (molecule non polaire). Ainsi, la formation de "clusters" pendant
1’expansion est diminuee. Une autre approche consiste a dissocier les "clusters" deja formes
(figure 1.6b). Sous l’effet d’un champ electrique applique entre les deux parois 1 et 2, les
"clusters" sont acceleres et entrent en collision avec des molecules de solvant residuelles.
L’energie de collision convertie en energie vibrationnelle facilite la dissociation des "clusters".
Cependant, ces collisions entrament parfois des fragmentations, surtout si la difference de
potentiel appliquee entre les deux parois est trop elevee. Les fragmentations, obtenues a partir
de conditions experimentales bien controlees, offrent neanmoins des renseignements parfois
utiles sur la structure d’une molecule a identifier.

16
a) Instrument equipe d’un seul etage de pompage

source API analyseur

Patm P < 10*5 Torr
analyseur
lentilles de focalisation

gaz +ions -> ions

gaz

b) Instrument equipe de trois etages de pompage

source API 1CT etage 2 etage 3™ etage

Patm 0,7 Torr 10" Torr P < 1 O'5 Torr

gaz +ions -> ions

v V v
gaz gaz gaz

Figure 1.5 : Sources API couplees a 1’analyseur de masse.

17
a) Circulation d’un courant d’azote sec a contre-courant

azote
sec

XT » XT + N,
SI

b) Dissociation induite par collision

AV
<------------------ >
Patm 0,7 Ton- 10"3 Torr

xr X" + nSl
si

1 2

Figure 1.6 : Precedes permettant d’eviter la formation de "clusters".

18
 Les premiers travaux realises sur le couplage LC/MS au moyen d’une source a pression
atmospherique ont ete entrepris par Homing et coll. pi]. L'effluent chromatographique est
nebulise grace a un courant d’azote prechauffe coaxial a raiguille d’introduction. Les
gouttelettes sont alors entrainees par le flux gazeux vers un tube de verre porte a une
temperature de 200 a 300°C. Apres vaporisation des gouttelettes, les solutes sont ionises par
transfert de proton en mode positif et par transfer! d’electron ou de proton en mode negatif a
l’aide d’un decharge couronne. Les ions ainsi formes sont echantillonnes vers l’analyseur au
travers d’un orifice de 10 pm (figure 1.7).
L’etape de vaporisation precedant l’etape d’ionisation, cette methode convient
particulierement a V analyse de molecules peu volatiles, difficilement ionisables (qui ne
presentent pas de groupement polaire) et peu thermolabiles.

Figure 1.7 : Schema d'une source a pression atmospherique avec ionisation des solutes
a 1'aide d'une decharge couronne[21].

Nous aliens decrire dans le paragraphe suivant l’interface electrospray (ou interface a
nebulisation electrostatique). Dans ce cas, 1’ionisation des solutes a lieu en phase liquide au
sein des gouttelettes chargees (resultant de la nebulisation de l’effluent chromatographique
sous Faction d’un champ electrique) Les ions sont ensuite extraits de la phase liquide. Ce
mecanisme est a l’origine d’un mode d’ionisation doux, tres utile pour 1’analyse de molecules
thermolabiles.

19
B : L*INTERFACE ELECTROSPRAY

1 - PRESENTATION DE L’INTERFACE ELECTROSPRAY

Au debut des annees 80, Fenn et ses collaborateurs equipent leur spectrometre de
masse d'une source d’ionisation par electronebulisation, connue sous le nom de source
electrospray, dans le but d'analyser des molecules thermolabiles. Les premiers resultats sont
obtenus avec des molecules de masses moleculaires inferieures a 1500 Da, telles que l'arginine
(M=I74 Da), la gramicidine S (M=I141 Da), la cyclosporine A (M=1202 Da) f22] I23], avec
comme ion predominant dans le spectre de masse l'espece protonee MH4" ou MH22+. Aucun
indice d’une degradation thermique n'est visible sur les spectres de masse. La figure 1.8 donne
les principales caracteristiques de la premiere source electrospray utilisee par cette equipe.

azote

electrode.,]
cylindrique
aiguille
effluent -*

quadripole

Figure 1.8 : Presentation de la premiere source electrospray developpee par Fenn et

Coll. p21.

20
 L'echantillon est introduit dans la source, a un debit liquide de quelques pl/min, au
travers d’une aiguille hypodermique en acier inoxydable maintenue a un potentiel de 3-10 kV.
La chambre a pression atmospherique est entouree d'une electrode cylindrique maintenue a un
potentiel de 500-600 V. Sous l'influence du champ electrique, des charges de signe positif (ions
preexistants en solution ou formes par electrolyse du solvant) sont attirees vers la surface du
liquide emergeant de l'aiguille. Les repulsions electrostatiques entrainent une dispersion du
liquide en un fin brouillard de gouttelettes chargees. Ces demieres migrent vers la buse sous
l’influence du champ electrique. L’exces de charges dans chaque gouttelette, combine a
1’evaporation progressive du solvant (grace a une circulation d’azote chauffe a contre-
courant), conduit a un point ou les repulsions coulombiennes excedent les forces de cohesion
des gouttelettes. Dans ces conditions, des microgouttelettes sont formees par explosion
coulombienne. Apres plusieurs etapes d’evaporation de solvant et d’explosions coulombiennes,
des ions (preexistants en solution ou resultant de la fixation d’un proton ou d’un ion sodium
sur une molecule neutre) desorbent de la phase liquide. Les ions en phase gazeuse penetrent
dans la chambre intermediate (ou regne une pression de quelques mTorr) puis ils sont idealises
vers l’analyseur. Les tensions appliquees sur la buse, l'ecorceur et les lentilles precedant le
quadripole sont respectivement de +40, +10 et -100 V. Dans ces conditions operatoires, la
source est reglee en mode positif (En mode negatif, les tensions appliquees sont identiques en
valeur absolue mais de signe oppose).

Apres cette description rapide de la source electrospray, nous developpons les deux
etapes qui interviennent dans le processus de formation d’ions en phase gazeuse : 1) l’etape de
nebulisation de la solution a l’extremite de l’aiguille d’introduction et 2) l’etape de transfert des
ions de la phase liquide vers la phase gazeuse.

21
 2 - DESCRIPTION DU PROCESSUS UNIONISATION

Des 1917, Zeleny etudie l’instabilite de la surface d’un liquide soumis a un champ
electrique [24]. Mais ce fut l'equipe de Dole qui realisa a partir de 1968 les premieres
experiences sur la formation d'ions par nebulisation electrostatique[25] I26l

La formation d'ions en phase gazeuse, consequence de faction d'un champ electrique

sur une solution dans laquelle sont dissouts les solutes, s'explique par un processus en deux
etapes:
1) la formation de gouttelettes chargees
2) le transfert des ions de la phase liquide vers la phase gazeuse
La partie qui suit reprend chacune de ces etapes en detail

2.a - La formation de gouttelettes chargees

L’effet d’un champ electrique sur la surface d’un liquide peut etre observe en elevant
graduellement la difference de potentiel entre un capillaire metallique a travers lequel s'ecoule
le liquide et une plaque metallique. La figure 1.9 illustre ce montage.

En l'absence de champ electrique, la solution qui s'ecoule du capillaire forme des

gouttes qui se detachent et tombent lorsque la force gravitationnelle due au poids devient
superieure a la tension superficielle.
En elevant la difference de potentiel entre le capillaire et la plaque, le volume des
gouttes diminue. Leur vitesse de migration augmente, avec des trajectoires qui deviennent
progressivement horizontales.
A partir d’une certaine valeur de difference de potentiel (qui depend de la composition
de la solution, de la distance entre le capillaire et la plaque,...), le liquide emergeant du
capillaire s'etend et forme un cone (appele cone de Taylor). Les gouttelettes sont alors
produites par rupture du filet de liquide present a l'extremite du cone (mode monospray).

22
 Pour une difference de potentiel encore plus importante, les gouttelettes sont formees a
partir de plusieurs points disperses sur le bord de l'extremite du capillaire, la colonne liquide
centrale disparaissant (mode multispray). Les conditions optimales de nebulisation sont
atteintes.
La transition entre les deux modes de nebulisation se manifeste sur les courbes intensite
du courant (i) en function de la difference de potentiel par une elevation de l'intensite.
Enfin, si on continue a augmenter la difference de potentiel, il apparait une decharge
couronne. Elle s’accompagne d’une elevation importante de l'intensite du courant.

Montage de l'experience :

capillaire plaque

e-
+
haute
tension

- mode monospray

- mode multispray

Figure 1.9 : Etude de l'influence du champ electrique sur la solution qui s'ecoule d'un
capillaire.

23
 Revenons maintenant sur les differents parametres qui interviennent dans la nebulisation
de la solution.

Nous avons vu precedemment que pour une certaine valeur du champ electrique, le
liquide qui sort du capillaire s'etend et forme un cone, appele cone de Taylor, caracterise par
un angle 20o (avec 0O = 49,3°).

Ce mode de nebulisation apparait pour une valeur du champ electrique Eon definie par

Cette formule proposee par Smith [27] fait intervenir la tension superficielle du liquide y , la
permittivite du vide e0, le demi angle 60 du cone de Taylor et le rayon interieur du capillaire r.

Par ailleurs, lorsqu'une difference de potentiel Vc est appliquee entre un capillaire (de
rayon exterieur r’) et une plaque metallique distants de d, le champ electrique a l’extremite du
capillaire peut etre evalue par la relation suivante :

[1.2]

En supposant les rayons interieur et exterieur du capillaire voisins, et en prenant 90 =

49,3°, so=8,8.10-12 J_1C2m_1, la combinaison des deux equations donne le potentiel Iimite de
nebulisation en mode monospray V«, (en volt)

[1.3]

24
avec y en N/m et r, d en m.
(A noter que Von represente plus exactement la difference de potentiel entre le capillaire et la
plaque metallique mais que nous utilisons le terme de potentiel).

Cette demiere equation met en evidence l'influence de la tension superficielle du liquide

sur le potentiel limite de nebulisation en mode monospray. Ainsi, des estimations ont pu etre
faites pour quatre solvants couramment utilises avec un montage ou r = 1.10-4 m, d = 4.10*2 m
(tableau 1.1).

solvant CH3OH CH3CN (CH3)2SO H20

y (N/m) 0,0226 0,030 0,043 0,073

V..(V) 2200 2500 3000 4000

Tableau 1.1: Estimations de Von pour quatre solvants p8l

Des verifications menees aussi bien pour la formation d'ions positifs (en mode positif)
que pour la formation d'ions negatifs (en mode negatif) montrent une bonne similitude entre les
resultats experimentaux et les estimations obtenues a partir de l'equation 1.3.

Ainsi, d'apres le tableau 1.2, plus la tension superficielle du solvant est elevee, plus le
potentiel limite de nebulisation en mode monospray est eleve (Vm etant proportionnel a y1/2).
Par ailleurs, pour travailler en mode multispray, la tension effective doit etre superieure de
quelques centaines de volt (en valeur absolue) a Vm. Ces conditions, pour les solutions
contenant un fort pourcentage d'eau, sont a 1'origine d'une decharge couronne a l'extremite du
capillaire, ce phenomene devenant encore plus important en mode negatif

25
 solvant V_(kV) Von (kV) V*.(kV)

theorie exp. exp.

CH3OH en mode negatif -2,2 -2,1 -3,6

en mode positif +2,2 +2,1 +4,6
H20 en mode negatif -4,0 -3,7* -3,7
en mode positif +4,0 +3,8* +4,0
avec Von le potentiel limite de nebulisation en mode monospray
Vdi, le potentiel d'apparition de la decharge couronne

* determine en presence de SF6

Tableau 1.2 : Verification de Vequation 1.3 permettant une estimation de Von[29][301

Lorsque le champ a l'extremite du capillaire depasse une valeur critique, voisine de 4

kV en modes negatif ou positif, une decharge couronne peut apparaitre. Les spectres de masse
dans ces configurations, se caracterisent par une attenuation sensible du signal correspondant
au solute et par la formation d'ions corame par exemple CH3OH2"1", HgO"*", NILf1" en mode

positif ou bien O2", HCO2", CO3' en mode negatif. De plus, la decharge se caracterise par une

augmentation brusque de l'intensite du courant (i). La diminution de l'intensite du signal du

solute peut s'expliquer par un effet de charge. En effet, la forte concentration d'ions de meme
signe (ions du solute et ions formes par la decharge) dans l'espace situe entre le capillaire et la
plaque entraine une repulsion entre ces ions, qui est a l’origine d’une diminution de l'intensite
du pic correspondant a la detection des ions du solute.
L'introduction d'un gaz presentant une grande affinite vis a vis des electrons, par un
tube concentrique au capillaire permet de supprimer ces decharges. En general, les gaz utilises
sont O2 [31\ N2 dope avec du freon [321 ou bien SFg. L'influence du gaz SFg a ete largement

etudiee par Kebarle et coll.1291 [301. L'augmentation de son debit s'accompagne d'une diminution

de l'intensite du courant (i) ainsi que de l'intensite des ions tel que CH3OH2"*" et de

l'augmentation du signal correspondant au solute. De plus, dans le cas ou le solute est en

solution dans l’eau, l'emploi de SFg stabilise les signaux et diminue le bruit de fond.

26
U est egalement possible de dissoudre dans la solution des inhibiteurs d'electrons tels que CCI4,
CH2Br2, C6F6[33].

En conclusion, le methanol et l'acetonitrile permettent de travailler en l'absence de

decharge couronne. II est possible aussi d'utiliser des melanges methanol-eau ou acetonitrile-
eau. Cependant, lorsque ces melanges contiennent une grande proportion d'eau, l'obtention
d'une nebulisation stable necessite l'ajout d'un gaz concentrique a 1'aiguille (O2, SF6) ou d'une
espece dissoute dans la solution (CCLt,...) afin de retarder ('apparition de la decharge couronne.

Le spray forme a la sortie du capillaire est compose de fines gouttelettes chargees.

L'apparition des charges s'explique par un mecanisme electrophoretique illustre sur la figure
1.10 P4

La solution s'ecoule d'un capillaire porte a une tension positive par rapport a la contre
electrode plane. Sous l'influence du champ electrique applique, les ions positifs presents dans la
solution ont tendance a se deplacer en direction de la surface du liquide, tandis que des ions
negatifs s'eloignent de celle-ci. Cette separation partielle des ions persiste jusqu'a ce que le
champ impose, a l'interieur du liquide, soit completement annule. Cet exces de charges
positives a la surface du liquide se traduit par une destabilisation de la surface. A l’extremite du
capillaire, le volume liquide s’etire et ainsi, un cone (le cone de Taylor) se forme. Selon le
modele de Smith[27], les ions positifs entoures de leurs molecules de solvatation s’ecoulent vers
la pointe du cone, entramant la formation d’un filet liquide tres etroit et instable en raison des
repulsions electrostatiques. Des gouttelettes chargees se detachent alors de l’extremite de ce
filet liquide. Un point essentiel a souligner est que les ions en exces dans ces gouttelettes sont
des ions initialement presents dans la solution : impurete, solute ionise ou solute neutre associe

a un ion comme par example Na+-

27
 reduction

© ©

oxydation

electrons

electrons
haute
tension

Figure 1.10 : Representation du processus qui semble se produire dans la source

electrospray. Le champ electrique impose conduit a une separation des ions positifs et negatifs
de l'electrolyte presents dans la solution. Les gouttelettes portent un exces d'ions positifs. Une
oxydation electrochimique se produit a l'interface liquide-metal du capillaire, avec liberation
d’ions positifs en solution[34].

Le courant mesure (circulation d’electrons a travers les fils metalliques qui servent a
appliquer la difference de potentiel) s’explique par des reactions electrochimiques produites a
la fois a l’interface liquide-metal et a la centre electrode. Cette hypothese formulee par 1'equipe
de Kebarle [34] permet de representer le dispositif electrospray comme une cellule d'electrolyse,
avec cependant une particularity : le transport des ions du capillaire vers la contre electrode ne
se fait pas en solution sur la totalite du trajet, mais egalement en phase gazeuse.
Ainsi, dans le cas ou le capillaire est porte a une tension positive par rapport a la contre
electrode, une reaction d'oxydation se produit a l'interface liquide-metal, qui se traduit par
1’apparition d'un exces d'ions positifs par rapport aux ions negatifs et la circulation d'electrons
dans le metal. L'exces d'ions positifs peut resulter de la disparition d'ions negatifs de la solution
ou bien de la production d'ions positifs. Simultanement, une reaction de reduction se produit a
la contre electrode. Les ions positifs formes peuvent migrer vers la surface du liquide et etre
presents dans les prochaines gouttelettes chargees.

Les reactions d’oxydation susceptibles de se produire pour une solution aqueuse (et un
capillaire metallique) sont les suivantes :
40H"(aq) —> O^g) + H2O + 4e"

28
 2HzO —» 02(g) + 4H+(,q) + 4e*
M(,) —> MZ (aq) + ze
Cette equipe a verifie l'hypothese de la cellule d'electrolyse a 1’aide d’un montage
experimental ou du zinc metal est place a l'extremite de capillaire. Le choix de ce materiau
s'explique par son potentiel redox tres faible. Les spectres de masse confirment 1’oxydation du
zinc par la presence de pics caracteristiques des ions Zn2+ solvates. De plus, il est montre qu'en
absence de zinc, un capillaire en acier inoxydable (comme le fer) n’est pas inerte, la reaction
d'oxydation s'accompagnant dans ce cas de la formation d'ions Fe24" solvates.

Ces experiences confirment done a la fois le mecanisme electrophoretique decrit pour la

formation des gouttelettes chargees ainsi que la sinnlitude entre 1’interface electrospray et une
cellule d'electrolyse.

29
 2.b - Le transfer* des ions de la phase liquide vers la phase gazeuse

Les premieres experiences sur la formation d’ions en phase gazeuse resultant de la

nebulisation electrostatique d’une solution, a pression atmospherique, furent realisees par Dole
et son equipe des 1968. Ils esperaient obtenir par cette technique des macroions intacts en
phase gazeuse, 1’evaporation directe de macromolecules s’accompagnant d’une degradation
thermique. Le schema de leur appareillage est presente sur la figure ci-dessous. Une solution
diluee de polystyrene (dans un melange benzene-acetone 3/2 v/v) s’ecoule d’une aiguille portee
a un potentiel de -10 kV, la nebulisation etant assistee par un courant d’azote. La detection
d’un courant d’ions, attribues a 1’existence de macroions en phase gazeuse, est realisee a I’aide
d’une cage de Faraday.

cage de Faraday ^orceur evacuation des gaz

buse t

azote
solution

pompe pompe

Figure 1.11: Montage de Dole et coll, pour la production et la detection de macroions[25].

La formation de ces ions fut expliquee par le modele de la charge residuelle. Sous 1’influence
du champ electrique, le liquide qui sort de l’aiguille est disperse en un fin brouillard de
gouttelettes chargees qui migrent en direction de la buse (chapitre 2.a). Par evaporation du
solvant, la densite de charge a la surface des gouttelettes augmente jusqu’a ce que 1’instability
de Rayleigh soit atteinte, les forces de repulsion devenant alors superieures aux forces dites de
cohesion dues a la tension superficielle du liquide. L’eclatement spontane d’une gouttelette
chargee electriquement en gouttelettes plus petites, processus appele explosion coulombienne,
se produit des que le rayon R de la gouttelette atteint la valeur critique Rr telle que

30
 Rr [1.4]
\64jz2s0y)

ou N est le nombre de charges, e la charge elementaire, So la permittivite du vide et y la tension

superficielle du liquide.
Cette sequence d’etapes d’evaporation de solvant et d’explosion coulombienne, pouvant se
repeter plusieurs fois, conduit a la formation de gouttelettes chargees ne contenant qu’une
macromolecule (ou seulement quelques unes) a condition que la solution soit assez diluee.
D’autre part, les repulsions electrostatiques entre les charges presentent a la surface des
gouttelettes limiteraient leurs agregations. Apres evaporation totale du solvant, le macroion est
forme par fixation des charges sur la ou les macromolecules. H en resulte une dispersion des
macroions en phase gazeuse, dans un melange d’azote et de vapeurs de solvant, qui se detend a
la sortie de la chambre de nebulisation sous la forme d’un jet supersonique, dans lequel les
macroions atteignent la meme vitesse que celle du gaz porteur (v=743 m/s).

En absence d’un spectrometre de masse, la determination du rapport m/z des ions formes dans
la chambre de nebulisation a ete possible en appliquant un potentiel de deceleration Vr a une
grille placee a V entree de la cage de Faraday. Pour des valeurs de Vr comprises entre 0 et -
1500V, le nombre total d’ions (ou courant ionique) qui penetrent dans la cage de Faraday a ete
mesure. Un exemple de courbe intensite du courant d’ions en fonction du potentiel Vr, obtenue
pour une solution de polystyrene de masse 51000, est presente sur la figure 1.12. En
augmentant progressivement Vr, plusieurs chutes de courant sont observees. Pour chaque
chute de courant, la determination du potentiel de deceleration permet de calculer un rapport
m/z a partir de la relation suivante

— mv2 = zV [1.5]
2 L

en supposant l’egalite entre l’energie electrique repulsive et l’energie cinetique de l’ion de

masse m portant z charges.

31
 25\

-500 1000 -1500 VOLTS

Figure 1.12 : Courbe intensite-tension Vr pour une solution de polystyrene de masse 51000
(solution de polystyrene a 0,01 % en poids dans un melange benzene-acetone 3/2 v/v) [25l

Ainsi, l’equipe de Dole interprete les courbes intensite-potentiel obtenues par nebulisation
electrostatique avec des solutions diluees de polystyrene, par la formation de macroions en
phase gazeuse : principalement dimeres et trimeres monocharges pour le polystyrene de masse
51000 (rapport molecules/charge de 2 et 3 respectivement), monomeres multicharges pour le
polystyrene de masse 411000 (rapport molecule/charges de 1/5, 1/3, 1/2 et 3/4); monomere
signifiant une seule macromolecule, dimere (trimere) signifiant deux (trois) macromolecules
liees par des forces de Van der Waals.

Cependant, plusieurs points a propos de ce modele ont ete discutes par Fenn et son
equipe [35): (1) II est difficile de comprendre comment a partir d'une combinaison de charges et
de molecules dans une goutte initiale, les gouttelettes finales contiennent, selon le poids
moleculaire des especes dissoutes dans la solution, plusieurs molecules avec une seule charge
presente a la surface ou bien une seule molecule avec plusieurs charges reparties sur la surface;
les macroions resultant alors de l'evaporation totale du solvant. De plus, le dechirement de la
surface liquide des gouttelettes s'accompagnant d'une augmentation du rapport charge/masse,
la formation de gouttelettes finales avec une seule charge parait peu probable. (2) D'autre part,
d'apres ce modele, les ions pourraient etre formes en phase gazeuse par electrospray quelque

32
soit la nature des solutes. Or, seules des especes ionisees en solution ainsi que des especes
neutres presentant soit des groupements polaires sur lesquels les charges (FT, Na+, ...) peuvent
se lier par force ion-dipole, soit des sites ionisables (fonction acide ou basique) ont pu etre
detectees par un spectrometre de masse apres la nebulisation electrostatique de la solution. (3)
Aussi, l'hypothese selon laquelle les macroions atteignent la meme vitesse que celle du gaz
porteur pendant l'expansion libre dans le vide peut etre remise en cause. Des resultats
theoriques et experimentaux mettent en evidence un decaiage de vitesse entre les grosses
molecules et les molecules de gaz lors d'une expansion libre dans le vide.
En consequence, il semble preferable d'expliquer ces courants d'ions par la formation d'un
agregat de polystyrenes et de charges ainsi que des molecules de solvant (si la desolvatation
n'est pas complete). Et certains de ces agregats auraient un m/z et une vitesse dans le jet
supersonique tel que leur energie cinetique serait voisine de celle de macroions supposes
existants par Dole et ayant une vitesse identique a la vitesse du gaz porteur.

Une autre explication pour la formation d'ions en phase gazeuse fut proposee en 1976
par Iribame et Thomson avec leur modele de desorption d’ions (ou d’Evaporation Ionique) [36]
[37]: Lors de l'evaporation du solvant, ('augmentation de la densite de charge a la surface d'une
microgouttelette conduit a l'obtention d'un champ electrique a la surface du liquide suffisant
pour permettre la desorption d'ions de la surface liquide (cette etape de desorption pouvant se
produire a la suite d'une succession d'etapes d'evaporation de solvant et d'explosion
coulombienne).

Avec leur source d'ionisation a pression atmospherique, symbolisee par le terme APIE
(atmospheric pressure ion evaporation), la solution contenant des solutes ionises est nebulisee
a la sortie d'une aiguille a l'aide d'un courant d'azote de direction perpendiculaire a celle de
l'ecoulement de la solution. Les fluctuations dans la distribution des cations et des anions,
initialement presents dans la solution, conduisent a la formation de gouttelettes faiblement
chargees (positivement et negativement). Une electrode portee a un potentiel de quelques kV
et placee a proximite du nebuliseur induit une charge plus elevee et de meme signe pour
l'ensemble des gouttelettes. La figure 1.13 presente leur montage utilise ensuite pour la
detection de molecules polaires et labiles1381 t39l

33
 repousseur
lentilles orifice quadripole detecteur
air k i i
nebuliseur

electrode i l
d'induction pompe pompe

Figure 1.13 : Montage de la source d'ions a pression atmospherique utilisee par Iribame
et Thomson t3?1.

Dans leur etude theorique [36], Iribame et Thomson considered que la desorption d'un ion-
cluster d'une gouttelette chargee devient spontanee lorsque la variation d'enthalpie libre totale
de solvatation AG° devient positive.

AG° = AG°, + AGe [1.6]

avec
AG° la variation d'enthalpie libre totale de solvatation d'un ion dans une gouttelette chargee
AG°S la variation d'enthalpie libre de solvatation de l'ion
AGe la contribution electrostatique a raj outer a AG°, en raison des interactions de l'ion avec les
autres ions contenus dans la gouttelette.

Cependant, la desorption d'un ion de la surface d'une gouttelette chargee necessite le

ffanchissement d'une barriere energetique, processus pouvant etre traite d'un point de vue
cinetique. Soit kg la constante de vitesse du processus de desorption d'un ion X* consideree
comme une etape du premier ordre (SI representant une molecule de solvant).

34
 x+ it >X+(Sl)
nv*

kg se definit de la fagon suivante

-tittnC/fift = kE [1.7]

avec kg = k0e_AG ^

ou C, ko et AG* represented respectivement la concentration des ions a la surface de la

gouttelette, une const ante dependant de la temperature et la hauteur de la barriere energetique
a franchir par l'ion.
AG* est egal a la difference entre
1) l'etat de transition lorsque l'ion se trouve a la distance Xm de la gouttelette de rayon R
2) l'etat initial qui caracterise l'ion solvate a la distance d de la surface de la gouttelette.
Un schema de l'etat initial et de l'etat de transition est presente sur la figure 1.14.

(a) &)

etat initial etat de transition

Figure 1.14 : Representation schematique de l'etat initial (a) et de l'etat de transition (b)
propose par Iribame et Thomson. L'ion desorbe sous la forme d'un cluster fvf"(Sl)n ou SI
symbolise une molecule de solvant[40].

35
Enfin, pendant l'evaporation du solvant, le rayon critique Re pour lequel se produit la
desorption de l'ion doit etre atteint avant le rayon Rr correspondant a 1'instabilite de Rayleigh
pour lequel la gouttelette exploset41].

Une illustration du modele d’lribame et Thomson est donnee par la figure 1.15 ou sont
representees les deux courbes N = f ( Re) et N = f (Rr), N etant le nombre de charges
elementaires a la surface de la gouttelette.

---- B

—'— A

84 DO 04 BO

Figure 1.15 : Rayon critique du processus de desorption de l'ion X* (Re*, Re*) pour AG*
estime a 9 kcal/mol et rayon critique pour 1'instabilite de Rayleigh (Rr) en function du nombre
de charges elementaires N dans une goutte d'eau (la courbe Re* est tracee avec AG°, = -56
kcal/mol et d = 3,85 A, la courbe Re* est tracee avec AG°, = -64 kcal/mol et d = 5,60 A)f36l

D'apres cette figure, la condition Re" > Rr (ou Re+> Rr) est satisfaite a condition que N< 192
(ou N < 96). Dans le cas ou N est plus eleve, 1'instabilite de Rayleigh conduit a l'eclatement de
la gouttelette. Apres une ou plusieurs explosions coulombiennes, la condition RE > Rr peut de
nouveau etre satisfaite et le processus de desorption devient possible.

36
 L’avantage du modele d’lribame et Thomson est de pouvoir comparer Pefficacite
d’ionisation de plusieurs solutes a partir de leurs energies de solvatation. Des etudes
experimentales concemant un grand nombre d’ions semblent etre en accord avec ce modele. D
permet aussi, pour les molecules de hautes masses moleculaires qui s’ionisent en dormant des
ions multicharges, de donner une interpretation qualitative de la distribution des charges (voir
chapitre 4).
Iribame et Thomson supposent que le processus de desorption se produit avec un etat
de transition defini pour l’ion solvate a une distance de la gouttelette (figure 1.14). fis
evaluent ainsi que la desorption d’un ion devient possible a partir d’une valeur d’un champ
electrique de 109 V/m. Or, si l’etat de transition intervenait plus tot, au moment du
"dechirement" de la surface de la gouttelette, la hauteur de la barriere energetique a franchir
par l’ion serait plus importante. Et dans ce cas, l’intensite du champ electrique a atteindre
serait beaucoup plus elevee. La formation des ions en phase gazeuse pourrait alors resulter
d’une succession d’etapes d’explosion coulombienne et d’evaporation de solvant[42] [43].
Bien qu’il existe toujours des incertitudes concemant le processus exact de formation
d’ions en phase gazeuse, les auteurs semblent favoriser le modele de desorption.

37
 2.c - Schema general du mecanisme d’ionisation

Une estimation de la charge Q et du rayon R de la gouttelette, depuis la nebulisation de

la solution a l’extremite de Vaiguille d’introduction jusqu’a la formation d’ions en phase
gazeuse, est donnee sur la figure 1.16. Ces estimations ont ete proposees a partir
d’observations sur des gouttelettes chargees formees par nebulisation electrostatique, pour des
rayons superieurs a 1 pm, ainsi qu’un certain nombre d’hypotheses[44].
(1) Les gouttelettes initiates produites par nebulisation electrostatique, a un debit
liquide de quelques pl/min, ont un rayon moyen R, de 1,5 pm et une charge moyenne Q; de 8,2
10'15 C. Cette charge Q; equivaut a 40 % de la charge Qr, charge limite pour laquelle la
gouttelette se divise par explosion coulombienne (avec le methanol pour solvant).
(2) Le rayon des gouttelettes diminue par evaporation du solvant, tandis que la charge
reste constante. Lorsque le rayon atteint la valeur critique Rj, defini pour Q egal a 80 % de Qr,
il est observe une fission des gouttelettes. L’observation de deformations elastiques des
gouttelettes expliquerait que le seuil d’instabilite de la surface liquide soit atteint des Ri et non
pour Rr defini par Inequation de Rayleigh (Rr < R2). La gouttelette "mere" perd ainsi 15 % de
sa charge et 2 % de masse. Une vingtaine de gouttelettes "fille" de rayon R, egal a 10 % du
rayon de la gouttelette "mere" sont emises a l’extremite de Felongation.
(3) Le processus evaporation de solvant-fission se repete ainsi plusieurs fois.
(4) Pour expliquer le processus de formation d’ions en phase gazeuse, il faut prendre en
compte le devenir d’une gouttelette "fille". Au bout de la troisieme fission, les gouttelettes
"fille" ont pour rayon 0,076 pm soit 760 A et portent 276 charges elementaires. La fission de
gouttelettes de rayon aussi petit n’a pas ete observee. Pour simplifier la discussion, il est
propose que la gouttelette, apres evaporation du solvant, se divise en quatre gouttelettes de
rayon 180 A, chacune portant 70 charges elementaires. Le rayon de ces gouttelettes diminue
par evaporation du solvant jusqu’a atteindre les conditions voisines de celles definies par
Iribame et Thomson, a savoir
R= 80 A
TV =70 charges elementaires
, pour lesquelles la desorption d’un premier ion de la phase liquide devient possible.

38
 Elongation de la gouttelette et emission
de gouttelettes "fille"

00=8.2x10-15 c Q,=8.2x10-15 C
flo=1 -5 jim R i=0.94 |im

At=462 p.3

Rj=0.3S tim

At=74 jis Q3=5.9x10-15 c

Qj=7.5x10-3Q, + R3=0.76 jim
Rs-O.IRt O O O O

20 gouttelettes At=70 p.s

o o o o
Q,=4.4x10-17 C. N=27S +
R,=0.076 gm O O O O
I At=39 (is
R,=0.029 nm (290 A). N=27S *
R,= 180 A. N-70 yi V\
|At=8 (ts
R=80 A. N=70 :
l At=2 (13

ion en phase gazeuse

Figure 1.16 : Evolution du rayon R et de la charge Q avec le temps pour une

gouttelette chargees formees par nebulisation electrostatique[44].

39
 CONCLUSION

En presence d’un champ electrique intense (3 a 5 kV/cm), on observe la formation d’un

aerosol charge lorsque la solution est introduite dans la chambre d’ionisation a un debit liquide
de quelques pl/min. Le mecanisme de formation de cet aerosol est complexe et depend d’un
grand nombre de parametres tels que la temperature du milieu, la valeur du champ electrique,
le diametre de Vaiguille d’introduction, le debit liquide de la solution introduite et la nature du
solvant. Les gouttelettes formees ont un rayon voisin de 1 pm.
Comme mecanisme de formation d’ions en phase gazeuse, il a ete propose le modele
d’Evaporation Ionique. Apres une succession d’etapes d’evaporation de solvant et de fission
de gouttelettes, le champ electrique a la surface des gouttelettes serait suffisant pour que des
ions desorbent.

Dans le prochain paragraphe, nous allons presenter les principaux avantages apportes
par cette technique d'ionisation qui expliquent son developpement tres important durant ces
demieres annees.

40
 3 - LES ESTERETS DE CE MODE D’lONISATION

L'ionisation par electronebulisation est une methode d’ionisation de choix aussi bien
pour P etude en solution des especes ionisees que neutres. Mais dans le second cas, elles
doivent presenter des groupements polaires sur lesquels des charges peuvent se Her par force
ion-dipole ou bien des sites ionisables (fonctions acide ou basique), le pH etant alors un
parametre important.

Par son mode d’ionisation doux, il devient possible d’analyser des molecules
thermolabiles par spectrometrie de masse. Le premier resultat presente par l’equipe de Fenn
conceme Petude de Parginine, avec Pobservation de l’ion parent et Pabsence d’ions pouvant
resulter d’une decomposition thermique de ce compose [22]. Depuis, cette methode d’ionisation
a ete largement utilisee pour P analyse de composes thermolabiles de petites masses, en
particulier dans le domaine de la recherche pharmaceutique, pour P etude de nouveaux
medicaments et de leurs metabolites 145-491. Aussi, dans le domaine de P environnement, ce mode
d’ionisation facilite Panalyse directe de nombreux pesticides polaires dans Peau I50'55l

Une particularity de l’ionisation par electronebuUsation est la formation d’ions

multicharges pour les molecules de masses elevees. Les premiers exemples fiirent presentes par
l’equipe de Fenn avec les polyethylene glycols). Ces PEGs represented des especes
interessantes pour ce type d'etude car leur structure chimique est essentiellement independante
de leur taille. II est possible de se procurer dans le commerce des echantillons de ces polymeres
pour une gamme de masse tres etendue. La masse moleculaire de l'echantillon comprenant un
melange de plusieurs oligomeres, est definie par "la masse moleculaire nominale" qui
represente l'oligomere le plus abondant dans le melange. Le composant monomere est l'oxyde
d'ethylene de masse 44. Le spectre de masse d'un PEG se caracterise par des bandes de pics
avec une distribution Gaussienne des intensites. Chaque pic correspond a un oHgomere dont le
nombre de monomeres difFere de un par rapport a celui du pic adjacent. Les ions sont obtenus

par fixation de cations Na+ sur les atomes d'oxygene, resultant de la presence de sodium dans

41
les echantillons. Un exemple d'un tel spectre est donne sur la figure 1.17 avec le PEG 3350. La
presence d'un massif au lieu de pics bien distincts peut s'expliquer par 1'existence d'un grand
nombre de combinaisons possibles de masses moleculaires et de nombre de charges donnant
des valeurs de m/z trap proches pour etre separees.

1600

Figure 1.17 : Spectre de masse par electrospray du polyethylene glycol de poids

nominal 3350 dissout dans une solution methanol-eauI35].

L’existence de ces ions multicharges est extremement importante. En effet, l'analyseur

determinant la mesure des rapports m/z, l'echelle de masse rendue accessible augmente par un
facteur egal au nombre de charges sur l'ion. Par exemple, si une molecule de masse 5000 Da
est protonee 3 fois, le pic de masse correspondant a cet ion aura une valeur de (5000+3)/3,
voisine de 1670 et sera detecte par un spectrometre de masse quadripolaire classique. II est
meme possible d'etudier des polyethylene glycols de masses tres elevees, jusqu'a la valeur de
5000000 Da [56].

Ce mode d'ionisation a connu un essor considerable dans le domaine de la biochimie, avec

V etude de proteines de hautes masses moleculaires 1575 [581 [59l Nous donnerons comme
illustration les spectres de masse obtenus avec le cytochrome C de masse moleculaire 12400
Da [60] et 1'albumine bovine dont la masse moleculaire est voisine de 66000 Da [6I]. Le spectre
de masse obtenu par electrospray a partir d'une molecule de haute masse moleculaire presente

42
done une succession logique de pics de masse. Chaque pic correspond a un ensemble d'ions
portant un nombre de charges determine. Entre deux pics voisins, le nombre de charges difiere
d'une unite.

m/z

Figure 1.18 : Spectre de masse par electrospray du cytochrome C dissout dans un

melange acidifie d'eau et methanol[601.

100-t

i i i n i
1800

Figure 1.19 : Spectre de masse par electrospray de l'albumine de bovin dissoute dans un
melange d'eau, de methanol et d'acide acetique dans les rapports de 47:47:6 v/v/v[61].

43
 L’ionisation par electronebulisation presente aussi un grand interet pour V etude de
composes ionises inorganiques et organometailiques. L’ammonium quatemaire [NR/] et le
phosphonium quatemaire [PR4 ] sont parmi les cations inorganiques les plus simples et les
spectres de masse de leurs sels ont ete les premiers a etre rapportes[22]. Ce mode d’ionisation a
par consequent considerablement elargi le domaine d’application en chimie inorganique, avec
V etude des ions metalliques de la famille des alcalins, des alcalino-terreux, et des metaux de
transition, ainsi que de la famille des lanthanides. Aussi, ce mode d’ionisation doux est tout a
fait adapte a V etude de complexes inorganiques ou organometailiques[621[63].

Enfin, ce mode d’ionisation a ete egalement mis a profit en biochimie pour 1’etude de
complexes proteine-metal, proteine-ligand ou d’interactions de type proteine-proteine 1571 [64]
[65]

En conclusion, l’ionisation par electronebulisation a permis d’elargir considerablement

le domaine d’application des analyses par spectrometrie de masse, et notamment en biochimie,
avec 1’etude de proteines de masses moleculaires elevees. Ce mode d’ionisation permet
egalement d’analyser des composes non volatils et/ou thermolabiles, ionises ou neutres en
solution ainsi que des complexes inorganiques ou organometailiques.

44
 4 - LES SPECTRES DE MASSE DE MOLECULES DE HAUTES MASSES
MOLECULAIRES

Les facteurs qui determined le nombre maximum de charges

Les premieres experiences menees par Covey et coll, semblent montrer une relation
entre le nombre maximum de charges et le nombre de sites acides ou basiques [66]. Ainsii, le
spectre de masse de la mellitine se compose de trois pics attribues aux ions MH33+, MH44"1",

MH55+- Dans ce cas, le nombre maximum de protons fixes egal a cinq correspond aussi au
nombre de sites basiques presents sur cette molecule.

Ensuite, grace aux nombreux resultats obtenus avec les PEGs dont la gamme des
masses disponibles est tres vaste, l'equipe de Fenn a propose un modele simple qui prend en
compte le nombre d'atomes d'oxygene et les repulsions entre les charges de meme signe fixees
sur ces sites[67].
En efFet, le nombre maximum de charges sur un ion depend du nombre total de sites ou
groupes polaires sur lesquels les charges peuvent se fixer. Mais ces memes charges sont
soumises a des repulsions electrostatiques. II est done necessaire pour chacune d’entre-elles
que l'energie qui les lie a la molecule soit egale ou superieure a l'energie de repulsion
electrostatique entre cette charge et toutes les autres. E est ainsi possible de prevoir pour un
PEG le nombre de charges maximum en fonction du nombre d'atomes d'oxygene (e'est a dire
du nombre de monomeres).
Mais ce modele semble surestimer la capacite de la molecule a retenir les charges. En

effet, la figure 1.20 met en evidence un nombre de Na+ theorique superieur a celui determine
experimentalement a partir des spectres.

En fait les calculs ont ete bases sur une distance entre ces charges a partir d'une
configuration Iineaire du polymere. Mais il est probable que l'energie thermique soit suffisante
pour permettre des mouvements de la molecule et par consequent, cette distance se trouve
reduite, ce qui se traduit par des forces de repulsion entre les charges plus importantes.

45
 Cette difference entre le modele theorique et les resultats experimentaux pent
s'expliquer aussi d'un point de vue cinetique, l'ion desorbant avant qu'il ait pu collecter toutes
les charges.
A noter que ce nombre maximum pent augmenter lorsque les charges sont apportees
par des ions ayant une energie de liaison plus elevee (par exemple H+ a plus d'affinite que Na+
vis a vis de 1'oxygene).

Nombre de monomeres

Figure 1.20 : Nombre de charges (Na+) par oligomere de PEG en fonction du nombre
de monomere. La courbe represente les predictions du modele et les points sont des mesures
obtenues a partir des spectres de masse1671.

Un autre modele propose par Fenn donne cette fois ci une explication qualitative sans
expression mathematique selon laquelle l'etat de la surface de la gouttelette chargee determine
la quantite de charge portee par l'ion pendant sa desorption [68l
La figure 1.21 presente cinq molecules de taille differente avec la densite de charge a la
surface de la gouttelette qui augmente pendant l'evaporation du solvant. Si par exemple, la
gouttelette contient un exces d'ions H+ a sa surface et des molecules comportant plusieurs sites
basiques, ces molecules non protonees approchant de cette surface peuvent ainsi fixer un ou
plusieurs protons, et former un ion. Le nombre de protons fixes n’est pas uniquement
determine par le nombre de sites basiques presents sur la molecule mais est egalement fonction
de la densite de charge a la surface. Au fur et a mesure que le solvant s'evapore, le nombre de
charges que peut fixer la molecule augmente et la desorption de l'ion devient plus facile.

46
 Lorsque le volume de la gouttelette

diminue par evaporation, la taille de

la molecule et le nombre total de

charges portees par la gouttelette

restent constants mais 1'espace entre

les charges diminue. En general, plus

la densite de charge a la surface de la

gouttelette est grande, plus le nombre

de charges fixees sur la molecule est

grand.

Figure 1.21: Representation de cinq molecules, de taille et de forme differentes,

presentes a la surface de la gouttelette chargee pour trois etapes d'evaporation (1, 2 et 3)[68]l.

L'allure d'un spectre multicharge

L'enveloppe des pics d'un spectre d'ions multicharges presente une forme Gaussienne. H
est possible de definir une "fenetre de desorption" des ions sur l'echelle de m/z limitee par des
homes inferieure et superieure. L'existence de cette fenetre est done interpretee par la forte
dependance du processus de desorption a la densite de charge en surface. Cette desorption se
produit d'autant plus facilement que le nombre de charges par ion et la force du champ
electrostatique sent importants. Ainsi, les ions observes avec le minimum de charges
(correspondant a la valeur maximum de m/z) sont plus difficilement desorbes et sont
caracterises par un signal de faible intensite. L'evaporation s'accompagnant d'une augmentation
de la densite de charge, a la fois le champ electrostatique et le nombre de charges par ion

47
augmentent a la surface et ie processus de desorption devient plus facile. En effet, I’intensite du
signal augmente Iorsque le rapport m/z diminue. Ce phenomene se poursuit tant que le temps
de residence de l'ion a la surface est du meme ordre de grandeur que le temps necessaire a l'ion
pour collector toutes les charges. A partir d'un certain nombre de charges pour un ion donne
(correspondant au maximum de l'enveloppe), les ions desorbent avant d'avoir atteint l'etat de
charges permis par la densite de charge. Et l’intensite du signal diminue jusqu’a devenir nulle.
Le processus de desorption avec des considerations cinetiques rend bien compte a la fois de
l'allure de l'enveloppe, et de l'existence de deux limitest35].

Calcul de la masse de la molecule et caracterisation de chacun des pics

Bien sur, les ordinateurs sont equipes de logiciels qui permettent de connaitre les deux
parametres : masse et nombre de charges. Mais il est possible de determiner la masse d'une
espece inconnue a partir de relations mathematiques simples[66].

La formation d'ions multicharges positifs resulte de l'addition de plusieurs charges

positives sur la molecule neutre, les especes chargees les plus courantes etant les protons, mais
aussi les cations sodium, ammonium et potassium. Les ions negatifs resultent au contraire de la
perte de protons.

En mode positif, le pic correspondant a l'ion forme (M+nX)n+ a partir de la molecule

(M) et des especes chargees (X) se situe sur l'echelle de m/z a une valeur m definie par :

M + nX
m =---------- [1.8]
n

avec M la masse de la molecule

n le nombre de charges ajoutees
X la masse de l'espece monochargee

48
Etant donne deux pics voisins definis par m% et m2 tel que m2 > m% et en supposant qu'iJs ne

different que d'une seule espece monochargee, nous pouvons ecrire

M + n2X
IH2 — [1.9]

M + (n2 +1)X
m, = [1.10]
n2 +1

II est done facile de deduire a partir de ces deux relations le nombre de charges n2 portees par
l'ion 2 et M la masse de la molecule.

m, - X
[1.11]
m2 -m,

M = n2 (m2 - X) [1.12]

De meme, en mode negatif, le pic correspondant a l'ion (M-nX)n' se situe sur 1'echelle
de m/z a une valeur m definie par :

M-nX
m =---------- [1.13]
n

Par le meme raisonnement que precedemment, nous pouvons obtenir n2 et M.

m, +X
[1.14]
m2 -m,

M = n2 (m2 + X) [1.15]

49
 Un example est donne avec la mellitine dont le spectre de masse presente trois pics a
m/z = 570.1, m/z = 712.4 et m/z = 949.6. A partir de (1.11) et (1.12) il est facile d'attribuer le
nombre de charges a chacun de ces pics, respectivement de 5,4,3, en supposant que la charge
est apportee par un proton (X=l). La masse de la molecule est
de 2845,8 Da si m2 = 949,6 et m% = 712,4

et de 2845,6 Da si m2 = 712,4 et m% = 570,1

L'interet des spectres d'ions multicharges est de pouvoir determiner pour une molecule
inconnue sa masse a partir de plusieurs rapports m/z et ainsi, de reduire l'incertitude de la
mesure. Ce mode d’ionisation est d’ailleurs tres utilise en biochimie pour I’identification de
masses de proteines.

50
 5 - LES SOURCES D’lONISATION PAR ELECTRONEBULISATION

Les premieres experiences realisees avec une source electrospray sont menees par M.
Dole et ses collegues des 1968, avec une cage de Faraday comme detecteur d’ions. E faudra
attendre le debut des annees 80 pour que l'equipe de Fenn associe une source electrospray au
spectrometre de masse [221 [23]. Es demontrent l'interet de cette methode d'ionisation pour
l'analyse de molecules thermolabiles ou de hautes masses moleculaires. Par la suite, de
nombreuses modifications ont ete apportees a cette source afin de faciliter le couplage LC/MS.

En effet, avec une source electro spray "de premiere generation", il existe un certain
nombre de contraintes liees a la nebulisation de la solution qui limitent le domaine d'application
des separations par chromatographic liquide.
1 - Les debits de phase mobile dans la source sont limites a quelques pl/min, ce qui
necessite l'emploie de microcolonnes ou bien la division de l'effluent chromatographique en
sortie de colonne.
2 - La tension superficielle de l’effluent chromatographique ne doit pas etre trop
elevee. Les melanges eau-acetonitrile, eau-methanol sont le plus souvent choisis comme phase
mobile, mais des difficultes apparaissent pour les phases mobiles qui contiennent un fort
pourcentage d'eau ou si la composition de la phase mobile change au cours de l'analyse.
3 -Enfin, la phase mobile ne doit pas etre trop conductrice.
Or la majorite des separations par chromatographic liquide sont realisees, avec des
colonnes conventionnelles a un debit liquide voisin de 1 ml/min, a l'aide d'un gradient d'elution,
et l'ajout d'un tampon dans la phase mobile s'avere parfois interessant pour ameliorer la
resolution entre deux pics voisins.

De nouvelles sources "de seconde generation" ont ete developpees afin d'elargir le
domaine d'application des couplages LC/ESI/MS.

Avec un nebuliseur constitue de deux capillaires concentriques, il est possible de

modifier la composition de l'effluent chromatographique en sortie de colonne par l'ajout d'un

51
solvant organique de faible tension superficielle. Ce dernier est introduit grace au capillaire
exterieur et se melange avec l'effluent chromatographique a l'extremite du capillaire de
nebulisation. Ce type de nebuliseur est particulierement interessant pour l'analyse de melanges
de peptides car leur separation necessite un gradient d'elution (eau-solvant) et des phases
mobiles contenant 0.1 % de TFA (acide trifluoroacetique) pour ameliorer la resolution. La
nebulisation de la solution est alors facilitee par l'ajout d'un solvant organique tel que le
methanol, l'isopropanol ou le 2-methoxyethanol[691 [70].

Avec une assistance pneumatique, l'introduction de la solution dans la source

d’ionisation a des debits superieurs a 10 pl/min devient possible. Cette interface, developpee
par Henion et son equipe[32], est connue sous le nom d'interface ionspray. La nebulisation de la
solution resulte alors de la combinaison des forces aerodynamiques et des forces electriques.
Aux debits optimums proches de 40 pl/min, les gouttelettes sont moins chargees et plus
volumineuses qu’en 1'absence d’assistance pneumatique (leurs diametres sont respectivement
de 10 pm et 1 pm). La baisse d'efficacite du processus de formation d’ions en phase gazeuse a
40 pl/min (avec assistance pneumatique) comparee a quelques pl/min (en l'absence d'assistance
pneumatique) est compensee par une augmentation de la quantite de matiere introduite dans la
source par unite de temps. Par consequent, la sensibilite entre les deux modes de nebulisation
est a peu pres identique. D'autre part, l'assistance pneumatique ameliore la nebulisation des
solutions contenant un fort pourcentage d’eau ou plus generalement de tension superficielle
elevee. Cette interface, brevetee par Sciex, permet de coupler directement au spectrometre de
masse des colonnes de petit calibre sans division d'efiluent en sortie de colonne.

A des debits superieurs a 500 pl/min, et avec ('assistance pneumatique, le nebuliseur est
encore capable de creer un aerosol de gouttelettes chargees. En plagant un ecorceur (relie a la
masse electrique) entre le nebuliseur et Vorifice d'echantillonnage des ions, l'exces de liquide
non volatilise est recueilli dans un becher place sous 1'ecorceur. SeuI les ions formes en phase
gazeuse (ou "clusters") sont transmis vers l'analyseur1711 [721. Cette interface ionspray amelioree
accepte le flux liquide d’une colonne conventionnelle, jusqu’a 2 ml/min.

52
 L'introduction dans la source de solutions a un debit de 500 pl/min est egalement
possible en chaufFant l'extremite du nebuliseur, le liquide etant nebulise par combinaison de la
chaleur et du champ electrique. Cependant, une diminution de sensibilite a ete observee avec
cette interface par comparison a V interface ionspray [73]. La diminution du rendement
d’ionisation peut s'expliquer soil par une augmentation de la taille des gouttelettes aux debits
les plus eleves (et une evaporation insuffisante), soit par une evaporation complete des
gouttelettes et par suite la formation de particules solides.

Enfin, en combinant la vibration mecanique, en particulier dans la gamme de frequence

ultrasonique avec un champ electrique (brevet Analytica), il est egalement possible de nebuliser
des solutions de tension superficielle et/ou de conductivity electrique elevee(s), pour des debits
allant de quelques pl/min jusqu'a 1 ml/min [741t75,_

53
 CHAPITRE 2

MICROCOLONNES ET COLONNES DE PETIT CALIBRE EN

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDS

54
A ; PRESENTATION DES MICROCOLONNES ET DES COLONNES DE
PETIT CALIBRE

La microchromatographie liquide met en oeuvre des colonnes de diametre interieur

inferieur ou egal a 1 mm tandis que celui des colonnes classiques est de 4,6 mm.
Elies peuvent etre classees en trois categories (figure 2.1)
- les colonnes capillaires vides de diametre interieur inferieur a 50 pm
- les colonnes capillaires partiellement remplies de diametre interieur compris entre 40
et 400 pm
- les microcolonnes remplies de diametre interieur compris entre 50 et 500 pm
Enfin, nous pouvons rajouter a ce classement les colonnes de 1 mm de diametre interieur
encore appelees colonne de petit calibre.

Diametre interieur 5-50 40-100 50-500

Longueur ( m) 3—30 10-30 0,1 -2

Diametre des __
particules (pm) 40-10 10-3

Figure 2.1 : Differents types de microcolonnes [1l

55
 Le tableau 2.1 rassemble quelques caracteristiques de microcolonnes utilisees en
chromatographic liquide en les comparant a celles des colonnes classiques.

Type de colonne dc L D capacite de charge

(pl/min) d’echantillon
(cm)
classique 4,6 mm 10-50 500-2000 10-100 pg
petit calibre 1 mm 10-2200 10-50 5-10 pg
microcolonne remplie 50-500 pm 10-200 0,5-10 1-5 pg
colonne partiellement 40-100 pm 1000-3000 0,2-0,5 100 ng-1 pg
remplie
capillaire vide 5-50 pm 300-3000 0,01-0,5 <100 ng

Tableau 2.1 : Les principals caracteristiques des microcolonnes (dc < 1mm) et des colonnes de
petit calibre (dc = 1 mm) par rapport aux colonnes classiques.

Dans la suite de V expose, nous nous limiterons aux microcolonnes remplies et aux
colonnes remplies de petit calibre. Nous discuterons d’abord les avantages qu’entraine la
diminution du diametre interieur des colonnes. Puis nous decrirons l’appareillage developpe
specifiquement pour ces categories de colonnes, et en particular la miniaturisation du montage
afin de limiter les effets extra-colonne.

56
B ; INTERETS DE LA MICROCHROMATOGRAPHIE LIQUIDS

La microchromatographie presente un interet certain par rapport a la chromatographie

classique pour 1’analyse d’echantillons de faible volume (1 pi ou moins) et rend possible la
separation de melanges complexes qui necessitent un grand nombre de plateaux theoriques
(N>50000). De plus, la diminution du debit liquide s’accompagne d’une reduction de la
consommation de phase mobile, ce qui permet la mise au point de separations a 1’aide de
solvants complexes et couteux, et facilite le couplage avec un systeme de detection, tel que la
spectrometrie de masse et la spectrophotometrie d’emission de flamme.

Nous allons maintenant revenir sur les deux premiers points cites, a savoir V analyse

d’echantillons de volume limite et la separation de melanges complexes.

1 - DILUTION DU SOLUTE DANS LA COLONNE ET LIMITE DE

DETECTION

En admettant une repartition gaussienne du solute dans V eluant a la sortie de la

colonne, la concentration maximale du solute Cmax est donnee par la relation suivante

C max [2.1]

avec Q0 la quantite de solute introduite en tete de colonne, O' l’ecart-type du pic d’elution, C0
la concentration du solute dans I’echantillon injecte, V0 le volume injecte.

57
 Si on dispose d’un volume d’echantillon au moins egal a cr et qu’une perte de 10 % due
a l’injecteur seul soil toleree, la relation precedente peut se simplifier[76] [77]

[2.2]

Ceci implique qu’avec les detecteurs a concentration tel que le detecteur UV, la concentration
minimale detectable soit independante du diametre de la colonne (a parcours optique
identique).

Si au contraire, le volume d’echantillon dont on dispose est tres limite, la concentration

maximale du solute Cmax s’exprime par la relation plus complete

[2.3]

Cmax etant inversement proportionnelle a dc2, les microcolonnes entrainent une dilution moindre
nua Iac mlnfinpc rlocotmiAC a miontitp P \7 pfinctuntp [71] [78] [79]
que les colonnes classiques a quantite C0V0 constante1 J1 J1 .
Le gain theorique de sensibilite entre deux separations realisees par deux colonnes (1) et (2) de
meme longueur, remplies de la meme phase stationnaire et d’efficacite similaire peut etre
evaluee par

[2.4]

et les calculs sont presentes dans le tableau 2.2.

58
 de (mm) 4.6 2 1 0.3

augmentation de Cm« 1 5 21 235

Tableau 2.2 : Influence du diametre interieur sur la dilution du solute.

Un gain de sensibilite de l’ordre de 200 est prevu lorsque la separation est realisee avec
une colonne de 300 pm de diametre interieur comparativement a une colonne classique de 4,6
mm de diametre interieur, a condition de minimiser les volumes extra-colonne dans Ie montage.

En conclusion, la concentration au sommet du pic sera d’autant plus grande que le

diametre interieur de la colonne sera petit, a quantite injectee C0V0 identique. D’ou l’interet des
microcolonnes lorsque le volume des echantillons disponibles est limite. D’autre part, la
quantite minimale detectable (C0V0)nun sera d’autant plus faible que le diametre interieur de la
colonne sera petit.

2 - PERFORMANCES DES COLONNES

La performance (ou efficacite) d’une colonne est evaluee par le calcul du nombre de
plateaux N. Dans V expression de N, defini comme etant le rapport de la longueur de la colonne
L par la hauteur de plateau H ou encore le rapport du volume de retention Vr au carre par la
variance de la colonne cr^i, le diametre interieur de la colonne n’intervient pas.
En effet

[2.5]
hd, crL

59
avec h = f(v) et

ou h et v respectivement la hauteur de plateau reduite et la vitesse reduite de la phase mobile,

U la vitesse lineaire de la phase mobile, dp le diametre des particules de la phase stationnaire et
Dm le coefficient de diffusion du solute dans la phase mobile.

Cependant, r expression du nombre de plateau fait intervenir la variance de la colonne,

cette demiere resultant de la dispersion du solute au sein de la colonne.

Dans le cas d’une elution lineaire, l’etalement d’une bande de solute au cours de sa
progression au sein d’une colonne remplie a trois origines111:
- la dispersion des molecules par diffusion longitudinale
-1’existence de "chemins multiples" (anisotropic d’ecoulement)
- la resistance au transfer! de masse dans chacune des deux phases.

La variance totale, egale a la somme des variances des differents mecanismes cites,
verifie la relation suivante :

col V diff.long. transfer! [2.6]

d’ou
[2.7]

- Le terme hdi£f.iong., definit par B/v (B en general proche de 2), traduit la dispersion des
molecules du solute selon l’axe de la colonne. Dans toute bande de solute, il apparait un
gradient de concentration, parallele a l’axe de la colonne, lots de sa migration. II en resulte une
diffusion du solute des regions de fortes concentrations vers celles de faibles concentrations.
Cette diffusion intervient a la fois dans la phase mobile circulant dans et autour des particules
de la phase stationnaire que dans la phase liquide stationnaire tapissant les pores (appelee aussi
phase liquide adsorbee et qui resulte de la fixation de molecules de solvant organique de la
phase mobile a la surface des greffons).

60
- II exists, pour la phase mobile, plusieurs chemins possibles a travers le lit de particules de la
phase stationnaire. Sa vitesse d’ecoulement varie d’un chemin a un autre. II en results une
dispersion du solute dans la phase mobile (figure 2.2). L’anisotropie d’ecoulement s’exprime
par la relation lUcoui = Av1/3, le coefficient A dependant principalement de la regularite de
remplissage et de l’uniformite de la repartition granulometrique de la phase stationnaire
utilises.
- Du fait du mouvement relatif des deux phases (phase mobile, phase stationnaire), l’equilibre
de repartition du solute entre ces deux demieres conduit a 1’existence de deux profils de
concentration du solute. Le profil de concentration du solute dans la phase mobile est toujours
en avance par rapport a celui dans la phase liquids stationnaire, et ce dephasage s’accroit avec
la vitesse reduite v. II results de la limitation de la cinetique du processus d’adsorption-
desorption par diffusion du solute principalement dans la phase liquids stagnante (a 1’interieur
des pores) et la phase liquids stationnaire (figure 2.2). Le terms h^feit est donne par Cv, le
coefficient C representant le "facteur de resistance aux transfert de masse"[1].

61
 iergeur ioifioi* de
la band*

eu sommet de la coionne,
d l*«njection

etalement

Resistance au transfert de masse(C)

Figure 2.2 : Differents facteurs d'etalement des pics d’elution tlJ.

En conclusion, F expression de la hauteur de plateau reduite h en fonction de la vitesse

reduite v est donnee par 1’equation de Knox

h = —+ Av^ + Cv [2.8]
v

Experimentalement, le nombre maximal de plateaux de la coionne est alors calcule

apres determination de hmin a partir des courbes de variation de la hauteur de plateau reduite en
fonction de la vitesse reduite (h=f(v)) sachant que

N max [2.9]
hmindp

62
 2.a - Influence du diametre interieur de la colonne sur son efllcacite

Une comparaison des tw, obtenues pour des colonnes de diflerents diametres interieurs
remplies a partir de phases stationnaires diverses est donnee ci-dessous.

Dans le cas d’un remplissage homogene de la colonne et d’un transfert de masse assez
rapide, les coefficients B, A, C sont respectivement voisins de 2, 1 et 0,1. Par suite, hmm est
compris entre 2 et 2,5.
Dans le tableau 2.3 sont regroupees des valeurs de hmin obtenues pour des colonnes
remplies de diametre interieur inferieur ou egal a 1 mm.
En ce qui conceme les colonnes dont le diametre interieur est superieur a 250 pm, hmm
est compris entre 2 et 4. Les ecarts s’expliquent par l’utilisation de phases stationnaires et des
methodes de remplissage differentes. Ces resultats ne font pas apparaitre une influence du
diametre interieur de la colonne sur la valeur de hmin, c’est a dire sur les performances de la
colonne.
Cependant, on constate une evolution de hmin avec le diametre interieur lorsque celui ci
est inferieur a 250 pm. Elle est identique pour deux etudes realisees avec une phase
stationnaire et une methode de remplissage propre a chacune d’entre elles (tableau 2.3 [8I]’[82]).
On note une diminution de hmm avec une diminution du diametre interieur, qui serait due a une
diminution des coefficients A et C de 1’equation de Knox (tableau 2.4).
- Cette evolution de A peut etre interpretee par un ecoulement plus homogene de la
phase mobile a travers la colonne remplie [811 t82l La presence de deux regions dans le lit de la
phase stationnaire (une region centrale et une region moins dense pres de la paroi)
s’accompagne d’une dispersion des vitesses d’ecoulement de la phase mobile, la vitesse etant
plus elevee pres de la paroi qu’au centre de la colonne. Lorsque le diametre interieur de la
colonne est inferieur a 250 pm, il peut etre envisage la presence d’une seule region. H en
resulte une plus grande homogeneity des vitesses dans le plan parallele a sa section et par
consequent un effet dispersif des solutes par anisotropic d’ecoulement moins important.
- Ce changement de la structure du lit de la phase stationnaire permet aussi d’expliquer
revolution de C I821. La retention du solute prend en compte a la fois I’adsorption par la phase
stationnaire k’ et la penetration dans les pores des particules k”. Lorsque le lit de la phase

63
stationnaire se compose de deux regions plus ou moms denses en particules, les k’ et k” dans
la region proche des parois sont inferieurs aux k’ et k” au centre de la colonne (k’ est
proportionnel au rapport du volume de phase stationnaire par le volume de la phase mobile et
k” est proportionnel au rapport du volume de phase liquide stagnante par le volume de phase
mobile; ces rapports etant plus faibles dans la region moins dense en particules, c’est a dire a
proximite des parois). Une diminution du diametre interieur de la colonne jusqu’a ce que le lit
de phase stationnaire soil homogene sur toute sa section s’accompagnerait d’une diminution
des effets de resistance au transfer! de masse sur l’elargissement de la bande de solute.

colonne phase stationnaire solute hmin ref.

10 x (1 m x 1 mm d.i.) Partisil 20pm alcool benzylique 2 [80]

1m x 1 mm d.i. Zorbax BP Sil 5,6pm toluene 4 [77]

1m x 1 mm d.i. Zorbax BP NH2 7,5 pm toluene 4

30 cm x 1 mm d.i. Zorbax BP Cg 7,3 pm naphtalene 4
1m x 1 mm d.i. Lichrosorb RP Cig 10pm toluene 3

1 m x 265 pm d.i. Spherisorb ODS-2 5 pm 2 methoxy naphtalene 3 [81]

1 m x 167 pm d.i. 2
1m x 44 pm d.i. 1,8

30 cm x 50 pm d.i. Spherisorb Cg 5pm resorcinol 2,4 [82]

30 cm x 42 pm d.i. - 2
30 cm x 21 pm d.i. 1,5

Tableau 2.3 : Comparaison des hmm pour differents diametres de colonne.

64
colonne A B C ref.

1m x 265 pm d.i. 1,7 1,1 0,37 [81]

1 m x 167 pm d.i. 0,71 1,2 0,28

1 m x 44 pm d.i. 0,49 1,4 0,19

30 cm x 50 pm d.i. 0,72 2,75 0,14 [82]

30 cm x 42 pm d.i. 0,52 3,0 0,11

30 cm x 21 pm d.i. 0,40 2,5 0,08

Tableau 2.4 : Coefficients de Vequation de Knox.

En conclusion de ce paragraphe, une diminution du diametre interieur de la colonne de

4,6 mm a 1 mm et merae 500 pm ne semble pas influencer les performances de la colonne.
Cependant, lorsque le diametre interieur devient interieur a 250 pm, une diminution de ce
dernier s’accompagne cette fois ci d’une amelioration sensible des performances de la colonne
qui peut etre expliquee par une repartition radiale des particules de phase stationnaire plus
homogene.

2.b - Obtention de tres grandes eflicacites

Si le remplissage etait parfait, l’efficacite d’une colonne serait proportionnelle a la

longueur (N=L/H). En fait, selon la granulometric de la phase stationnaire choisie, le
remplissage de la colonne est plus ou moins homogene.
Avec des fines particules (5 ou 10 pm), on ne peut remplir actuellement de fa;on aisee
et reproductible que des colonnes ayant une longueur maximale de 50 cm. Par consequent,
lorsqu’un tres grand nombre de plateaux est necessaire pour realiser la separation, la solution
consiste a coupler les colonnes en serie en utilisant des connexions sans volume mort.

65
 Contrairement aux colonnes classiques, les colonnes de petit diametre interieur peuvent
jointes, sans perte d’efficacite, l’efficacite globale etant la somme des efficacites individuelles
de chacune d’entre elles, comme le montre la figure 2.3 et les donnees regroupees dans le
tableau 2.5.

Deux hypotheses ont ete proposees pour expliquer cette linearite entre l’efficacite et la
longueur de la colonne observee avec les microcolonnes. D’une part, la repartition radiale des
vitesses de la phase mobile serait plus homogene sur une faible section que sur une section plus
grande (colonne classique) [77]t80]. D’autre part, la chaleur generee par recoupment de la phase
mobile a travers le lit de phase stationnaire se dissiperait plus rapidement si la section de la
colonne est petite (une elevation de la temperature de la phase mobile et de la phase
stationnaire modifiant les cinetiques d’echanges du solute entre les deux phases et pouvant
s’accompagner d’un elargissement du pic d’elution) [801.

Les exemples suivants, qui presentent les separations d’un melange de polychlorure de
biphenyles (figure 2.4) et d’un melange de phthalates (figure 2.5), illustrent l’interet de mettre
en serie plusieurs microcolonnes afin d’atteindre des efficacites elevees. La resolution
augmentent bien avec la longueur totale, ainsi que la duree de l’analyse.

Enfin, la separation d’un melange complexe est realisable en remplagant plusieurs

microcolonnes associees par une seule microcolonne de longueur identique. Ce procede reste
toutefois peu employe en raison des difficultes de remplissage sur une grande longueur. La
figure 2.6 presente la separation d’une fraction aromatique de goudron de houille. Bien que la
separation sur une colonne de 0,2 mm de diametre interieur et 1 m de longueur ne soil pas
complete, plus d’une centaine de pics sont observes (fig A). Le chromatogramme obtenu avec
une colonne de 5 m est donne ci-dessous (fig B). Sur ce dernier, qui correspond a la premiere
partie du chromatogramme precedent decrit, on note l’amelioration de la resolution.

66
 2

A B

Figure 2.3 : Injection de 1 pi d’un melange de toluene (1), nitrobenzene (2), m-

dinitrobenzene (3) sur colonne remplie avec du Zorbax BP Sil 5,6pm. A : Colonne de 1 m x 1
mm d.i.; Debit liquide : 200 pl/min; N = 10000. B : Colonne de 22 m x 1 mm d.i.; Debit: 15
pl/min; N = 900000-930000. Phase mobile : dichloromethane. Detection UV a 254 ran [77l

67
colonnes longueur totale phase stationnaire solute N ref.

25 cm x 4,6 mm d.i. 25cm Zorbax ODS s-butyl benzene 8645 [83]

50cm 12351
100cm 16120
150cm 20030

50 cm x 1 mm d.i. 50cm 15523

150cm 46392
300cm 92720
450cm 162624

1m x 1 mm d.i. lm Zorbax BP Sil 5,6^un toluene 47000 [77]

2m 89000
6m 268000
22m 914000

Tableau 2.5 : Comparaison des efficacites obtenues par couplage de colonnes en serie.

68
 A B

Temps (min) Temps (min)

Figure 2.4 : Separation d’un melange de polychlorure de biphenyles (PCB) sur colonne
remplie avec du Silica ODS SC-01 5 pm. A : Colonne de 20 cm x 0,25 mm d.i. . B : Colonne
de 2 x (20 cm x 0,25 mm d.i ). Volume d’injection de 0,02 pi. Phase mobile acetonitrile-eau
8/2 (v/v). Debit liquide : 1,4 pl/min. Detection UV a 254 nm[84].

69
 A B

If to

«ar
§

!u

10 20
Temps (min) Temps (min)

Figure 2.5 : Separation d’un melange de phtalates, par chromatographic de permeation

sur gel, sur colonne remplie de TSK-G 1000H 5 pm. A : Colonne de 20 cm x 0,35 mm d.i. . B
: Colonne de 7 x (20 cm x 0,35 mm d.i.). Volume d’injection : 0,02 pi. Phase mobile :
tetrahydrofiaranne. Debit liquide : 1 pl/min. Detection UV a 235 nm. Solutes : phtalate de di-
nonyle (9), phtalate de di-2-ethyl hexyle (8), phtalate de di-heptyle (7), phtalate de di-n-butyle
(4), phtalate de di-n-propyle (3), phtalate de di-ethyle (2), phtalate de di-methyle (1) [84l

70
 ± -L ±
0 1 2 3

Heures

Figure 2.6 : Separation d’une fraction aromatique de goudron de houilie sur colonne
remplie de Develosil ODS 3 pm. A : Colonne de 1 in x 0,2 mm d.i.; Elution a la pression
constante de 250 kg/cm2. B : Colonne de 5 m x 0,2 mm d.i.; Elution a la pression constante de
100 kg/cm2. Volume d’injection : 0,1 pi. Phase mobile : methanol. Detection UV a 254 nm[85].

71
C : SPECIFICATIONS INSTRUMENTALES

Une dilution du solute dans la phase mobile pendant son elution dans la colonne

entrame un elargissement du pic defini par 1'ecart-type de la colonne Ccoi . Or un appareillage

de chromatographic en phase liquide comprend non seulement la colonne mais aussi un
injecteur, un detecteur et des tubes de connexions entre les differentes parties du montage.
Tous ces elements contribuent egalement a l'elargissement du pic chromatographique, ce qui et
se traduit par une perte d’efficacite de la colonne (evaluee par le nombre de plateaux N).

En supposant que le pic chromatographique soit gaussien et que les contributions a

l'elargissement du pic soient independantes les unes des autres, la variance totale du pic
chromatographique CT2^ s'exprime par la somme de la variance due a la colonne (o^oi) et celles

dues aux differents elements du montage : injecteur (cPinj), tubes (cr2tube), detecteur (cr^et).

72
 L’elargissement du pic du a l'injection, aux tubes de connexion et au detecteur
s'accompagne d'une diminution de 1’efFicacite de la colonne, evaluee par la relation suivante :

[2.12]
1+^f-
CTcol

N0te et Neoi correspondant respectivement au nombre de plateaux observe et au nombre de

plateaux de la colonne seule, avec N0bs < Neoi-

Pompe Injecteur Detecteur

Volume
extra-colonne

Solvant Enregistreur

Figure 2.7 : Volume extra-colonne.

En raison des tres faibles volumes mis en jeu en microchromatographie, de l'ordre de

quelques pi pour les colonnes de 1 mm a quelques nl pour les colonnes de 200 pm (tableau
2.6), les effets dispersifs exterieurs a la colonne (ou effets extra-colonne) prennent tres vite une
importance critique. D'ou la necessite, en particulier pour les microcolonnes, de miniaturiser
l'ensemble de l'appareillage, afin de maintenir cf2^ negligeable devant a2^ et de conserver une
bonne qualite de separation.

73
 de (mm) L (cm) dp (pm) Oeol (pl)

4.6 100 10 52
2 100 10 10
1 100 10 2.5
0.2 100 10 0.1
4.6 25 10 26
2 25 10 4.9
1 25 10 1.2
0.2 25 10 0.05
4.6 25 3 14.2
2 25 3 2.7
1 25 3 0.67
0.2 25 3 0.03

Go] est calcule a partir de la relation suivante crcol [2 13]

avec e = 0.70 et h = 2

Tableau 2.6 : Ecart-type de la colonne calcule au temps de retention d’un compose incite.

Les differentes contributions extra-colonne peuvent etre evaluees (en unite de volume)
de la fagon suivante :

- L'injection d'un volume V0 sous la forme d'un creneau parfait conduit a une variance egale a
Vo^/12

- Un tube de connexion provoque un elargissement du pic dont la variance est donnee par
* ;;d?LtP
384 D.

en supposant l'ecoulement laminaire, dt correspondant au diametre interieur du tube, Lt a la

longueur du tube, D au debit de la phase mobile, Dm au coefficient de diffusion moleculaire du
solute dans la phase mobile.

74
- Enfin, le detecteur contribue aussi a l'elargissement du pic pour deux raisons.
La cellule de detection represente une chambre de melange de volume Va caracterisee par une
variance egale a Va2/12

De plus, la constante de temps electronique t du detecteur produit une variance temporelle

egale a T2 (en unite de temps) et egale a D2T2 (en unite de volume).

Dans la pratique, 1'injection d’un microvolume sous la forme d’un creneau parfait est
difficilement realisable. De plus, des changements de diametre a l'entree et la sortie de la cellule
de mesure peuvent entrainer a l’interieur de cette demiere des turbulences d’ecoulement de
l'eluant. Les variances d'injection et de detection sont plutot de l'ordre de V02/4 et Vd2/6
respectivement.

Compte tenu de la precision avec laquelle les nombres de plateaux N sont generalement
estimes, une perte de 20 % due aux effets extra-colonne parait tout a fait acceptable. HMenet
a ainsi calcule les volumes d'injection et de la cellule de detection limites, a ne pas depasser
pour conserver une bonne qualite de separation, a partir du raisonnement suivant[761 [7T!.
Soient No, le nombre de plateaux de la colonne seule et N0t» le nombre de plateaux
observes

[2.14]
°"col

y 2 v 2
Nobs = f— = f— [2.15]
o-tot crtot
en admettant que VR le volume de retention observe est peu different de Vr le volume de
retention de la colonne seule.
Pour une perte d’efficacite de 20 % due aux effets extra-colonne, on en deduit alors

f^L= crcoi+cr«t =l20 [2.16]

O^col o-=oi

2
c'est a dire —f5- = 0,20
co,

75
 Pour une perte d’efficacite de 10 % due a l'injecteur seul, on a dans le cas le plus
favorable
1 V
—- x —f— = 0,10
12 <4,

SOlt V0 # CTeol [2.17]

Et pour une perte d’efficacite de 10 % due au detecteur seul, on a dans le cas le plus
favorable
V2
x —= 0,10
12 Cool

soit Vd # Geoi [2.18]

En conclusion, le volume injecte V0 et le volume de la cellule de detection Vd doivent

etre au plus egaux a l'ecart-type de la colonne [761 [77], de l'ordre de quelques pi pour les
colonnes de 1 mm a quelques nl pour les colonnes de 200 pm (tableau 2.6). II existe dans le
commerce des vannes d'injection a boucle interne de 60 nl. De nouvelles cellules de mesure ont
ete developpees, en particular pour la detection UV, en cherchant le meilleur compromis entre
une efficacite maximale (c'est a dire une dispersion extra-colonne minimale) et une sensibilite
correcte (fonction du parcours optique en detection UV). Citons a titre d’exemple les cellules
"on-column" et en forme de Z.

1- INJECTION

Afin de conserver une efficacite maximale, le volume d’injection ne doit pas etre
superieur a l’ecart-type de la microcolonne. Par consequent, ce dernier est de l’ordre du nl (pi
pour une colonne de petit calibre) (tableau 2.6). Differents modes d’injection ont ete
developpes pour ce type de chromatographic dont les principaux sont les vannes d’injection
avec des microvolumes, le debit divise entre la vanne d’injection et la colonne, et le
raccordement direct a la colonne d’un tube contenant l’echantillon a injecter.

76
 - Les vannes d’injection avec des microvolumes de 0,02 jj.1 a 1 jj.1 sont aujourd’hui
commercialisees. Pour les plus petits volumes, des vannes a quatre voles et a boucle interne ont
ete developpees; le volume d’injection etant defini par l’epaisseur de la gravure dans le rotor de
la vanne. Avec ce mode d’injection et les volumes d’echantillon tres faibles mis en jeu,
minimiser le volume mort du au tube de connexion place entre la vanne d’injection et la
colonne s’avere indispensable, afin de conserver de bonnes performances chromatographiques.
Scott et Kucera ont resolu cette difficulty en branchant directement la colonne dans la vanne
d’injection (figure 2.8) [801.

Figure 2.8 : Branchement direct d’une colonne dans la vanne d’injection[801.

- Le principe de l’injecteur a "debit divise" est decrit sur la figure 2.9. Une fraction
seulement du volume d’echantillon est introduit dans la colonne [86l Elle est definit par le
rapport DJD avec De le debit dans la colonne et D le debit dans la boucle d’injection. A noter
que ce mode d’injection est incompatible avec Vanalyse de tres petits volumes d’echantillon.

- Le troisieme mode d’injection, mis au point par Ishii et al., est presente sur la figure
2.10. Initialement, ils essayerent d’injecter des volumes de 50 a 500 nl en tete de colonne a
1’aide d’une microseringue. Cependant, l’echantillon se dispersait une fois 1’aiguille de la
seringue retiree (le diametre exterieur de 1’aiguille n’etant pas negligeable en comparaison du
diametre interieur de la microcolonne). Ils developperent alors une technique d’injection
appelee "on-column" dont le principe est le suivant [871 : Une fois le volume d'echantillon

77
preleve, le tube porte-echantillon est raccorde directement a la microcolonne puis balaye par la
phase mobile. Cette methode permet d'injecter des volumes d'echantillon de 40 nl.

introduction
de l'echantillon

solvant
poubelle

vers la colonne

Figure 2.9 : Injection avec "debit divise"[86].

A R j

Figure 2.10 : Injection par la technique dite "on-column". A,R : aspiration, refoulement;
1 = reservoir de phase mobile; 2 = tube porte-echantillon; 3 = echantillon; 4 = phase mobile; 5
= laine de quartz, 6 = phase stationnaire; 7 = microcolonne. Operations : (1) aspiration de la
phase mobile; (2) aspiration de l’echantillon; (3) aspiration de la phase mobile; (4) connexion
du tube porte-echantillon a la microcolonne, puis refoulement de l'echantillon dans la colonne
[87]

78
 Cependant, Vinjection de volumes d’echantillon plus importants sans perte d’efficacite
reste envisageable en jouant sur les forces eluantes du solvant d’echantillonnage (Sech) et de la
phase mobile (smob). En effet, si Vechantillon est dissout dans un solvant de force eluante plus
faible que celle de la phase mobile (sech < emob) les solutes sont pieges en tete de colonne
pendant toute la duree de f injection, empechant leur dispersion et un elargissement des pics
chromatographiques. Par cet "effet de compression", il devient possible d'injecter des volumes,
dont la valeur maximale Vi est estimee a partir de la relation

1 + k'/
1 + k'J [2.19]

ou k’„ correspond au facteur de capacite du solute elue avec le solvant d’echantillonnage, et k’

au facteur de capacite du solute elue avec la phase mobile l79]. A 1’exception des solutes peu
retenus (par exemple les solutes polaires en chromatographic de partage a polarite de phases
inversee), l'injection de volumes jusqu'a 100 fois plus importants que l’ecart-type de la colonne
ne s'accompagne pas d'une perte d'efficacite. A titre d'exemple, la figure 2.11 presente la
separation d’un melange de benzodiazepines realisee avec une microcolonne de 320 pm de
diametre interieur et 15 cm de longueur, pour un volume d’injection de 20 pil791.

79
(a) (b) A
A

□
BC
E

bruit x 30 bruit x 30

8C D E F
jiA_jLa_______ a.
I-------------------- -—I I I I i 1 " 1 I
0 5 10 15 20 0 S 10 15 20

Temps (min) Temps (min)

Figure 2.11: Separation d’un melange de benzodiazepines contenus dans un extrait de

plasma humain sur microcolonne remplie (a). Colonne de 15 cm x 320 pm d.i. remplie de Ci* 3
pm. Volume d’injection : 20 pi. Phase mobile : acetonitrile-methanol-tampon phosphate 0,01
M 35/10/55 (v/v/v). Solvant d’echantillonnage : acetonitrile-tampon phosphate 0,01 M 15/85
(v/v) (Sech < Smob). Debit liquide : 6 pl/min. Detection UV a 313 nm. Comparaison avec une
colonne classique (b). Colonne de 15 cm x 4,6 mm d.i. remplie de Cig 5 pm. Solvant
d’echantillonnage : acetonitrile-methanol-tampon phosphate 0,01 M 35/10/55 (v/v/v). Debit
liquide : 800 pl/min. Autres conditions identiques (Sect, = 8mob). Solutes : carbamazepine (A),
nitrazepam (B), clonazepam (C), flunitrazepam = etalon interne (D), nordazepam (E),
diazepam (F) t79].

80
 Des precolonnes adaptees aux dimensions des microcolonnes ont egalement ete
developpees. En general, elles sont utilisees pour concentrer les solutes avant leur elution dans
la colonne analytique. Si plusieurs precolonnes, remplies de phases differentes, sont placees en
serie par 1’intermediate de vannes multivoies, un premier fractionnement des solutes en
grandes families (par exemple solutes ioniques, solutes polaires, solutes peu polaires) a lieu
pendant l’injection de l’echantillon. Les precolonnes sont ensuite couplees a tour de role a la
colonne analytique qui separe les constituants de chacune des fractions. La premiere
precolonne peut aussi jouer le role de "filtre" en piegeant une grande partie des interferences.
L’exploitation du chromatogramme obtenu a partir de la fraction retenue par la seconde
precolonne devient plus facile et rend possible un dosage quantitatif.
Les dimensions des microprecolonnes ainsi que des volumes d’echantillons injectes sont
indiques dans le tableau ci-dessous. Plusieurs centaines de pi a quelques ml de solution peuvent
etre ainsi concentres sur la microprecolonne. Par la suite, 1’analyse est effectuee selon les
methodes "off-line" ou "on-line".

microprecolonne microcolonne analytique volume ref.

d’echantillon traite

15 mm x 0,35 mm d.i. 170 mm x 0,5 mm d.i. 1-10 ml [88]*

3-12 mm x 0,1-0,2 mm d.i. 10 cm x 0,12 mm d.i. 0,1-1 ml [89] *
2 cm x 0,5 mm d.i. 15 cm x 0,5 mm d.i. 0,1 ml [90]
10 mm x 0,2 mm d.i. 20 cm x 0,26 mm d.i. 0,1 ml [91]*
27 mm x 0,34 mm d.i. 100 mm x 0,34 mm d.i. 0,7 ml [92]
5 mm x 1 mm d.i. 20 cm x 1 mm d.i. 0,1 ml [93]
(* pour "off-line")

precolonne colonne analytique volume

conventionnelle d’echantillon traite

1 cm x 2,1 mm d.i. 15 cm x 4,6 mm d.i. 50-500ml [94]

2-4 mm x 4,6 mm d.i. 25 cm x 4,6 mm d.i. 5ml [95]

Tableau 2.7 : Dimensions de precolonnes et volumes d’echantillon traites.

81
 1

(A) (B)

Figure 2.12 : Schema d’une microprecolonne (A) et de sa connexion avec la

microcolonne analytique (B). 1 = introduction de 1’echantillon; 2 = tube de connexion en
teflon; 3 = microprecolonne (15 mm x 0,35 mm d.i.); 4 = tube en acier inoxydable; 5 = phase
stationnaire; 6 = laine de verre; 7 = microcolonne (170 mm x 0,5 mm d.i.) f88l

(A) (B)

eau

phase ( ^longueur
microprecolonne ire V i
stationnaire
echantillon
colonne

poubelle —-J'
1.1 mmdi 1/16die.
-------- 0.17mznd.i. 1/16 d.e.

Figure 2.13 : (A) Montage d’une analyse "on-line" avec preconcentration de

1’echantillon avant sa separation par une colonne de petit calibre. (B) Schema de la precolonne
[93]

82
 2 - SYSTEME DE POMPAGE

Les debits de phase mobile compatibles avec les microcolonnes se situent entre 0,1 et
100 pl/min selon le diametre interieur de la colonne (tableau 2.1). A titre de comparaison, les
separations avec les colonnes conventionnelles sont realisees avec des debits de 500 pl/min a 1
ml/min.

2.a - Elution isocratique

Si la majorite des pompes commercialisees fonctionne convenablement pour des debits

de 50 a 100 pl/min, des difficultes operatoires peuvent apparaitre a quelques pl/min; en
particular pour les modeles de pompe alternative a clapets. Ces problemes sont resolus en
plagant un diviseur de debit entre la pompe et la vanne d’injection (figure 2.14). La pompe
opere alors dans des conditions normales de fonctionnement. Dans le cas d’une separation par
elution isocratique, la partie de phase mobile device du systeme chromatographique peut etre
recuperee. Les pompes seringues ofirent l’avantage de fonctionner a des debits tres faibles de
quelques pl/min en V absence de pulsation.

recyclage

pompe diviseur injecteur

detecteur
microcolonne

Figure 2.14 : Installation d’un diviseur de debit en elution isocratique[961.

83
 Dans le cas du montage decrit sur la figure 2.14, la division de Veffluent est realisee au
moyen de deux tubes capillaires vides (1) et (2), l’un deux presentant une resistance elevee a
l’ecoulement de la phase mobile. Une estimation de leurs diametres interieurs et de leurs
longueurs est possible a partir de la relation de Poiseuille qui determine le debit D de la phase
mobile a travers un tube de rayon r et de longueur L

7rAPr4
[2.20]
8Lt/

avec Ap la perte de charge a travers le tube et r| la viscosite de la phase mobile. Le rapport des
debits a travers les deux capillaires peut etre alors evalue a partir de

D, fr,)4 (lA
-M
R = —L = LrJ [2.21]
d2 Ll, J

A noter que debit mesure en sortie de colonne est inferieur a celui mesure directement en sortie
du diviseur, en raison de la resistance a 1’ecoulement supplemental apportee par la colonne
remplie qui n’est pas prise en compte dans ce calcul tres simplifie.

2.b - Elution par gradient de solvant

Les gradients d’elution permettent de separer les composes d’un melange complexe sur
une echelle de temps limitee. Les principaux modes de gradient d’elution mis au point avec les
microcolonnes peuvent se diviser en trois grandes categories :
- gradient par paliers
- gradient continu non lineaire, de type exponentiel
- gradient continu lineaire

84
 Des gradients d’elution par paliers sont realisables a l’aide d’une seule pompe
chromatographique. La figure 2.15 presente un montage mis au point avec 2 vannes a 6 voies
t97]. Avant rinjection de l’echantillon, la colonne analytique est equilibree avec la phase mobile
de faible force eluante et les boucles (a) et (b) sont remplies de leurs eluants respectifs; eluant a
et eluant b (force eluante a < force eluante b). Apres rinjection, la force eluante de la phase
mobile dans la colonne augmente une premiere fois par permutation de la vanne (a), puis une
seconde fois par permutation de la vanne (b). Pour des separations difficiles necessitant un plus
grand nombre de paliers, ce meme montage peut etre encore utilise; pendant que 1’eluant d’une
des deux boucles passe a travers la colonne, I’autre boucle est remplie d’un eluant de force
eluante superieure, et ainsi de suite. La figure suivante presente un montage mis au point avec
une seule vanne a plusieurs boucles, chacune d’entre elles etant remplies par des eluants de
force eluante plus ou moins forte[9S1.

5(a) 5(b)

Figure 2.15 : Schema d’un montage pour gradient d’elution par paliers avec deux
vannes. 1 = eluants; 2 = pompe; 3 = poubelle; 4 = vannes, 5 = boucles; 6 = echantillon; 7 =
microvanne d’injection; 8 = microcolonne; 9 = detecteur; 10 = cellule de mesure [97].

85
 1

Figure 2.16 : Schema d’un montage pour gradient d’elution par paliers avec une vanne
multi-position. 1 = pompe; 2 = vanne multi-position; 3 = microvanne d’injection; 4 =
microcolonne; 5 = detecteur[98J.

D’autres formes de gradient d’elution ont ete mis au point, toujours avec une seule
pompe chromatographique, tel que le gradient d’elution exponentielle dont un montage est
donne sur la figure 2.17 [991 [100] ll01l Initialement, la phase mobile de faible force eluante
delivree par la pompe traverse la chambre de melange (6) avant de penetrer dans la colonne et
la boucle (4) est remplie d’un eluant de force eluante elevee. Apres l’injection de l’echantillon,
le gradient d’elution est amorce par permutation de la vanne (3). La composition (et par suite
la force eluante) de la solution emergeant de la chambre de melange varie exponentiellement.
Une fois la separation terminee, la colonne est rincee par permutation de la vanne (5).

86
 Figure 2.17 : Schema d’un montage pour gradient d’elution exponentielle. 1 = de la
pompe; 2 = vanne a trois voies; 3 et 5 = vannes a six voies; 4 = boucle; 6 = chambre de
melange; 7 = microvanne d’injection; 8 = reservoir pour le solvant de force eluante elevee; 9 =
vers la microcolonnefl01].

En supposant que les variations de volume resultant du melange de deux solutions de

composition differente soient negligeables, les debits d’entree et de sortie sont identiques. La
variation de la composition de la solution sortant de la chambre de melange Ct s’exprime par la
relation

ct - c2 -(C2 - Ct)exp( - — t [2.22]

ou C2, Ci expriment respectivement la composition de la solution de forte force eluante, la

composition de la solution initialement dans la chambre de melange. D est le debit liquide, V
est le volume de la chambre de melange, t est le temps ecoule depuis le debut du gradient1991
[100]

La chambre de melange peut etre remplacee par un tube capillaire enroule en forme de spirale
[102]. Le montage est presente sur la figure 2.18. Initialement, les deux capillaires (1) et (2)
(avec d.i.(l) < d.i.(2)) sont remplis par le solvant final (A) de force eluante elevee. Apres
permutation de la vanne (3), un volume connu de solvant initial (B) de faible force eluante est
introduit dans la boucle de melange par l’extremite b, tandis que le solvant (A) delivre par la
pompe est dirige directement vers la microcolonne. Le melange des deux solvants se fait dans

87
le capillaire (I). Une fois 1’echantillon injecte, le gradient est amorce par permutation de la
vanne (3). La separation commence par une elution isocratique de faible force eluante dont la
duree peut etre ajustee par le volume de solvant (B) introduit dans la boucle de melange (ou
encore par les dimensions du capillaire (2)).

Figure 2.18 : Schema d’un montage pour gradient d’elution exponentielle ou le

melange des solvants est realise dans un tube en forme de spirale. 1 = tube en forme de spirale
(80 cm x 0,1 mm d.i.) servant de chambre de melange; 2 = tube enroule (200 cm x 0,25 mm
d.i.) servant a ajuster la duree d’elution isocratique avant le debut du gradient; 3 = vanne a 6
voies; 4 = pompe delivrant le solvant final; 5 = pompe delivrant le solvant initial; 6 = sortie vers
l’injecteur; 7 = poubelle; a et b extremites de la boucle de melangetl02l

Des gradients avec deux pompes chromatographiques (ou plus) presentent l’avantage
d’une plus grande flexibility pour modifier le profil du gradient en jouant sur les conditions
initiales ou finales de la phase mobile, la duree du gradient, le type de gradient (gradient
lineaire ou par paliers). Des modifications apportees sur les appareillages deja utilises en
chromatographic classique, telles que la modification de la vitesse du deplacement du piston et
la reduction du volume du melangeur (statique ou dynamique) ont permis de realiser des
gradients a des debits compatibles avec les microcolonnes nositioanios]

88
 Lorsque la separation est reatisee avec des colonnes de diametre interieur inferieur a
500 pm, la division du debit de phase mobile entre le melangeur et l’injecteur reste encore
aujourd’hui un bon compromis entre la simplicity et 1’efficacite dans la mise au point d’un
gradient d’elution 1961 11061, les pompes chromatographiques fonctionnant a des debits de 30 a
500 pl/min. Le montage classique est presente sur la figure 2.19.

poubelle

pompe A
melangeur
injecteur
diviseur detecteur
microcolonne
pompe B

Figure 2.19 : Installation d’un diviseur de debit en gradient d’elution1961.

3 - Detection

En microchromatographie, le volume de la cellule de detection doit etre de quelques nl

(quelques pi pour les colonnes de petit calibre) (tableau 2.6). De nombreux modes de detection
sont decrits dans la litterature tels que la detection UV1861 [107), la detection fluorometrique11081
l1091, la detection electrochimique 11101 1111]. L’utilisation de reaction post-colonne a egalement
ete rapportee 1112111131 [1141. Les faibles debits de phase mobile, plus particulierement pour les
colonnes de diametre interieur inferieur ou egal a 500 pm, rendent possible un couplage direct
avec un spectrometre de masse 1115111161111711118]. Enfin, il est envisageable de placer plusieurs
detecteurs en sene, et d’obtenir ainsi des informations complementaires qui facilitent
1’identification de composes dans un melange complexe. Trois detecteurs (UV, fluorescence et

89
ES-MS) ont ete places en sene a la sortie d’une colonne de 500 pm de diametre interieur pour
V analyse de peptides et proteines [U9l Plus de details concemant les generalites sur les
couplages LC/MS, ainsi que la description du fonctionnement de la source ES, sont donnes
dans les chapitres 1A et IB.

Le detecteur UV est le mode de detection predominant en chromatographic liquide.

Cependant, des modifications doivent etre apportees a la cellule de mesure afin de pouvoir
l’utiliser en microchromatographie. Nous rappelons que P absorbance A est proportionnelle au
parcours optique 1 de la cellule d’apres la relation de Beer Lambert

A(X) = S(X)d [2.23]

La figure 2.20 et le tableau 2.8 illustrent, pour une separation d’un melange de PAHs
sur une colonne de 320 pm de diametre interieur, V influence du volume de la cellule de
detection ainsi que la longueur du parcours optique sur la resolution et la sensibilite.
L’utilisation de cellules de 3,3 nl et 60 nl n’entrainent pas de variations notables de resolution
et d’eflBcacite (chromatogrammes a et b). La meilleure sensibilite obtenue avec la cellule de 60
nl s’explique par un plus grand parcours optique (320 pm pour la cellule de 60 nl contre 75 pm
pour la cellule de 3,3 nl). Par contre, avec une cellule de 300 nl, il est observe une perte
import ante de resolution (chromatogramme c). En conclusion, avec les colonnes de diametre
interieur interieur a 500 pm, les cellules de detection de volume superieur a 100 nl contribuent
a une dispersion extra-colonne bien trop importante, compte tenu des faibles volumes dans
lesquels sont elues les solutes (tableau 2.8).

90
 (a)
0.01 UAPE

ILL
—r~
10

Temps (min)

3,3 nl 60 nl 300 nl

Figure 2.20 : Comparaison des performances de trors cellules de detection sur la

separation d’un melange d’hydrocarbures polyaromatiques : benzene (0,03 mg/ml), naphtalene
(0,79 mg/ml), biphenyle (0,67 mg/ml), fluorene (0,12 mg/ml), anthracene (0,15 mg/ml),
fluoranthene (0,40 mg/ml). Colonne de 15 cm x 320 pm d.i. remplie de RP-18 3 pm. Volume
d’injection : 60 nl. Phase mobile : acetonitrile-eau 70/30 (v/v). Debit liquide : 3 pl/min.
Detection UV a 254 nm. Description de ces cellules (voir le schema de la figure 2.21) [120l

91
 Cellule standard Cellule capillaire

volume 300 nl 60 nl 34 nl 3,3 nl

parcours optique = 1 3 mm 320 pm* 240 pm* 75 pm*'
connexion
entree de la cellule (pm) 75 75 75 75
sortie de la cellule (pm) 50 50 50 75
configuration longitudinale perpendiculaire
S/N** 4,46 0,187 0,141 0,024

cftot (min2)** 224 10-4 110 10"4 / 103 10"4

cr ext (min ) 172,7 10"4 5,4 10*4 / 3,4 I0"4

CText (nl) 394,2 69,3 / 56,7

* egal an diametre interieur du capillaire auquel est enleve le revetement de polyimide

’ le capillaire en sortie de colonne sert de cellule de detection
** mesure a partir du fluoranthene (k’=3,2)

Tableau 2.8 : Caracteristiques et performances des differentes cellules UV utilisees avec une
microcolonne remplie de 15 cm de longueur et 320 pm de diametre interieur. Conditions
experimentales identiques a celles de la figure 2.20 [120].

faisceau revetement de
colie
polyimide

capillaire d'entree restricteur (50 pm)

(75 pm)

Figure 2.21 : Construction des cellules de detection capillairestl20].

92
 La miniaturisation de la cellule de detection, soit par reduction du parcours optique,
soit par reduction du diametre interne, s’accompagne d’une diminution du rapport signal/bruit.
En effet, dans le premier cas, le signal diminue en accord avec la loi de Beer Lambert (le bruit
restant constant). Dans le second cas, le bruit de fond augmente en raison de 1’augmentation de
la reflexion ainsi que de la refraction du faisceau lumineux. D’autre part, la quantite de lumiere
qui traverse la cellule diminue.
Des cellules de detection pour microcolonnes sont aujourd’hui commercialisees. Deux
types de cellules specifiques aux colonnes de diametre interieur inferieur a 1 mm, qui ont ete
developpees en cherchant le meilleur compromis entre une efficacite maximale (c’est a dire une
dispersion extra-colonne minimale) et une sensibilite correcte, sont decrites par la suite.

La solution simple pour eliminer les connexions colonne-detecteur et limiter le volume

mort du a la cellule de mesure est de construire cette demiere en retirant sur quelques mm le
revetement de polyimide servant a proteger le tube en silice fondue (figure 2.22). Le parcours
optique est alors egal au diametre interieur de la colonne (on emploie le terme de cellule "on-
column") [861. Ce type de cellule, de quelques nl de volume, conduit au minimum de dispersion
extra-colonne mais ne permet pas d’atteindre les sensibilites obtenues avec les cellules en
forme de Z ou de U [107J. Ces demieres se caracterisent par un parcours optique de plusieurs
mm pour un volume de quelques dizaines de nl seulement (figure 2.23). Par ailleurs, les
dispersions des solutes dans ces cellules sont aussi negligeables que dans les cellules capillaires
de 3,3 nl et 60 nl decrites precedemment (voir tableau 2.9 et figure 2.24).

93
 Phase stationnaire

Optique de Frtttf
convergence

Source de
lumiere Photodetecteur

Monodiroraateur

Figure 2.22 : Cellule "on-column"[86].

optique

Figure 2.23 : Cellule enZ[1071.

94
 B

3 5

// -aJu VJ V.

I-----1----- 1---- 1— H
0 4 8 12 min 0 4 a 12

Figure 2.24 : Comparaison des performances entre une cellule capillaire de parcours
optique 75 pm (A) et une cellule en forme de Z de parcours optique 20 mm (B) sur la
separation d’un melange d’hydrocarbures polyaromatiques. Colonne de 15 cm x 320 pm d.i.
remplie de ODS 3 pm. Volume d’injection : 60 nl. Phase mobile : acetonitrile-eau 70/30 (v/v).
Debit liquide : 3 pl/min. Detection UV a 254 nm (0.1 UAPE). Solutes : benzene (0,03 mg/ml),
naphtalene (0,79 mg/ml), biphenyle (0,67 mg/ml), fluorene (0,12 mg/ml), anthracene (0,15
mg/ml), fluoranthene (0,40 mg/ml) [I07].

cellule parcours optique volume Oext

(pm) (nl) (nl)

cellule capillaire 1 75 3,3 56,7

cellule capillaire 1 320 60 69,3
cellule en Z2 20000 90 60
1- voir figure 2.21 et tableau 2.8 pour leur description
2- d.i. = 75 pm

Tableau 2.9 : Comparaison entre 3 cellules UV utilisees avec une microcolonne remplie de 15
cm de longueur et 320 pm de diametre interieur. Conditions experimentales identiques a celles
de la figure 2.24 tl07l

95
 4 - COUPLAGE LC/ESI/MS

Dans ce chapitre, nous aliens presenter les solutions techniques decrites dans la
litterature pour faciliter le couplage de la chromatographic liquide avec le spectrometre de
masse equipee d’une interface electrospray. Nous nous limiterons aux experiences realisees
avec des colonnes de diametre interieur inferieur ou egal a 1 mm.

Bien que la majorite des applications soient realisees avec des colonnes
conventionnelles, un certain nombre d’articles decrivent le couplage avec des microcolonnes,
avec des separations par elution isocratique 1121-1271 ainsi que par gradient d’elution 1741 11191 [I28'
1361 et meme pour des colonnes de diametre aussi petit que 75 pm[1371[138] ou 50 pm11391 tl40].

Avec des colonnes de diametre superieur a 500 pm, et en absence d’assistance

pneumatique, le debit liquide est reduit en sortie de colonne 11191 11221 1128l Lorsque la source est
equipee d’une assistance pneumatique, la totalite de l’effluent est introduit dans le
spectrometre de masse [I21] 11231 11291 11301. L’interet du nebuliseur pneumatique, lorsque la
separation est obtenue par gradient d’elution, est de produire un spray moins dependant de la
nature de la phase mobile et par consequent plus stable pendant toute la duree de V analyse.

Pour des debits liquides inferieurs a 10 pl/min, les piincipales difficultes sont
rencontrees lorsque la tension superficielle et/ou la conduct!vite electrique de la phase mobile
sont elevees. Ces conditions sont rencontrees principalement gradient d’elution, mais aussi
parfois en elution isocratique. DifFerentes solutions a ce probleme sont decrites dans la
litterature.
Avec un nebuliseur constitue de deux capillaires concentriques, il est possible de modifier la
composition de l’effluent chromatographique a 1’extremite de l’aiguille de nebulisation sans
entrainer de perte en resolution chromatographique. Un solvant organique (ou melange de
solvants) de faible tension superficielle, le plus souvent du 2-methoxyethanol, du methanol, de
1’acetonitrile, de I’isopropanol ou un melange de 2-methoxyethanol-methanoI (ou acetonitrile)
ou encore 2-methoxyethanol-isopropanol est introduit par le capillaire exterieur. En se

96
melangeant a Veffluent chromatographique a Vextremite du nebuliseur, la tension superficielle
et/ou la conductivity electrique de la solution diminue112711128111321. La meilleure nebulisation de
la solution s’accompagne d’une augmentation de sensibilite. L’ajout du modificateur pent se
faire egalement en sortie de colonne dans une chambre de melange[1351.
L’efficacite des vibrations mecaniques a aussi ete demontree dans le cas de nebulisation de
phase mobile de tension superficielle eleveeI?41.
Enfin, en rabsence d’assistance a la nebulisation, il semble possible d’optimiser manuellernent
la tension de source, au cours d’une separation par gradient, en controlant l’intensite mesuree a
Vextremite du capillaire d’introductiontll£>1.

Pour des debits liquides inferieurs a 1 pl/min, l’ajout d’un solvant par l’intermediaire
d’un second capillaire concentrique au capillaire de nebulisation est indispensable pour obtenir
une nebulisation stable et une bonne efficacite d’ionisation. Le solvant est rajoute de telle fagon
que le debit total a Vextremite du nebuliseur soit de quelques pl/min, afin de se trouver dans les
conditions optimales de nebulisation 11371 tl38]. Enfin, en diminuant le diametre interne du
capillaire de nebulisation (50 pm et moins), les conditions optimales de nebulisation ont ete
determinees pour des debits liquides compris entre 0,1 et 1 pl/min, debits compatibles avec des
microcolonnes de diametre inferieur a 100 pm. Ainsi, l’ajout de solvant, qui s’accompagne
inevitablement d’une dilution des solutes et done d’une baisse de sensibilite, n’est plus
ndcessairel13^13*"1*1.

97
 CHAPITRE 3

OBJECTIF DE NOTRE ETUDE

98
 INTRODUCTION

Quelle que soit la provenance de 1’eau, eau de surface ou eau souterraine, elle contient
des composes inorganiques et organiques dissouts, ainsi que de la matiere particulaire et
colloidale. Les substances chimiques organiques sont d’origine naturelle (sucres, glycols,
acides amines, acides gras et substances humiques) et synthetique : ces demieres proviennent
principalement des effluents domestiques, agricoles et industriels rejetes soit directement dans
les eaux usees, soit indirectement par ruissellement jusqu’aux eaux souterraines. Certaines
substances ne sont que partiellement eliminees au cours du traitement de potabilisation de
l’eau. Leur toxicite eventuelle, ainsi que celle de leurs metabolites, constitue un risque potentiel
pour la population. II est done necessaire de developper des methodes d’analyse permettant
leur identification et leur quantification.

1 - TRAITEMENT DE L’EAU - CONTROLE DE LA QUALITE DE L’EAU

DESTINEE A LA DISTRIBUTION

L’eau brute n’est pas directement utilisable pour la consommation humaine et un

traitement s’avere le plus souvent indispensable. Le but de celui-ci est de produire une eau
depourvue d’odeur, de saveur et ne presentant aucun danger pour la sante de 1’homme a court
et a long terme. La chaine de traitement comprend une suite d’etapes dont le nombre varie
avec la qualite de l’eau prelevee, et peut aller d’une simple disinfection a une sequence tres
complexe. Pour des eaux de surface de qualite moyenne, le traitement comprend quatre etapes
principals :
1) Une elimination des corps flottants et des particules en suspension, d’abord
par une decantation naturelle suivie d’une operation de degrillage et d’un tamisage (les mailles
du tamis sont comprises entre 0,5 et 2 millimetres).
2) Une preoxydation au chlore gazeux et/ou par ozonation a la fois pour
desinfecter et pour oxyder les composes mineraux (manganese, ammoniaque, etc...) et
organiques.

99
 3) A ce stade des operations, il ne reste plus dans 1’eau que des particules tres
fines. La plupart du temps, il s’agit d’argiles. Ces argiles, chargees negativement d’electricite
statique, se repoussent. Elies restent en suspension stable et ne decantent pas. Apres un ajout
de sulfate d’alumine pour favoriser la coagulation des particules d’argiles, un brassage lent
pour augmenter la vitesse de sedimentation et une decantation, l’eau devient relativement
limpide.
4) Pour finir, l’eau est filtree sur sable fin pour eliminer les demieres particules
fines, desinfectee par ozonation et/ou chloration et enfin filtree sur charbon actif. Dans cette
demiere etape, le chlore a l’avantage de prolonger l’effet disinfectant pendant environ 48
heures, protegeant l’eau de toute contamination ulteneure dans le reseau de distribution.

Selon les normes europeennes, une soixantaine de parametres sont pris en compte pour
evaluer la qualite de l’eau en amont de sa distribution. Ces parametres sont regroupes sous
cinq rubriques :
- les parametres organoleptiques concemant la saveur, la couleur, l’odeur et la turbidite
de 1’eau
- les parametres physico-chimiques afin de controler la mineralisation de l’eau
- les parametres concemant des substances indesirables, notamment les nitrates, les
metaux comme le fer, le cuivre,etc. Certains parametres peuvent aussi indiquer une pollution
plus specifique tels que l’ammoniaque ou les matieres organiques.
- les parametres concemant des substances toxiques : micropolluants mineraux et
organiques (metaux lourds, pesticides,...)
- les parametres microbiologiques
Enfin, la directive europeenne precise de plus que l’eau de consommation ne doit pas contenir
de germes pathologiques, en particulier de salmonelles, de staphylocoques, de bacteriophages
fecaux et d’enterovirus.

En ce qui conceme les pesticides et produits apparentes, leurs concentrations dans

l’eau, a la sortie d’une usine de traitement, ne doivent pas depasser 0,1 gg/1 par substance
individualisee a l’exception des substances suivantes : aldrine et dieldrine (0,03 pg/1),

100
hexachlorobenzene (0,01 p.g/1). De plus, la reglementation impose une concentration totale des
substances mesurees inferieure ou egale a 0,5 pg/1.

2 - PESTICIDES ET REGLEMENTATTONS

Un pesticide est defini comme etant toute substance ou preparation utilisee pour lutter
contre des etres vivants nuisibles a 1’homme de fagon directe ou indirecte.
Selon la nature des nuisibles auxquels ils sont destines, les pesticides seront denommes
insecticides, acaricides, nematicides, fongicides, rodenticides ou herbicides (tableau 3.1). Les
pesticides agricoles, tres import ants par la diversite de leur action et de leurs applications
(limiter les irregularites de la production agricole, proteger les reserves alimentaires,
developper les productions locales dans les pays en voie de developpement) ne represented
cependant qu’une partie des pesticides. En dehors de l’usage agricole, certains pesticides sont
largement utilises comme herbicides sur les trottoirs et allees urbaines, ainsi que le long des
routes et des voles de chemins de fer. Le terme general englobe aussi les insecticides utilises
pour detruire les insectes vecteurs de maladies et ceux qui dans nos maisons nuisent a notre
confort, les fongicides qui protegent les bois contre les champignons destructeurs, les
insecticides encore, qui evitent ou limited des degats des insectes du bois ou des charpentes,
etc.

Classe de pesticide Cible visee

insecticide insectes
acaricide acariens, araignees
nematicide vers
fongicide champignons
rodenticide rongeurs
herbicide mauvaises herbes

Tableau 3.1 : Denomination des pesticides en fonction de la cible visee.

101
 Apres utilisation, les pesticides (composes parfois tres toxiques) peuvent se retrouver
en totalite ou en partie dans le sol puis contaminer les eaux de surface ou souterraines. Ds
peuvent aussi etre presents en grande quantite dans les sols ou directement dans les eaux suite
a une pollution accidentelle ou industrielle ou apres un ringage du materiel agricole. Les
pesticides se degradent ensuite plus ou moins rapidement en metabolites, susceptibles eux aussi
d’etre toxiques.

Environ 450 matieres actives sont disponibles aujourd’hui sur le marche, dont a peu
pres 130 herbicides. L’un des pesticides les plus couramment utilises est 1’atrazine, un
herbicide de la famille des s-triazines. Son utilisation massive dans les pays industrialises est
principalement liee a l’essor de la culture de ma'is, dont elle est Vherbicide principal. Les
pesticides sont employes seuls ou en association avec d’autres. A titre d’information, nous
donnerons quelques chiffres concemant leur consommation au cours de ces demieres annees.

consommation mondiale de pesticides en 1980 - de malathion 24 000 tonnes

- d’atrazine 90 000 tonnes
en 1985 -latotalite 5 105tonnes

consommation aux USA en 1982 - d’atrazine > 34 000 tonnes

en 1986 - d’atrazine 36 000 tonnes
- de simazine 2 000 tonnes
- de cyanazine 10 000 tonnes
- de metolachlor 17 000 tonnes

consommation frangaise en 1991 -la totalite 93 000 tonnes

(3”“ marche mondial derriere les USA et le
Japon)

102
 Dans la page suivante sont regroupes les pesticides recherches en priorite, aussi bien
dans une eau souterraine que dans une eau superficielle. A noter le nombre bien plus important
de pesticides presents dans une eau de surface. D’autre part, la majorite de ces pesticides ne
peuvent pas etre analyses en routine par GC/MS.

L’objectif principal de notre etude a ete d’evaluer pour une grande variete de pesticides
(de nature chimique et de polarite tres differentes) les performances analytiques d’un
spectrometre de masse equipe d’une source electrospray, en introduction directe aussi bien
qu’en couplage LC/MS. Le tableau 3.2 rassemble 1'ensemble des pesticides etudies, ainsi que
leur formule brute, leur groupe chimique et les utilisations principals. II comprend trois
families de pesticides (les s-triazines analysables par GC/MS, les carbamates et les phenylurees
thermolabiles) et six pesticides ou metabolites particulars (l’aminotriazole, le glyphosate, le
dinoterbe, l’ion diquat, l’ioxynil, le pyridate CL9673) choisis en raison des difficultes
rencontrees lors de leurs analyses par GC/MS.

Les methodes analytiques les plus couramment utilisees a ce jour pour la recherche de
ces pesticides dans l’eau sont brievement decrites dans les paragraphes suivants.

103
LISTES NATIQNALES DE PESTICIDES PRIORITAIRES POUR LA SURVF.TT.T ANCE DE LA OUALITE
DES EAUX.

Eaux souterraines Eaux superficielles

alachlore * alachlore *
aldicarbe aldicarbe

aminotriazole aminotriazole
atrazine * atrazine *

captane
carbendazime

chlorpyriphos-ethyl

chlortoluron
cyanazine * cyanazine *
cyproconazole
dinoteibe dinoterbe
diquat
diuron diuron
endosulfan * endosulfan *

fenpropimorphe
fluroxypyr

flusilazole *

folpel *
ioxynil ioxynil
isoproturon isoproturon
lindane * lindane *
linuron linuron

methomyl
oxydemeton-methyl oxydemeton-methyl

pendimethaline
simazine * simazine *
terbuthylazine * terbuthylazine *
triallate *

tridemorphe
trifluraline * trifluraline *

L ’asterisque signale que le pesticide est analysable par GC-MS.

104
 Tableau 3.2 : Liste des pesticides et metabolites etudies au cours de cette these.

formule brute M (Da) CAS n° groupe chimique classe de pesticide utilisation

simazine C7H12N5C1 201,1 [122-34-9] s-triazine herbicide mats

desherbage total

ddsherbage sur allees de pares, jardins et trottoirs

rosiers

framboisiers

atrazine c8h14n5ci 215,1 [1912-24-9] mats, sorgho

desherbage total
o ddsherbage sur allees de pares, jardins et trottoirs
Vt

amdtryne C9H17N5S 227,1 [834-12-8] mats

cultures exotiques (ananas, canne 4 sucre,...)

propazine c9h16n5ci 229,1 [139-40-2]

II
cyanazine C9H13N6CI 240,1 [21725-46-2]

II
proindtryne C10H19N5S 241.1 [7287-19-6]

ddsethyl atrazine CeHmNsCl 187,1 metabolite

carbendazime C9H9O2N3 191,1 [10605-21-7] carbamate fongicide

 mdthomyl C5Hio02N2S 162,0 [16752-77-5] insecticide

aldicarbe C7Hi402N2S 190,1 [116-06-3] insecticide, acaricide, nematicide

fdnuron c9h12on2 164,1 [101-42-8] phdnyluree herbicide

monuron c9h„on2ci 198,1 [150-68-5]

isoproturon Ci2Hi8ON2 206,1 [34123-59-6]

chlortoluron C,oH13ON2C1 212,1 [15545-48-9] ble,orge

monolinuron c9h„o2n2ci 214,1 [1746-81-2] pommes de terre

mdtoxuron CioHi302N2C1 228,1 [19937-59-8]

diuron CgH 10ON21CI2 232,0 [330-54-1] vignes, vergers

106

desherbage total

desherbage sur alldes de pares, jardins et trottoirs

buturon C,2H,30N2C1 236,1 [3766-60-7]

linuron c9h,0o2n2ci2 248,0 [330-55-2] pommes de terre

carottes

ndburon Ci2Hi6ON2C12 274,1 [555-37-3] bid

aminotriazole C2E,N4 84,0 [61-82-5] triazole herbicide cdrdales, vignes, vergers, mats

framboisiers

ddsherbage total

ddsherbage sur alldes de pares, jardins et trottoirs

glyphosate c3h8o5np 169,0 [1071-83-6] organophosphore herbicide desherbage total

dinoterbe Q0H12O5N2 240,1 [1420-07-1] phenol herbicide mats

bie

diquat dibromide C,2HI2N2Br2 341,9 [85-00-7] sel d'ammonium herbicide framboisiers

diquat C12H12N2 184,1

ioxynil C7H3ONI2 370,8 benzonitrile herbicide oignons

pyridate C19H23O2N2CIS 378,9 [55512-33-9] phenylpyridazine herbicide

pyridate CL9673 C,oH70N2C1 206,0 metabolite principal
 Les s-triazines sont en general analysees en routine par chromatographie gazeuse
couplee a la spectrometrie de masse (GC/MS) en impact electronique (El) et/ou ionisation
chimique (Cl) en mode positif ou negatif. II est a noter que la chromatographie gazeuse
couplee a la spectrometrie de masse en tandem (GC/MS/MS) offre une meilleure selectivity
ainsi que des informations supplementaires sur les structures des composes recherches. La
chromatographie liquide associee a un detecteur UV (LC/UV) ou un spectrometre de masse
(LC/MS) muni des interfaces thermospray (TS) ou particle beam (PB) en mode MS simple ou
MS/MS est egalement mis en oeuvre pour V analyse de s-triazines, ainsi que la recherche de
metabolites beaucoup plus polaires et thermolabiles (par exemple les derives hydroxyles).

La chromatographie liquide est la methode de separation de choix pour les carbamates

et des phenylurees, qui sont ensuite analyses a l’aide d’un detecteur UV ou d’un spectrometre
de masse equipe d’une interface thermo spray ou particle beam. En eflfet, des degradations
thermiques sont observees pour ces families de pesticides en chromatographie gazeuse. Elies
sont a l’origine de la formation de composes tels que l’aldicarbe nitrile lors de f analyse de
l’aldicarbe, plus generalement des derives hydroxyles et des isocyanates lors de V analyse des
carbamates, des isocyanates et des anilines lors de 1’analyse des phenylurees. Ces produits sont
egalement formes dans le milieu naturel par biodegradation.

Bien que de nos jours, l’ionisation a pression atmospherique soit devenue le mode
d’ionisation le plus populaire pour les couplages LC/MS, les applications concemant
l’environnement sont encore rares. La limitation du debit liquide introduit dans la source
d'ionisation electrospray (ES) en a ete la raison principale, la plupart des separations des
pesticides par chromatographie liquide etant realisees avec des colonnes de 4,6 mm et a des
debits de 500 pl/min a 1 ml/min. La mise sur le marche de la source a decharge couronne
(APCI) devrait faciliter le couplage LC/MS avec une source a pression atmospherique.

Le tableau 3.3 rassemble les differentes methodes analytiques presentees dans la

litterature pour les trois families de pesticides (s-triazines, carbamates, phenylurees) et qui ne
necessitent pas de derivation des composes avant analyse. Quelques methodes specifiques a
certains pesticides polaires tels que raminotriazole, le glyphosate, le diquat, l’ioxynil et le
pyridate CL9673 sont egalement presentees dans le tableau 3.4.

108
 GC/MS GC/ECD GC/NPD LC/UV LC/MS ref.
El Cl TS PB ES,IS APCI

s-triazines X [141-143]

X [142]

X [144]

X [142] [145]

X [146-149]

X [146] [149-151]

X [117]

X [51]

X [152]

carbamates X [153]

X [53] [151]

X [117]

X [53] [54]

X [53] [54] [152]

phenylurees X [94] [154]

X [150] [151]

X [106] [117] [155]

X [51] [54]

X [54] [152]

Tableau 3.3 : Methodes analytiques proposees dans la litterature pour trois families de pesticides.

109
 Methodes plus specifiques a certains des pesticides :

elvphosate methode EPA 547 : injection dans une colonne HPLC, derivation post-colonne et
detection par fluorescence11561

LC/UV LC/MS ref.

TS PB

phenols X [94] [95]

X [117]

pyridate et pyridate CL9673 X [157]

ammonium quatemaire X [158]

X [151]

triazoles X [151]

Tableau 3.4 : Methodes analytiques proposees dans la litterature pour un certain nombre de
pesticides polaires.

Pour atteindre des limites de sensibilite de 0,1 pg/1 (par substance individualisee), une
etape de preconcentration avant injection est souvent indispensable. Selon la volatility des
pesticides recherches, une extraction par un liquide ou un support solide est mise en oeuvre
[159][160]

- V extraction liquide-Hquide repose sur le partage des differents composes entre la phase
aqueuse et un solvant organique extractant non miscible (chlorure de methylene,
dichloromethane, hexane,...). La selectivity de cette technique depend a la fois du solvant
utilise, de la composition de la matrice aqueuse, de parametres tel que le pH, la force ionique,
et du rapport des volumes eau/solvant. Elle presente plusieurs inconvenients parmi lesquels la
manipulation de volumes importants de solvants organiques et couteux, souvent toxiques et
inflammables. De plus, des problemes d'emulsion peuvent se poser. Dans le cas d’analyses de
traces, P extraction des composes est suivie d’une etape d’evaporation partielle du solvant

110
organique. Cependant, cette operation pent s’accompagner de la perte de produits volatils et
done fausser les resultats d’analyse.
- U extraction liquide-solide repose sur le partage des difFerents composes entre la phase
aqueuse et un adsorbant. Cette methode comporte deux etapes. La premiere etape, dite de
percolation, consiste a faire passer un volume donne d’echantillon a travers une cartouche de
type seringue ou une colonne remplie par un adsorbant susceptible de fixer les composes
presents. La deuxieme etape, dite de desorption, consiste a recuperer les solutes fixes en les
eluant par un faible volume, soit de solvant organique pur (chlorure de methylene, acetonitrile,
methanol,...), soit d’un melange hydroorganique en proportions variables (elution graduee).
Aujourd’hui, 1’extraction liquide-solide se developpe de plus en plus, et semble constituer une
alternative de choix a 1’extraction liquide-liquide. Ses principaux avantages sont la reduction
du nombre d’operations (et par consequent une diminution du risque de contamination des
echantillons), la reduction de la consommation de solvants organiques et enfin, la possibility
d’automatiser les difFerentes operations.
Les grains d’adsorbants sont de meme nature que ceux utilises en chromatographic liquide
mais de granulometric plus elevee (10 a 60 pm) afin de pouvoir realiser 1’etape de percolation
a des debits importants et ainsi limiter sa duree. Differents supports sont disponibles sur le
marche selon la famille de pesticides a concentrer et/ou isoler:
1 - les polymeres poreux de type XAD (copolymeres styrene-divinylbenzene, methacrylate
de methyle) et de type PRP-1 ou PLRP-S (copolymeres styrene-divinylbenzene)
2 - les carbones : le noir de carbone graphitise (GCB), le carbone graphitise poreux (PGC)
3 - les silices grefFes alkyles (n-C8, n-C18, cyclohexyle), phenyle, amine et nitrile
4 - les echangeurs d’ions
Dans les analyses concemant 1’identification et la quantification de pesticides, les silices
greflfees n-octadecyle et les copolymeres sont parmi les adsorbants les plus couramment utilises
pour concentrer la majorite des solutes organiques non ionises et moyennement polaires ou
apolaires (s-triazines, carbamates, phenylurees,...) tandis que les echangeurs d’ions concentrent
les solutes ionises (diquat,...). Par contre, la concentration de composes polaires (pesticides
polaires ou metabolites) s’avere difficile en raison de la grande affinite de ces composes pour la
phase aqueuse. Le support le mieux adapte dans ce dernier cas est le PGC.

Ill
Une fois les solutes elues par un solvant et apres evaporation partielle ou complete de celui-ci,
ils sont repris par un faible volume de phase mobile et injectes dans la colonne (mode differe ou
"off-line*').
L’extraction liquide-solide peut egalement etre couplee a r analyse en ligne par
chromatographic liquide (mode "on-line"), la cartouche remplie d’adsorbant etant allors
designee par le terme de precolonne 1941 195111501 [1541. Dans ce cas, c’est la phase mobile utiHsee
pour la separation chromatographique qui elue directement les solutes dans la colonne
analytique (en ligne) avec ou sans inversion du sens de la phase mobile ("backflush").
L’originalite de cette methode reside en un couplage direct entre l’etape de preconcentration et
l’etape d’analyse, ce qui diminue grandement les risques de contamination ou de pertes en
solutes puisqu’il n’y a ni transfert, ni evaporation, ni fractionnement. Afin de conserve!- la
qualite de la separation, le support d’extraction doit etre de faible granulometric (voisin de 10
pm) et les dimensions de la precolonne doivent etre largement inferieures a celles de la colonne
analytique. Remplie du meme support que celui contenu dans la colonne analytique, la
precolonne joue le role de colonne de garde et protege la colonne analytique lors de 1’injection
de matrices complexes.
Dans le cas de melanges complexes ou de nombreux solutes de polarite et d’etat d’ionisation
tres divers sont presents, il est interessant de coupler plusieurs colonnes de preconcentration
remplie chacune avec un adsorbant specifique. Une application a des eaux de rejets industriels
a montre l’efficacite du tri de la matiere lors de la preconcentration [95l Trois precolonnes sont
montees en serie et par un systeme de multivannes, chacune des precolonnes est analysee
separement. Pendant la percolation de 1’echantillon, les solutes sont adsorbes
preferentiellement sur l’une des precolonnes : la premiere remplie de silice greffee n-octadecyle
piege les solutes apolaires (hydrocarbures aromatiques, phtalates), la deuxieme remplie de
PRP-1 retient les composes moyennement polaires (phenols,...), enfin une precolonne remplie
d’un adsorbant echangeur d’ions Aminex A5 concentre les composes ioniques (amines a pH =
3).

112
 3 - PROBLEMATIQUE POSEE

L’etude experimentale conceme la mise au point d’une methode analytique permettant

F identification et la quantification de pesticides presents dans les eaux. Elle doit etre a la fois
sensible pour atteindre des limites de detection inferieures ou egales aux concentrations
maximales admissibles dans une eau potable (equivalente a 0,1 pg/1 pour chaque pesticide) et
rapide, necessitant peu de traitement de l’echantillon et n’entrainant pas une consommation
importante de solvants. Le critere de rapidite s’avere particulierement interessant en cas de
pollution accident elle afin d’etablir un diagnostic rapide.
De nombreux pesticides, de famille chimique et de polarite tres difFerentes, sont etudies
: les s-triazines (apolaires), les carbamates et les phenylurees (moyennement poiaires), et six
pesticides ou metabolites particuliers (poiaires et tres thermolabiles).
Nous avons choisi comme methode d’analyse la chromatographic liquide couplee a la
spectrometrie de masse, avec comme source d’ionisation la source electrospray. En effet, bien
que la majorite des applications avec cet appareillage conceme F analyse de molecules de
hautes masses moleculaires, notamment dans le domaine de la biochimie, il etait interessant
d’evaluer le potentiel d’ionisation par electronebulisation pour des molecules de petites masses
moleculaires (inferieures a 400 Da).
Les debits liquides acceptables par ces sources sont de quelques pl/min en F absence
d’assistance a la nebulisation, et de quelques dizaines de pl/min avec assistance pneumatique.
Notre choix de colonne pour mettre au point les separations s’est alors porte sur les
microcolonnes bien que le nombre d’applications utilisant la microLCZESI/MS soit limite en
raison des contraintes inherentes a la microchromatographie (limitations des volumes mort,
debits tres faibles inferieurs a 10 pl/min, gradients d’elution reproductibles).

Les pesticides ne represented qu’une partie seulement des polluants susceptibles d’etre
presents dans les eaux. Elies contiennent de tres nombreux composes inorganiques et
organiques d’origine naturelle ou synthetique. En ce qui conceme la matiere organique, la
fraction d’origine naturelle est constitute de molecules simples (sucres, glycols, acides amines
ou acides gras) relativement bien analysables mais egalement des substances humiques. Les
substances humiques, de masses moleculaires elevees et de structures mal identifies, resulted

113
de la biodegradation d’organismes vivants et vegetaux. Elies peuvent solubiliser des petits
molecules ou former des complexes avec certains ions metalliques. Elies sont elles-memes
difficiles a analyser et rendent egalement plus difficile 1’analyse molecules de faible poids
moleculaire. La difficulty d’analyse augmente pour une eau chargee (eau usee ou eau de
riviere) auxquelles s’ajoutent d’autres composes organiques provenants de rejets urbain,
industriel et agricole.
Nous avons dans un deuxieme temps axer notre travail experimental sur V etude de
molecules de hautes masses moleculaires. II s’agit d’une etude preliminaire afin d’evaluer les
performances du spectrometre de masse equipe d’une source electrospray pour la
determination de masses moleculaires elevees et d’estimer la precision des mesures.
Pour cette etude, nous nous limiterons a des exemples de proteines de masses
inferieures a 10000 Da. Nous avons pour cela choisi comme application originate I’etude de
venins bruts de serpent. Ils renferment une grande variete de molecules chimiques d’une grande
richesse, et principalement des proteines (plus de 90 % du poids de venin seche). Pour
identifier la composition d’un venin de serpent par spectrometrie de masse, une separation au
prealable par chromatographic liquide s’avere indispensable.

114
ETUDE EXPERIMENTALE

115
 CHAPITRE 4

APPLICATION AUX PETITES MOLECULES - ETUDE DE

PESTICIDES PRIORITAIRES

116
A ; INTRODUCTION DIRECTE

1- APPAREILLAGE - DESCRIPTION DE LA SOURCE DEIONISATION

La source Analytica presentee sur la figure 4.1 est constitute d’une chambre
d’ionisation a pression atmospherique, d’un capillaire en verre metallise a ses deux extremites
qui assure la transmission des ions formes a pression atmospherique vers une chambre
intermediate (ou regne une pression de 0,7 Torr) et d’une sene de lentilles electrostatiques qui
focalisent les ions a 1’entree de l’analyseur (maintenu sous un vide de 10'5 Torr). Dans la
chambre d’ionisation, de 1’azote sec et chauffe circule a contre-courant pour faciliter
1’evaporation des gouttelettes et la desolvatation des ions formes.
Le capillaire de transfer!, qui fait l’objet d’un brevet depose par la societe Analytica, joue un
double role. II cree une perte de charge suffisante pour conserver une difference de pression
entre la chambre d’ionisation et la chambre intermediate. D permet egalement de niveler la
distribution statique de la vitesse initiale des ions (norme et dtection). En sortie du capillaire
de transfer!, le melange gazeux (gaz + ions) se detend sous forme d’un jet supersonique. Le
capillaire de transfer! est chauffe pour ameliorer la desolvatation des ions.

Les parametres experimentaux de la source a optimiser sont

- le debit liquide,
- la position de l’aiguille d’introduction,
- les tensions dans la source (Vcyi, Vfond, VcaP),

- le debit et la temperature du gaz a contre-courant,

- les tensions des lentilles de focalisation des ions, en particular El et S%.

117
 Azote sec Capillaire de Optique d'entree
transfert

Aiguille d'introduction

Figure 4.1 : Schema de la source d'ionisation par electronebulisation a pression

atmospherique (source electrospray) commercialisee par Analytica.

118
 En mode d’ionisation positif, et a quelques pl/min, une difference de potentiel de 3500
V est appliquee entre l’extremite de 1’aiguille d’introduction (a la masse electrique) et le fond
de source (Vend = -3500 V), distants de 1 cm. L’extremite amont du capillaire de transfert est
portee a un potentiel de VcP = - 3800V. Le cylindre metallique, entourant la source
d’ionisation, est portee a un potentiel Vcyi = -3700V. Ces valeurs de potentiel ne sont pas a
optimiser pour chaque debit liquide, a la difference de la distance aiguille d’introduction-fond
de source. En mode d’ionisation negatif, il suflBt de changer le signe des potentiels et si
necessaire, d’ajouter de l’oxygene par un tube coaxial a I’aiguille d’introduction pour eviter
1’apparition d’un arc electrique.

2 - RESULTATS ET DISCUSSION

2.a - Influence du debit liquide

La formation des ions en phase gazeuse peut s’interpreter par un processus de

desorption des gouttelettes chargees, en raison d’une densite de charge elevee a leurs surfaces.
L’introduction de la solution a des debits liquides tres fables, de quelques pl/min, est
indispensable pour se placer dans les meilleures conditions de sensibilite et de stabilite (figure
4.2). En 1’absence de toute assistance a la nebulisation electrostatique (assistance pneumatique
ou assistance aux ultrasons), la sensibilite est maximale pour un debit voisin de 2 pl/min. Une
diminution de l’intensite du signal est observee pour des debits superieurs a 5 gl/min. Au dela
de 10 pl/min, le signal devient instable. Cette evolution s’explique par une augmentation du
rayon des gouttelettes initiales chargees (de 1 a 10 jim pour les debits consideres), se
traduisant par une baisse de production d’ions. De plus, la distribution des gouttelettes autour
d’une valeur moyenne de rayon devient moins uniforme[161].

Cette limitation de debit necessitera pour la realisation du couplage LC/ESIZMS un

montage different selon le diametre interieur de la colonne :

119
 - Une division de l’effluent chromatographique a la sortie de la colonne si son
diametre interieur est superieur ou egal a 1 mm.
- Un couplage direct si la separation est mise au point avec une microcolonne.
Dans la recherche d’une sensibilite maximale en LC/ESI/MS, le choix d’une
microcolonne est-il preferable a celui d’une colonne standard ?. Une division de 1’effluent en
sortie de la colonne entrame-t-elle une perte de sensibilite non negligeable?.

Avant de repondre a ces deux questions, nous allons rappeler brievement quelques
generalites sur les detecteurs de chromatographic liquide.
- Les detecteurs a caractere universel sont generalement employes dans le cas
de melanges inconnus. IIs utilisent les proprietes globales de l’effluent chromatographique
(reffactometre differentiel) ou bien necessitent l’elimination partielle de la phase eluante par
evaporation (spectrometre de masse). Les detecteurs a caractere specifique, tres interessants
pour doser des elements a l’etat de trace dans un melange complexe, utilisent les proprietes
physico-chimiques des solutes (absorption UV, fluorescence).
- Les detecteurs sont aussi definis soit comme detecteur de masse, soit comme
detecteur de concentration.
Avec un detecteur de masse (detecteur a ionisation de fiamme, spectrometre de masse equipe
d’une source a impact electronique ou d’une source a ionisation chimique), la reponse R,
exprimee en masse du solute par unite de temps (g/s), est definie par
R=a^=aCIMXDS [4.1]
dt
avec a le facteur de reponse, Cm« la concentration maximale, D le debit liquide et S le rapport
de division de l’effluent. Une diminution du debit, pour une concentration constante du solute,
conduit par consequent a une diminution de la reponse.
Au contraire, avec un detecteur de concentration (absorption UV, fluorescence), la reponse R,
exprimee en masse du solute par unite de volume de phase mobile (g/ml), et definie par
R = aCmax [4.2]
ne depend pas du debit liquide.
Apres ces brefs rappels, nous allons discuter de la specificite du detecteur spectrometre de
masse equipe d’une source electrospray.

120
 Les etudes par introduction directe ont mis en evidence qu’une augmentation du debit
de 0,5 a 4 pl/min, pour une concentration constante de solute, ne s’accompagne pas d’une
augmentation de l’intensite du signal (figure 4.2). Par consequent, la sensibilite exprimee en
concentration reste constante sur la gamme de debit etudiee. Mais en terme de quantite de
produit introduce par unite de temps, elle diminue lorsque le debit augmente. Le spectrometre
de masse equipe d’une source electrospray se comporte done comme un detecteur de
concentration. H s’agit en fait d’une situation inhabituelle car un spectrometre de masse
operant en impact electronique ou en ionisation chimique est connu pour etre un detecteur de
masse. Ce resultat s’explique par une diminution du rendement d’ionisation en raison de la
formation de gouttelettes initiales plus volumineuses lorsque le debit augmente. La difficulty
croissante pour les ions a s’extraire des gouttelettes chargees serait compensee par une
introduction plus importante de produit par unite de temps dans la source. Le nombre total
d’ions detectes par le spectrometre de masse, par unite de temps, reste a peu pres constant et
la hauteur du signal stable.
Et pour des debits superieurs a 5 pl/min, l’intensite du signal diminue (figure 4.2) et
devient instable en raison d’une dispersion importante de la taille des gouttelettes initialement
formees.

121
 debit liquids (pl/min)

Figure 4.2 : Influence du debit liquide sur l’intensite du pic de l’ion MET de l’atrazine
en mode balayage. L’atrazine est en solution dans un melange acetonitrile-eau 60/40 (v/v) a la
concentration de 2,5 mg/1.

L’optimisation du couplage LC/MS a l’aide de l’interface electrospray necessite done,

pour une colonne de diametre interieur egal ou superieur a 1 mm, une division de V effluent
chromatographique en sortie de colonne. Cette reduction de debit se traduit par une diminution
de la quantite de solute introduite dans la source par unite de temps mais n’affecte pas la
concentration du solute dans l’effluent. Le spectrometre de masse etant defini comme un
detecteur de concentration, la division de debit ne s’accompagne done pas d’une baisse de
sensibilite. De plus, l’effluent en exces peut etre dirige vers un second dispositif de detection,
par exemple un detecteur UV, afin d’obtenir des complements d’information sur le melange
etudie.
Dependant, l’utilisation de microcolonnes semble interessante, en particulier pour lies
etudes cliniques, ou les volumes d’echantillons preleves sont en general tres faibles (1 p.1 ou

122
moins) ou encore pour les separations de melanges complexes qui necessitent un grand nombre
de plateaux (chapitre 2.B). Lorsque le diametre interieur de la colonne est inferieur a 500 pm,
la totalite de 1’effluent chromatographique est introduit dans la source d’ionisation.

2.b - Influence du debit d’azote chauffe

Le debit d’azote chauffe doit egalement etre optimise (figure 4.3). En effet, la
circulation du gaz chauffe a contre-courant du deplacement des gouttelettes assure une
diminution progressive du rayon des gouttelettes par evaporation du solvant. Apres une
succession d’etapes d’evaporation de solvant et d’explosions coulombiennes, les conditions de
desorption des ions sont atteintes. Le gaz chauffe intervient egalement pour limiter l’abondance
des "clusters" de type MH(S1)„+ et favoriser la formation des ions MET. Par consequent, une
augmentation du debit de gaz chauffe s’accompagne d’une augmentation du nombre d’ions
MEL formes en phase gazeuse dans la source, ce qui se traduit par une augmentation de
1’intensite du signal mesure au detecteur. Cependant, au dela d’un debit optimum, de 5 1/min
pour un debit liquide de 2 p 1/min et une temperature de 170°C, l’intensite du signal diminue
nettement. Cette evolution pourrait s’expliquer de la fa?on suivante : Entraines par le gaz, les
gouttelettes chargees et les ions sont repousses de 1’entree du capillaire de transfer! et les ions
ne peuvent pas etre detectes par 1’analyseur[74].

123
 100 -r

70 --

40 --

20 --

debit de gaz chauffe a contre-courant (1/min)

Figure 4.3 : Influence du debit de gaz chauffe a contre-courant sur l’intensite du pic de
l’ion MET de l’atrazine en mode balayage. L’atrazine est en solution dans un melange
acetonitrile-eau 60/40 (v/v) a la concentration de 2,5 mg/1. Debit liquide de 2 p 1/min. La
temperature du gaz est fixee a 170°C.

124
 2.c - Influence de la composition de la phase mobile

La nature de la phase mobile influe non seulement sur la nebulisation de la solution,

mais egalement sur la formation des especes ioniques en raison de fexistence d’equilibres
d’ionisation en solution et/ou en phase gazeuse entre le solute et le solvant. Elle joue ainsi un
role majeur dans le processus d’ionisation, et par consequent sur la sensibilite de ce mode
d’ionisation. D’autre part, de nombreuses separations en chromatographic liquide sont
realisees en phase inverse avec un gradient d’elution solvant organique-eau, la proportion de
solvant pouvant dans certaines applications varier de 0 a 100 %.

La figure 4.4 montre I’influence de la composition de la phase mobile sur Pintensite du

pic de 1’ion MHT pour trois pesticides : atrazine, carbendazime, isoproturon, la proportion de
solvant organique (acetonitrile ou methanol) dans l’eau variant de 20 a 80 %.
En augmentant la proportion de solvant organique dans la phase mobile, la tension
superficielle de la solution a nebuliser diminue (tableau 4.1). Une meilleure nebulisation de la
solution se traduit par des gouttelettes initiales de rayon plus petit, ce qui facilite le processus
de formation d’ions en phase gazeuse. L’intensite du signal augmente jusqu’a un pourcentage
de 50 % en methanol et de 60 % en acetonitrile, puis diminue legerement.
L’intensite du signal croit plus rapidement avec I’augmentation du pourcentage de methanol
qu’avec celui de 1’acetonitrile. Et le maximum d’intensite du signal est atteint avec un
pourcentage plus faible de methanol comparativement a l’acetonitrile. Cette difference peut
s’expliquer par une tension superficielle plus faible, ainsi qu’une temperature d’evaporation
plus basse du methanol.

solvant CH3OH CH3CN H20

y (N/m) 0,0226 0,030 0,073

Tvap (°C) 64,7 81,8 100
AP (kJ/mol) 11621 761 788 697

Tableau 4.1 : Donnees physico-chimiques concemant les trois solvants.

125
 100 T

4— atrazine (CH3CN-H20)

30 -- carbendazime (CH3CN-H20)

- - X- - isoproturon (CH3OH-H20)
20 --

% d'acetonitrile ou de methanol

Figure 4.4 : Influence de la composition de la phase mobile sur l’intensite du signal

MET en mode balayage pour trois pesticides. Les pesticides sont en solution a la concentration
de 2,5 mg/1. Debit liquide de 2 pl/min.

126
 Ces resultats sont differents de ceux obtenus pour une solution dans laquelle le solute
est sous forme ionique. Une augmentation continue de l’intensite du signal entre 20 % et 80 %
de solvant organique, et meme jusqu’a 100 % de solvant organique a ete alors constatee[281.

La diminution de l’intensite du signal pour des pourcentages eleves de solvant

organique traduit une diminution du nombre d’ions MIL en phase gazeuse. L’affinite
protonique du methanol et de f acetonitrile etant plus elevee que celle de l’eau (tableau 4.1),
cette baisse du nombre d’ions MtiT peut resulter d’un transfer! de proton d’une fraction des
ions MEL vers des molecules de solvant en phase liquide ou en phase gazeuse[163].

2.d - Etude des fragmentations induites par collision (CID)

Les ions en phase gazeuse sont plus ou moins solvates par des molecules de solvant,
sous la forme de clusters de type MH(S1)„+ ou M(S1)„+, selon que le solute est en solution sous
forme neutre ou ionise. L’abondance de ces clusters est limitee par la circulation d’azote
chauffe a contre-courant de leur migration, par le chauffage du capillaire de transfer!, et enfin
par leurs collisions avec les molecules de gaz residuelies dans la region a pression reduite.
L’efficacite de ces collisions depend de la difference de potentiel AE entre l’extremite du
capillaire (El) et le premier ecorceur (Si).

L’ionisation par electronebulisation est une methode d’ionisation douce, qui conduit a
la formation d’ions parents (MH1" ou M*) lors de Vanalyse de molecules de faibles masses
moleculaires. Cependant, il est possible d’obtenir des informations sur la structure de la
molecule par collision de l’ion parent sur les molecules de gaz residuelies dans la region a
pression reduite en augmentant progressivement AE. Nous utilisons alors le terme CID
("Collisional Induced Dissociation" ou Collision Induite par Dissociation) pour definir ce mode
de fragmentation.

127
 L’effet de la variation de AE (variation de El, Si restant constant) sur l’intensite du pic
de l’ion MH* ainsi que celle des ions fragments est presente pour l’atrazine, la propazine et la
carbendazime sur les figures 4.5 - 4.8.
Dans le cas de 1’atrazine, 1’intensite du pic de l’ion MH* croit progressivement lorsque
AE augmente. Son intensite est maximale pour AE = 100V, potentiel auquel apparait un ion
fragment (m/z 174) qui correspond a la perte d’un groupement propylene. Au dela de 100 V,
l’intensite du pic de l’ion MHf decroit, tandis que celle de l’ion fragment croit. Un deuxieme
ion fragment (m/z 146) qui correspond a la perte d’un groupement ethylene (a partir de l’ion
m/z 174) apparait a partir de AE = 150V et l’intensite du pic de l’ion m/z 174 commence a
decroltre. Enfin, nous pouvons noter sur la figure 4.5 une baisse sensible de l’intensite des pics
specifiques de chacun des ions, en valeur absolue, a partir de AE = 120V. Nous pouvons
expliquer cette diminution d’intensite par une mauvaise localisation des ions vers V orifice de la
lentille (Si) aux fortes differences de potentiel AE.
La meme evolution est observee pour la propazine, avec cette fois-ci la formation de
deux ions fragments m/z 188 (perte d’un groupement propylene) et 146 (perte du deuxieme
groupement propylene a partir de 188). Cependant, si l’on compare les deux spectres de masse
a 160V de l’atrazine et la propazine, l’abondance de l’ion fragment m/z 146 est superieure
pour la propazine (en intensite absolue et en intensite relative par rapport a l’intensite du pic de
l’ion MET). Cette difference serait due a la perte plus facile du groupement propylene par
rapport au groupement ethylene. Cette hypothese est d’ailleurs confirmee par les spectres de
masse de l’atrazine. L’ion MET perd en premier le groupement propylene, puis pour des
potentiels plus eleves le groupement ethylene.
Nous avons regroupe dans le tableau 4.2 les fragments obtenus par CID pour les sept s-
triazines etudiees. La majorite des ions fragments correspondent a la perte d’un groupement
propylene, et parfois a la perte d’un groupement ethylene (simazine, atrazine). Pour la
cyanazine, les ions fragments resultent de la perte de groupements specifiques a cette molecule,
m/z 214 (perte d’acide cyanhydrique) et m/z 174 (perte d’un allene a partir de 214).
Pour la carbendazime, l’intensite du pic de l’ion MET est maximale pour AE = 80V et
decroit pour des valeurs de AE superieures. Un ion fragment (m/z 160) apparait des AE = 70V.
II est forme par la perte d’un groupement methanol. L’intensite du pic de cet ion fragment
augmente avec AE, devient l’ion majoritaire des 130V et commence a decroltre a partir de
150V. Un deuxieme ion fragment (m/z 132) resultant de la perte d’oxyde de carbone (a partir

128
de l’ion m/z 160) apparait des 120 V. L’intensite de ce pic augmente jusqu’a 150V puis
diminue lors de V application de potentiels superieurs.

Pour rensemble de nos composes, nous avons observe une intensite maximale du pic
specifique de l’ion parent pour des AE compris le plus souvent entre 80V et 100V. Pour des
valeurs de AE superieures, son intensite diminue tandis que celle des ions fragments augmente.
A partir de AE = 160V, l’intensite de 1’ensemble des ions decroit, du fait d’une mauvaise
localisation des ions vers 1’orifice de la lentille (Si). A 1’exception de la carbendazime, l’ion
parent est l’ion majoritaire sur toute la gamme AE etudiee (60V-180V).
Les ions fragments obtenus par CID (ainsi que Ies ions adduits) de tous les pesticides
etudies en mode d’ionisation positif sont rassembles dans le tableau 4.2.
Pour les s-triazines, nos resultats sont en accord avec ceux presentes dans la litterature f51J [164l
Les ions pseudo-moleculaires perdent principalement un ou deux groupements neutres
(propylene et ethylene) derives des substituants alkyls Ri et R2 (annexe 1). Cependant, des ions
fragments supplementaires ont ete observes par d’autres auteurs : ions formes par la perte de
HC1 (simazine) ou de SCH4 (ametryne), ions issus d’une ouverture du cycle tel que
[(CH3)2CHNHC(NH)NCC1]+ a m/z 146 pour la desethyl atrazine ou
[CH3CH2NHC(NH)NCC1]+ a m/z 132 pour la simazine.
Pour un des carbamates, l’aldicarbe, les deux fragments a m/z 116 (rupture en a de la double
liaison CN) et 89 (perte de HCN a partir de 116) ont ete egalement identifies dans la litterature
[164]

Pour les phenylurees, nous avons mis en evidence des ions fragments caracteristiques du
groupement R3 (annexe 1). Pour l’isoproturon, le chlortoluron, le metoxuron et le diuron,
molecules qui possedent deux groupements methyl en P du CO, nous observons le meme ion
fragment [(CH3)2NCO]+ de masse m/z 72. Pour le monolinuron et le linuron, deux molecules
qui possedent un groupement methyl et un groupement methoxy en P du CO, nous observons
un ion fragment respectivement a m/z 126 et 160. Ces deux ions ont ete formes par une
rupture en a du CO avec la perte des groupements CO et HN(CH3)(OCH3). Us n’ont pas ete
observes par d’autres auteurs dans la litterature.
Les ions fragments obtenus par CID (ainsi que les ions adduits) pour trois pesticides en
mode d’ionisation negatif sont rassembles dans le tableau 4.3. Parmi les trois pesticides etudies,

129
seul le glyphosate a donne lieu a des fragmentations, avec formation de deux ions dont les
rapports m/z respectifs sont egaux a m/z = 150 (perte de H20) et m/z =124 (perte de C02).
Enfin, l’efficacite des fragmentations par CID ne semble pas dependre de la
concentration du solute en solution. En effet, meme aux faibles concentrations, les principaux
ions fragments sont formes (figure 4.9).

En conclusion, cette etude demontre la possibility d’obtenir des informations sur la

structure d’un grand nombre de ces pesticides, et en particulier au sein d’une meme famille, de
les differencier non seulement par la mesure du rapport m/z de l’ion parent et de la structure du
motif isotopique moleculaire, mais aussi par la mise en evidence de certains groupes de
substitution (derive isopropyl pour les s-triazines, derive methyl ou methoxy pour les
phenylurees,...).
Cependant, dans le cas de f analyse d’un melange complexe, tous les ions sortant du
capillaire de transfer! sont susceptibles de se fragmenter dans la region a pression reduite et
Vinterpretation d’un spectre de masse dans ces conditions peut s’averer difficile. Une
separation par chromatographic liquide est alors indispensable afin d’introduire a des temps
differents dans la source a electronebulisation les differents ions moleculaires protones du
melange. Le couplage LC/MS avec une interface electropray en mode CED apparaTt done
comme une alternative de choix a la spectrometrie de masse en tandem (MS-MS) pour
Pidentification et la quantification de plusieurs composes dans un melange inconnu. La
chromatographic liquide qui separe les differents constituants du melange remplace le premier
analyseur et la chambre intermediate de l’interface joue le role de chambre de collision[165J.

130
 [M+HJ
100 - 80 V 100% = 1720000

<D>
esj
u
Ol
§

—i r~
100 150 200 250 300

m/z

[M+H]+
100 - 120V 100% = 1500000

e
V
>
To
V

sc
-42

“i i I I
100 150 200 250 300
m/z

[M+H]+
100 - 160 V 100% = 470000

e
>
C5
8
;b -42
g

Jhu---------- r r
100 200 250 300
m/z

Figure 4.5 : Spectres de masse de l’atrazine en solution dans un melange acetonitrile-eau 60/40
(v/v) a la concentration de 5 mg/1 pour trois valeurs de AE (80V, 120V, 160V). Debit liquide
de 2 pl/min. Mode d’ionisation positif. Pour ('identification des fragments, voir tableau 4.2.

131
 [M+H]+
100- 80V 100% =1680000

<U>
"5
8
:b
55
§

100 150 200 250 300

m/z

[M+H]"1
100- 120V 100% = 1840000

&
(U
>

c
-42

100 150 200 250 300

m/z

[M+H]h
100 160V 100% = 610000

o>

*8
;s
’w
u -42
-42

100 150 200 250 300

m/z.

Figure 4.6 : Spectres de masse de la propazine en solution dans un melange acetonitrile-eau

60/40 (v/v) a la concentration de 5 mg/1 pour trois valeurs de AE (80V, 120V, 160V). Debit
liquide de 2 pl/min. Mode d’ionisation positif. Pour Videntification des fragments, voir tableau
4.2.

132
 [M+H]+
100- 80V 100% = 1920000

>

a
-u
a
£
c
[M+Na] +

0 -^ r T —r-—'—i— ~r~
100 150 200 250 300 350 400 450 500
m/z

[M+H]h
100- nov 100% = 1560000

<u
>
cs
O
% -32
S

[M+Na]"1
—i—

100 150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

100 - 140V 100% = 1280000

&
<D
>

I
'£
W [M+HT
Ic
•32
-28
[M+Na]"1
i ..
100 150 200 250 300 350 400 450 500
m/z

Figure 4.7 : Spectres de masse de la carbendazime en solution dans un melange acetonitrile-eau

60/40 (v/v) a la concentration de 5 mg/1 pour trois valeurs de AE (80V, 110V, 140V). Debit
liquide de 2 pl/min. Mode d’ionisation positif. Pour 1’identification des fragments, voir tableau
4.2.

133
 hauteur du signal (%) hauteur du signal (%)
h W b) L/i

100
CT\ 00
o o o o o o O O O O to W Ji Ui a\ -J oo vo o
o o o o o o o o o o

o □ x

w
4^

AE(V)

00
O
 100 T

Figure 4.8 : Influence de AE sur I’intensite du signal de 1’ion parent et des ions
fragments pour l’atrazine (A), la propazine (B) et la carbendazime (C).

135
Tableau 4.2 : Principaux ions observes par ESI/MS en mode +

M m/z interpretation

simazine 201,1
202,0 [M+Hf
174,0 [MH-C2H4]+ perte de CH2=CH2

atrazine 215,1
216,1 [M+H]+
174,1 [MH-C3Ey+ perte de CH2=CH-CH3
146,1 [174-C2H4]+ perte de CH2=CH2

ametryne 227,1
250,1 [M+Na]+
228,1 [M+H]+
186,1 [MH-C3H6]+

propazine 229,1
230,1 [M+H]+
188,1 [MH-C3Hti]+
146,1 [188-C3H6]+

cyanazine 240,1
279,0 [M+K]+
263,0 [M+Naf
241,1 [M+H]+
214,1 [MH-HCN]+
174,1 [214-C3H4]+ perte de CH2=C=CH2

prometryne 241,1
242,1 [M+H]+
200,1 [MH-C3H6]+
158,1 [200-C3H6]+

desethyl atrazine 187,1

188,0 [M+H]+
146,0 [MH-C3H6]+

carbendazime 191,1
230,0 [M+K]+
214,0 [M+Na]+
192,0 [M+H]"
160,1 perte de CH3OH
132,5 [160-CO]+

136
methomyl 162,0
347.2 [2M+Na]'
200,8 [m+kr
184.9 [M+Na]+
162.9 [M+H]+
127.9 [MNa-C2H3ON]' perte de CH3-N=C=0
105,8 [MH-C2H3ON]+
88,1 [MH-C2H502N]+ perte de CH3-NH-COOH

aldicarbe 190,1
229.0 [M+K]+
213.0 [M+Na]'
191.0 [M+H]+
116.0 [MH-C2H502N]' perte de CH3-NH-COOH
89.2 [116-HCN]

isoproturon 206,1
435,5 [2M+Na]+
245,1 [M+K]+
229,1 [M+Na]'
207,1 [M+H]+
165,0 [MH-C3H6]+ perte de CH2=CH-CH3
72,0 [(CH3)2N-CO]+

chlortoluron 212,1
447,4 [2M+Na]'
251,0 [M+K]+
235,1 [M+Na]+
213,1 [M+H]'
72,0 [(CH3)2N-CO]+

monolinuron 214,1
451,4 [2M+Na]'
253,0 [M+K]'
237,0 [M+Na]'
215,1 [M+H]'
148,0
126,2 [MH-C3H?02N]' perte de HN(CH3)(OCH3) + CO

metoxuron 228,1
479,4 [2M+Na]'
267,0 [M+K]'
251,0 [M+Na]'
229,0 [M+H]'
71,9 [(CH3)2N-CO]+

137
diuron 232,0
487,3 [2M+Na]+
271,0 [M+K]'
255,0 [M+Na]'
233,0 [M+H]+
71,9 [(CH3)2N-C=0]+

buturon 236,1
495,5 [2M+Na]+
275,1 [M+K]+
259,0 [M+Na]+
237,0 [M+H]'

linuron 248,0
519,4 [2M+Na]'
286,9 [M+K]'
271,0 [M+Na]+
249,0 [M+H]'
182,0
160,0 [MH-C3H702N]' perte de HN(CH3)(OCH3) + CO

neburon 274,1
571,5 [2M+Na]'
313,1 [M+K]'
297,0 [M+Na]+
275,1 [M+H]'

aminotriazole 84,0
85,1 [M+H]'

glyphosate 169,0

dinoterbe 240,1
279,0 [M+K]'
263,0 [M+Na]'

diquat 184,1
92,1 M2'

ioxynil 370,8
394,0 [M+Na]'

pyridate CL9673 206,0

434,9 [2M+Na]'
244,9 [M+K]'
229,0 [M+Na]'
207,0 [M+H]'

138
Tableau 4.3 : Principaux ions observes par ESI/MS en mode -

M m/z interpretation

glyphosate 169,0
168,0 [M-H]'
150,0
124,1 [M-H-C02]'

dinoterbe 240,1
239,0 [M-H]'
206,9

ioxynil 370,8
369,7 [M-H]"

139
 100- 70V 100% = 10600

140V 100% = 7600

m/z

Figure 4.9 : Spectres de masse de la carbendazime en solution dans un melange acetonitrile-eau

60/40 (v/v) a la concentration de 0,2 mg/1 pour AE = 70V et 140V. Debit liquide de 2 pl/min.
Mode d’ionisation positif.

140
 2.e - Courbe d’etalonnage et sensibilite

La courbe d’etalonnage de l’atrazine en solution dans un melange acetonitrile-eau

50/50 (v/v) pour un debit liquide de 2 pl/min est presentee sur la figure 4.10. L’intensite du
signal MH* a ete mesuree pour des concentrations d’atrazine comprise entre 0,1 et 5 mg/1. Une
saturation du signal apparait lorsque la concentration de l’atrazine depasse 1,3 mg/1, ce qui
equivaut pour ce compose de masse molaire 215 Da a une concentration molaire de 6 10"6 M.
Cette meme evolution a ete observee pour deux autres pesticides, la propazine et la
carbendazime, et pour des valeurs de concentration similaires (tableau 4.4).

concentration d'atrazine (mg/1)

Figure 4.10 : Courbe d’etalonnage de 1’atrazine en solution dans un melange

acetonitrile-eau 50/50 (v/v).

141
 debut de saturation

atrazine 1,3 mg/1 6 10"6 M

propazine 1,35 mg/1 6 lO^M
carbendazime 1,3 mg/1 7 10"6 M

Tableau 4.4 : Apparition d’une saturation du signal sur une courbe d’etalonnage.

solute detection des mode en solution dans type de saturation chute du

especes d’introduction (v/v) nebuliseur du signal signal k

apartirde partiirde

atrazine MH* m/z=216 introd. directe CH3CN-H2O 50/50 ES 6 10"6 M

propazine MET m/z=230 6 10^ M

carbendazime MH4" m/z=192 7 10"6 M

tetrabutylammonium TBA+ m/z=242 20 pi, boucle CH3CN-CH3OH 95/5 ES 1,5 10'5 M

de bromure (TBABr) d’injection
IS 10'5M

cocaine MH4" m/z=304 introd. directe CH3OH ES.IS 10"5M 5 10"4 M

equine somme des ions introd. directe CH3OH-H2O- ES 10"5M 2 10"5 M

apomyoglobine [M+17H]n+ CH3COOH 47/47/6
(M=16950,5 Da)
[M+18H]18+

[M+19H]194"

[M+20H]204"

Tableau 4.5 : Comparaison entre nos resultats experimentaux et des resultats presentes dans la
Utterature™^^.

142
 - Interpretation de la courbe d’etalonnage

La saturation du signal est caracteristique des courbes d’etalonnage obtenues avec ce

mode d’ionisation en introduction directe. De plus, par comparaison avec la litterature, des
valeurs voisines d’apparition de plateau sont observees aussi bien pour des solutes neutres que
ionises en solution avec ou sans assistance a la nebulisation (tableau 4.5). Cette saturation
correspond en fait a une diminution du nombre d’ions au niveau du detecteur qui peut
s’expliquer soit par une diminution de formation d’ions en phase gazeuse a pression
atmospherique, soit par une diminution du rendement de transmission des ions vers l’analyseur
sous vide. Differentes hypotheses ont ete proposees pour tenter d’expliquer cette evolution.
- augmentation de la taille des gouttelettes
- competition entre les ions
- nombre insuffisant de charges a la surface de la gouttelette
- surface de la gouttelette entierement occupee par des ions et des paires d’ions
- formation d’un residu dans la gouttelette
- repulsion entre les gouttelettes chargees
- repulsion entre les ions en phase gazeuse

Tang et Kebarle interpretent V apparition du plateau a partir d’une modelisation du

processus de desorption des ions basee sur la competition entre tous les ions : solutes
(initialement en solution sous forme ionise et symbolise par A4) et impuretes ioniques
(symbolise par E4) presents a la surface des gouttelettes [44] [167l Us proposent une equation qui
relie I(A+,ms) l’intensite des ions A4 mesuree par le spectrometre de masse a [A4] et [E4] les
concentrations du solute et des impuretes dans la solution nebulisee

, x k\A+]
[4.3]

avec I representant le courant total mesure a 1’extremite de 1’aiguille d’introduction, p le

facteur de proportionnalite exprimant Tefficacite de l’echantillonnage des ions" depuis la
region a pression atmospherique jusqu’a l’entree de l’analyseur maintenu sous vide (soit
I(A4,m,) = pI(A+,g) avec I(A4,g) l’intensite des ions A4 presents en phase gazeuse dans la

143
source), f la fraction de charges portees par la gouttelette convertie en ions en phase gazeuse,
kA et kE les constantes cinetiques de transfert des ions de la gouttelette vers la phase gazeuse.
Dans la suite de la discussion, ils supposent que kA et kE sont du meme ordre de grandeur et
pour simplifier Pecriture, I(A+,m,) sera note par la suite IA.
La concentration globale des impuretes a ete evaluee a partir de la mesure de la conductivity a
du solvant utilise pour leurs experiences. Pour du methanol de qualite analytique, ils
determinent c egal a 10"7 Q'Vcm et estiment voisine de 5 10"* M la concentration globale des
impuretes NaCl et NH4CI (Na+, NHt+ mis en evidence par spectrometrie de masse).

A partir de cette equation, deux regions de concentration sont definies pour une courbe
d’etalonnage.

- Une premiere region lorsque la concentration des impuretes [E+] est largement superieure a
celle du solute [A+],
Dans ce cas, V equation se reduit a

1A = pour [A"] < 10'5 M [4 4]

Les impuretes etant les ions majoritaires, rintensity I reste a peu pres constante. Par
consequent, IA serait proportionnelle a [A+], Et une augmentation de la concentration du solute
s’accompagne bien d’une augmentation du signal de Pion A+.

- Dans la seconde region, lorsque la concentration du solute devient largement superieure a

celle des impuretes, P equation se reduit a

IA - pjl pour [A+] > 10'5 M [4.5]

D’autre part, I = ^(<[^+])" pour [A+] < 10'3 M [4.6]

avec K une constante, X°m la conductivity limite molaire du solute A+ et n un coefficient

determine experimentalement (voisin de 0,22 pour des solutions de NaCl et KC1) [167l

144
Ainsi, /, = = pfK.{x°m[A*Y pour 10"5M<[A"]< 10"3M [4.7]

Du fait de la faible valeur de n, l’intensite du signal IA n’augmente que tres legerement en

fonction de la concentration du solute.

Tang et Kebarle interpretent ainsi les deux parties de la courbe d’etalonnage par la presence
d’impuretes dans le solvant de la solution, impuretes dont la concentration est estimee voisine
de 5 10"6 M, et un effet de competition entre les differents ions presents dans la gouttelettes
pour desorber de la phase liquide.
Cependant, meme si le solvant contient beaucoup moins d’impuretes, une saturation du signal
apparait toujours sur les courbes d’etalonnage a partir de 10'5 M tandis que l’intensite I
augmente cette fois-ci continuellement sur toute la gamme de concentrations : 0,1 10"5 M -
5 10"5 M[166].

Pour les solutes initialement en solution sous forme neutre et qui s’ionisent par fixation
d’un ou plusieurs ions FT ou Na+, 1’existence de cette saturation pourrait s’expliquer par un
nombre insuffisant d’ions FT ou Na+ a la surface de la gouttelette, en particulier dans le cas de
molecules de hautes masses moleculaires [61l Dans le cas de 1’equine apomyoglobine qui
conduit a la formation d’ions multicharges, le signal commence a saturer a partir d’une
concentration de 10'5 M puis il chute au dela de 2 10"5 M. Cette evolution est interpretee par
une augmentation de la competition parmi les molecules de proteines pour fixer les ions If"
disponibles en nombre insuffisant a la surface des gouttelettes. Cette hypothese semble etre
confirmee par Vetude des spectres de masse de ce compose. Un deplacement de l’enveloppe
des ions multicharges vers les m/z plus eleves est observe lors d’une augmentation de la
concentration, dans le cas de concentrations superieures a 10'5 M.
Avec cette hypothese, on devrait observer un retard de l’apparition de la saturation du signal
pour les courbes d’etalonnage obtenues par nebulisation electrostatique pure par rapport a
celles obtenues par nebulisation electrostatique assistee pneumatiquement, les gouttelettes
formees en l’absence de gaz nebuliseur etant plus chargees et plus fines. Mais la comparaison
des resultats experimentaux (tableau 4.5) ne fait pas apparaitre de differences notables entre les
deux modes de nebulisation. Par consequent, meme si Failure de la courbe d’etalonnage d’une
molecule de haute masse moleculaire peut s’expliquer en partie par un nombre insuffisant de

145
protons a la surface des gouttelettes, il ne s’agit en aucun cas d’une reponse complete pour
Vensemble des resultats experimentaux presentes dans le tableau 4.5.

Une augmentation de la taille des gouttelettes lorsque la concentration d’un solute

ionique depasse 10'5 M pourrait expliquer l’apparition de la saturation du signal. En effet,
Hayati et al. ont montre qu’une augmentation de la conductivity de la solution nebulisee
s’accompagne dans un premier temps d’une diminution du rayon des gouttelettes formees
jusqu’a atteindre un minimum puis d’une augmentation[I61J. Ainsi, aux fortes concentrations et
en V absence de toute assistance a la nebulisation, la taille trap elevee des gouttelettes rendrait
plus difficile la desorption des ions, ce qui expliquerait la saturation du signal. Au contraire,
avec 1’assistance pneumatique, la taille des gouttelettes serait beaucoup moins dependante de la
concentration du solute en solution, et le domaine de linearite sur la courbe d’etalonnage
devrait etre plus etendu. Cependant, comme nous l’avons deja signale dans la discussion
precedente, les courbes d’etalonnage obtenues par ces deux modes de nebulisation sont
similaires.

Une saturation en ions et en paires d’ions de la surface de la gouttelette pourrait aussi

se traduire par 1’apparition d’un plateau pour les courbes d’etalonnage [I66]. En effet, si a partir
d’une certaine concentration de solutes voisine de 10'5 M, la surface des gouttelettes est
entierement recouverte d’ions (et de paires d’ions), le nombre d’ions (et de paires d’ions)
pouvant atteindre la surface n’augmenterait plus pour des concentrations plus elevees. Par
consequent, le nombre d’ions pouvant desorber depuis la surface des gouttelettes resterait
identique.
Bruins et al. ont propose cette hypothese a partir d’un raisonnement base sur un calcul de
surface de gouttelette et de nombre de molecules qu’elle contient.
Pour une concentration de 10*5 M, une gouttelette de rayon 1 pm contient 25000 molecules.
L’aire disponible par molecule a la surface de cette gouttelette est de 500 nm2, aire au moins
une centaine de fois superieure a l’espace occupe par une paire de tetrabutylammonium de
bromure (TBABr) [166l Concemant nos composes, nous pouvons evaluer I’aire occupee par

une molecule en assimilant la molecule a une sphere de rayon a. Soit —mar3 le volume occupe

par une molecule. Nous pouvons ecrire l’egalite —mar3 x N= 1cm3 si N est le nombre de

146
molecules par cm3. H en suit —— . N peut etre determine a partir de la relation
4nN

avec p representant la masse volumique exprimee en g/cm3, M la masse molaire et N le nombre

d’Avogadro (N = 6,022 1023)
Pour l’atrazine (M=215, p = 1,187 g/cm3), nous avons a = 415 pm soit une aire a2 proche de 2
nm2. Dans ce cas egalement, l’aire disponible par molecule est largement plus grande que
1’espace occupe par une molecule.
Si la limitation due au manque de surface joue un role important, il faut envisager que la
surface de la gouttelette soit reduite d’un facteur de 100 a 1000. Cette condition pourrait etre
satisfaite par V ensemble des etapes d’evaporation de solvant qui interviennent dans le
processus de formation d’ions en phase gazeuse (succession d’explosions coulombienne et
d’evaporation). Tang et Kebarle ont propose un schema qui presente 1’evolution du rayon R et
de la charge Q d’une gouttelette au cours du temps jusqu’a la desorption du premier ion
(schema etabli a partir de l’observation de la premiere fission des gouttelettes initiales) [44]. H
est possible, a partir de la figure 1.16, de calculer un facteur de concentration F egal a 1600.
La concentration des molecules dans les gouttelettes serait done multipliee par ce meme
facteur. Dans ces conditions, leur surface serait totalement recouverte par des ions (et paires
d’ions).
A partir de 10'5 M et pour des concentrations superieures, la densite en molecules ou ions et
paires d’ions a la surface des gouttelettes n’augmente plus. Le nombre d’ions pouvant desorber
devient constant, ce qui se traduit sur la courbe d’etalonnage par l’apparition d’une saturation
du signal.

Cette augmentation importante de la concentration du solute dans les gouttelettes

pourrait avoir comme autre efifet la formation de residu solide, se traduisant par une diminution
d’efficacite du processus de desorption et done par une baisse du signal[28] [391. Cela pourrait
expliquer la chute du signal notee pour deux des courbes d’etalonnage (tableau 4.5).

La charge des gouttelettes formees par nebulisation electrostatique resulte d’un exces
d’ions positifs ou d’ions negatifs selon le signe des tensions appliquees aux differentes parties

147
de la source d’ionisation, ces ions pouvant etre des impuretes, le solute initialement en solution
sous forme ionisee, ou bien des produits de reactions d’oxydoreduction (par exemple des ions
Ef en mode positif).
Dans le cas des solutes initialement en solution, une augmentation de leur concentration
s’accompagne d’une augmentation de la charge des gouttelettes et par consequent d’une
augmentation de la repulsion electrostatique R entre ces deux gouttelettes, R etant definie par
la relation R=QiQ2/4ns0r2 (ou Qi et Q2 sont les quantites de charge electrique portees par
deux gouttelettes distantes de r). Cette repulsion pourrait devenir assez forte a partir d’une
certaine concentration pour devier certaines gouttelettes de 1’orifice d’echantillonnage et ainsi
diminuer le rapport du nombre d’ions detectes par l’analyseur par rapport au nombre d’ions
introduits dans la source.
Pour verifier cette hypothese, des experiences ont ete realisees avec deux nebuliseurs et deux
pompes [1661. La solution contenant le solute a differentes concentrations est introduce dans la
source par un des nebuliseurs, tandis qu’une solution depourvue de solute (un blanc) est
introduite dans la source par le deuxieme nebuliseur. Dans ce cas, les gouttelettes fortement
chargees sont melangees avec des gouttelettes moins chargees resultant de la nebulisation du
blanc. La distance moyenne entre les gouttelettes fortement chargees est agrandie, et F effet de
repulsion devrait diminuer, retardant 1’apparition de la saturation du signal. Cependant, la
comparaison des deux courbes (un seul nebuliseur et deux nebuliseurs) ne fait pas apparaitre de
difference pour 1’apparition de la saturation. En conclusion, cet effet de repulsion ne semble
pas jouer un role determinant dans Failure de la courbe d’etalonnage.

Les ions en phase gazeuse migrent en direction de F entree du capillaire de transfert

sous F effet du champ electrique et de la difference de pression entre la source et la sortie du
capillaire. Goldstein et al. ont montre qu’au dela d’une certaine densite de charges en phase
gazeuse, le debit de charges dans le capillaire de transfert n’augmente plus car le champ
electrique cree par les charges au voisinage de F entree du capillaire repousse les ions migrant
vers cette demiere[168].

En conclusion, differentes hypotheses ont ete discutees pour tenter d’expliquer l’origine
de la saturation du signal lors de F augmentation de la concentration du solute. Et il semble que
d’apres la litterature, la competition entre les ions pour desorber, la saturation de la surface de

148
la gouttelette en ions et paires d’ions solvates et la repulsion entre les ions en phase gazeuse a
1'entree du capillaire de transfer! soient les hypotheses les plus probables.

- Limites de detection

Les performances de V ionisation par electronebulisation ont ete testees pour une serie
de pesticides en introduction directe a un debit liquide de 2 pl/min en mode positif, de 4 ou 50
pl/min en mode negatif, la phase mobile correspondant a un melange acetonitrile-eau 60/40
(v/v) ou methanol-eau 50/50 (v/v). Les limites de detection, exprimees en mg/1, ont ete
determinees en considerant un rapport signal/bruit S/N egal a 3 pour l’ion majoritaire MH4",
M2+ ou MNa+ a partir d’une moyenne d’une vingtaine de spectres (acquisition en mode
balayage sur 100 uma).
Les resultats obtenus dans les conditions optimales sont regroupes dans le tableau 4.6.

Durant la these, nous avons equipe notre source electrospray d’une assistance
pneumatique. Nous designons par "nebuliseur 1" le nebuliseur original, et par "nebuliseur 2" le
nebuliseur equipe d’une assistance pneumatique. Avec le "nebuliseur 2", nous pouvons
toujours travailler en nebulisation electrostatique pure, a quelques pl/min, en coupant la
circulation d’azote concentrique a 1’aiguille d’introduction.
En mode positif, les reponses des differents pesticides sont assez voisines, avec des limites de
detection comprises le plus souvent entre 0,1 et 0,4 mg/1. Nous pouvons egalement remarquer
que la modification du nebuliseur n’affecte pas la sensibilite pour les faibles debits. Trois
composes ont presente des difficultes dans cette etude, a savoir le dinoterbe, le glyphosate et
l’ioxynil en solution dans le methanol-eau 50/50 (v/v). Pour le dinoterbe, on observe un ion
MIL tres peu abondant. Nous avons ameliore la sensibilite en rajoutant dans la solution de
1’acetate de sodium (limite de detection de 0,8 mg/1, en solution dans methanol-eau 50/50 (v/v)
avec 1,6 mg/1 d’acetate de sodium).

Pour ces trois composes, 1’ionisation en mode negatif a ete testee car ils presentent tous
un groupement -OH, alcool ou acide, qui peut facilement perdre un H4" pour donner un ion [M-
H]\ La principale difficulty en mode negatif est d’eviter la formation d’un arc electrique dans la

149
source (chapitre 1.B). A 4 pl/min, une circulation d’oxygene concentrique a raiguille
d’introduction est indispensable (pression d’entree de 20 psi). Par contre, a 50 gl/mim, la
nebulisation est assistee par une circulation d’azote concentrique a r aiguille d’introduction (
pression d’entree de 40 psi) et l’ajout d’oxygene n’est pas necessaire. Dans ces conditions, les
limites de detection du glyphosate, du dinoterbe et de l’ioxynil sont respectivement de 0,35
mg/1, 0,02 mg/1 et 0,01 mg/1.

- Comparaison avec la source APCI

Les performances de cette source electrospray ont ete comparees a cedes de la source
APCI d’Analytica (voir annexe 3 pour la description de la source et du mecanisme de
formation des ions). Mais auparavant, une etude preliminaire a permis de preciser les
conditions operatoires optimales. Pour cela, nos premieres experiences ont ete realisees en
mode positif a partir d’une solution test de reserpine en solution dans un melange methanol-
eau 50/50 (v/v) contenant 0,015 % d’acide formique a la concentration de 2,5 mg/I. L’intensite
du signal etant maximum pour des debits liquides compris entre 200 et 1000 pl/min (voir figure
2 de 1’annexe 3 ), nous avons choisi de determiner les limites de detection des pesticides pour
un debit de 200 pl/min. Les resultats de cette etude sont presentes dans le tableau 4.7.
Concemant l’atrazine et la propazine, deux composes volatils, les limites de detection
sont equivalentes a celles obtenues precedemment avec la source electrospray.
Pour les autres pesticides, les limites de detection sont en general plus elevees pour la
source APCI comparativement a la source electrospray, en particular pour l’aminotriazole (0,6
mg/1 contre 0,2 mg/1). Ce resultat est explique par une temperature du tube de vaporisation Ti
assez basse (200°C), et par consequent une evaporation du solvant incomplete. Cependant
1’augmentation de Ti se traduit par une baisse de Vintensite du signal en raison de 1’instability
thermique de ces molecules.
Quatre pesticides polaires (avec groupement -OH ou ionise en solution) n’ont donne
aucun signal avec ce deuxieme mode d’ionisation.
Nous pouvons remarquer a partir de ce tableau que la temperature Ti depend fortement
de la nature du compose etudie, rendant difficile 1’analyse par LC/APCI/MS d’un melange

150
complexe a partir d’une seule injection. D’autre part, le glyphosate, le dinoterbe et 1’ioxynil
n’ont pu etre analyses en mode negatif avec la source APCI.
En conclusion, le mode d’ionisation par electronebulisation semble donner pour le
groupe de pesticides etudies de meilleurs resultats concemant la sensibilite. Cependant, il
s’agissait des toutes premieres experiences realisees au laboratoire avec une source APCI. Un
travail supplemental pourrait apporter des ameliorations, en particular lors de r optimisation
des parametres de la source tels que le positionnement du capillaire d’introduction et le reglage
des debits de gaz.

151
Tableau 4.6 : Limites de detection (en mg/1) obtenues pour differents pesticides avec la source
electrospray pour un signal/bruit de 3 (acquisition en mode balayage sur 100 uma).

mode + (2 pl/min)

solute nebuliseur 1 nebuliseur 2 ion solvant

simazine 0,075 ME" CH3CN-H20 60/40 (v/v)

atrazine 0,125 II II
0,1
ametryne II II
0,1
propazine 0,125 II II

cyanazine 0,2 0,15 II II

prometryne 0,05 II II

desethyl atrazine II II
0,1

carbendazime 0,075 0,1 mr CH3CN-H20 60/40 (v/v)

methomyl 0,4 MNa+ CH30H-H20 50/50 (v/v)
aldicarbe 0,35 MNa+ CH30H-H20 50/50 (v/v)
isoproturon 0,25 MKT CH30H-H20 50/50 (v/v)
chlortoluron 0,3 MH* CH30H-H20 50/50 (v/v)
diuron 0,3 MHT CH30H-H20 50/50 (v/v)
aminotriazole 0,2 MH4" CH30H-H20 50/50 (v/v)
dinoterbe 0,8 MNa+ CH3OH-H20 50/50 (v/v) +
CH3COONa 1,6 mg/1
diquat dibromide 0,35 m2+ CH30H-H20 50/50 (v/v)
pyridate CL9673 0,2 MIT CH3CN-H20 60/40 (v/v)
glyphosate : pas de signal
ioxynil: pas sensible dans CH30H-H20 50/50 (v/v) + CH3COONa

mode -

solute nebuliseur 2 ion solvant

glyphosate 0,35 50 pl/min [M-H]' CH30H-H20 50/50 (v/v)
dinoterbe 0,02 50 pl/min [M-H]" CH30H-H20 50/50 (v/v)
ioxynil 0,01 50 pl/min [M-H]' CH30H-H20 50/50 (v/v)
0,01 4 pl/min

152
 [M+Na]+
100 - A 100% = 380000

3
<D>

s
VD
‘Ea
C
£c

n-
300 350 400 450 500 550 600 650 700
m/z

[M-H]'
100- 100% = 1040000
B

1
<3
£
'4>
C/5

I
e

O^n------------ r- i i —i—
100 150 200 250 300 350 400 450 500

m/z

[M-H]'
100- C 100% = 1000000

o —i-------- 1— T
100 150 200 250 300 350 400 450 500
m/z

Figure 4.11 : Spectres de masse de l’ioxynil en mode d’ionisation positif (A) et negatif (B), (C)
pour une concentration de 5 mg/1 en solution dans un melange methanol-eau 50/50 (v/v) +
CH3COONa 10 mg/1 (spectre A), en solution dans methanol-eau 50/50 (v/v) (spectres B + C).
Debit liquide de 2 pl/min (spectre A), 4 gl/min (spectre B), 50 pl/min (spectre C).

153
Tableau 4.7 : Limites de detection (en mg/1) obtenues pour quelques pesticides avec la source
APCI pour un signal/bruit de 3 (acquisition en mode balayage sur 100 uma).

mode + 200 pl/min

solute ion solvant T1/T2

atrazine 0,1 MET CH3CN-H2O 50/50 (v/v) 350°C/200°C

propazine 0,05 II

carbendazime 0,1 MH+ CH3CN-H20 50/50 (v/v) 250°C/200°C

methomyl 0,5 mit CH3OH-H2O 50/50 (v/v) 225°C/200°C

aldicarbe 0,55 Mir CH3OH-H2O 50/50 (v/v) 225°C/200°C

isoproturon 0,35 MET CH3OH-H2O 50/50 (v/v) 250°C/200°C

chlortoluron 0,3 met CH3OH-H2O 50/50 (v/v) 250°C/200°C

diuron 0,45 mit CH3OH-H2O 50/50 (v/v) 250°C/200°C

aminotriazole 0,6 mit CH3OH-H2O 50/50 (v/v) 200°C/200°C

pyridate CL 9673 0,25 Mir CH3CN-H2O 50/50 (v/v) 250°C/200°C

glyphosate, dinoterbe, diquat, ioxynil: pas de signal

154
 CONCLUSION

Cette etude en introduction directe a montre le potentiel de ce type d’ionisation pour

Fetude des pesticides. 11 est tout a fait possible d’analyser une grande variete de composes, de
famille chimique et de polarite tres differentes, avec des limites de detection le plus souvent
comprises entre 0,1 et 0,4 mg/1 en mode d’ionisation positif, et meme jusqu’a 0,01 mg/I en
mode d’ionisation negatif. Des pesticides polaires et thermolabiles comme l’aminotriazole sont
analysables directement par spectrometrie de masse, avec des limites de detection comparables
a celles obtenues pour des pesticides peu thermolabiles comme les s-triazines.

L’ionisation par electronebulisation est une technique d’ionisation douce, qui conduit a
la formation d’ions parents. Mais des informations sur la structure d’un compose sont
accessibles par fragmentations induites par collision (CID) dans la region a pression reduite.
Ainsi, au sein d’une meme famille de pesticides, nous pouvons differencier plusieurs composes
non seulement par la mesure du rapport m/z de l’ion parent et de la structure du massif
isotopique moleculaire, mais egalement par la mise en evidence de certains groupes de
substitution (derive isopropyl pour les s-triazines, derive methyl ou methoxy pour les
phenylurees,...).

En F absence d’assistance a la nebulisation, les debits liquides sont limites a quelques

pl/min et l’intensite du signal depend fortement de la composition de la phase mobile. Les
conditions optimales ont ete definies pour un melange acetonitrile (ou methanol) - eau avec des
rapports en volume de 50/50-60/40. Pour des phases mobiles contenant un pourcentage eleve
d’eau, la nebulisation de la solution devient instable et l’intensite du signal diminue fortement.

Nous pensons encore abaisser les limites de detection de ces pesticides en remplagant la
serie de lentilles entre le premier ecorceur et les filtres d’entree de l’analyseur par un hexapole.
En effet, les premiers resultats obtenus chez Analytica ont montre qu’il etait possible de gagner
un facteur 10 (ou plus) pour les molecules de petites masses, inferieures a 400 Da, ce qui est le
cas pour la plupart des pesticides.

155
B: COUPLAGE

1- DESCRIPTION DU MONTAGE

Avant de realiser le couplage microchromatographie liquide-spectrometrie de masse,

nous avons prefere resoudre au maximum les difficultes experimentales inherentes a la
microchromatographie liquide en reliant la sortie de la microcolonne a un detecteur UV. Le
detecteur UV est equipe d’une cellule haute pression specifique a la microchromatographie
liquide, en forme de Z, de parcours optique 22 mm et de volume 62 nl, precedee par un tube
en silice fondue (29 cm x 60 pm d.i.). Ce choix de montage avec les deux detections en
parallele permettra aussi de comparer la detection ESI/MS par rapport a la detection UV, et en
particular leurs contributions respectives aux pertes d’efficacite analytique de la colonne.

La microcolonne de diametre interieur 300 pm et de longueur 15 cm est remplie de

phase stationnaire Zorbax Rx Cg 80 A, 5pm (LC Packings). Un tube en silice fondue (30 cm x
50 pm d.i.) en sortie de colonne facilite la connexion a un detecteur UV ou spectrometrie de
masse. Afin de minimiser le volume mort du au tube de connexion place entre la vanne
d’injection et la microcolonne, la tete de la microcolonne est inseree directement dans la vanne
d’injection (figure 2.8).

Les deux montages experimentaux utilises sont schematises sur la figure 4.12.
- En elution isocratique, le montage comprend un degazeur de solvant, une pompe
chromatographique et un diviseur de debit. Les pesticides en solution sont injectes grace a une
boucle interne de 60 nl, puis separes dans la microcolonne et detectes par UV ou par ESI/MS.
Pour la detection UV, les deux tubes en silice fondue (tube en sortie de la microcolonne et tube
du detecteur) sont joints bout a bout a I’aide d’un tube Teflon concentrique. Pour la detection
ESI/MS, le tube en silice fondue en sortie de la microcolonne est joint a V aiguille
d’introduction de la source electro spray (tube en acier inoxydable, 22 cm x 115 pm d.i.) par un
union Upchurh sans volume mort.

156
 - En elution graduee, une deuxieme pompe chromatographique est rajoutee au
montage. Le melange des solvants est realise a haute pression a un debit liquide de quelques
centaines de pl/min. En sortie du diviseur de debit, le debit liquide n’est plus que de quelques
pl/min. Un premelange des solvants avant pompage permet de s’affranchir des phenomenes de
contraction de volume et de reduire les changements de viscosite au cours de la
programmation.

Avant de mettre au point le couplage, le spectrometre de masse est etalonne avec une
solution de trois peptides (dissouts dans un melange methanol-eau 50/50 (v/v)) qui sont
caracterises par des ions pseudo-moleculaires de rapport m/z 90,1; 217,3; 468,5. Les
parametres de fonctionnement de la source electrospray sont ensuite optimises a partir d’une
solution d’atrazine, d’aminotriazole ou de chlortoluron a la concentration de 5 mg/1 dans un
melange acetonitrile-eau 50/50 (v/v) ou methanol-eau 40/60 (v/v). Afin de favoriser
l’abondance de l’ion MH1" au detriment de ses fragments formes par CID, la difference de
potentiel AE est fixee a 100V.

157
 |aLC/UV

Detecteur UV
Degazeur Pompe HPLC Diviseur de
en ligne
Microcolonne
Teflon

Phase mobile 30 cmX 50 gm d.i. 29 cmX 60 gm d.i.

Vanne d'injection

Interface electrospray
jaLC/ESI/MS

Union
Upchurch

22 cm X115 gm d.i.

Figure 4.12 : Schemas des montages gLC/UV et gLC/ESI/MS.

 2 - RESULTATS ET DISCUSSION

2.a -Mise au point de la methode d’analyse

La separation de cinq s-triazines (desethyl atrazine, simazine, atrazine, propazine,

prometryne), chacune a la concentration de 4 mg/1, obtenue par elution isocratique a un debit
de 4 pl/min, est presentee sur la figure 4.13. Les nombres de plateaux N determines
experimentalement par pLC/UV et pLC/ESI/MS ainsi que les temps de retention t% sont
donnes dans le tableau 4.8.

La premiere observation deduite de ces resultats est une augmentation continue de N

avec tR (ou encore du facteur de capacite k’). Cette evolution peut s’expliquer par un
remplissage imparfait de la microcolonne ou par la presence d’un filtre place en tete de colonne
qui pourrait engendrer un volume extra-colonne. La premiere hypothese semble la plus
plausible en raison de la difficulte rencontree lors d’un remplissage d’une microcolonne de 300
pm de diametre interieur avec des particules de Zorbax Rx, Cg[169]. Nous pouvons estimer a
partir de ce tableau que les consequences de la difficulte du remplissage deviennent negligeable
pour les composes dont le k’ est superieur a 1.
De plus, l’efficacite de cette microcolonne, de 15 cm de longueur, couplee a un detecteur UV
ou a un spectrometre de masse equipe d’une interface electrospray tend vers une valeur
maximale comprise entre 9000 et 10000 plateaux, soit 60000-67000 plateaux/m (tableau 4.8).
La valeur de la hauteur de plateau reduite h est alors comprise entre 3 et 3,3 pour une vitesse
reduite de la phase mobile v egale a 5,3 (avec Dm, le coefficient de diffusion moleculaire du
solute dans la phase eluante, egal a 0,77 10'9 m2/s pour 1’atrazine en solution dans un melange
acetonitrile-eau 50/50 (v/v) a 20°C). Nous pouvons comparer ces valeurs experimentales avec
les valeurs optimales hmm et Vopt determinees a partir de l’equation de Knox h = f(v) (equation
2.8). Dans le cas ideal (bon remplissage de la colonne et cinetique d’echange des solutes entre
la phase eluante et la phase stationnaire rapide), les coefficients B,A,C sont voisins de 2,1 et
0,1 respectivement. h passe alors par un minimum hmm = 2,4 , pour une vitesse reduite egale a

159
2,7. Dans notre cas, avec un remplissage difficile de la colonne (A>1) et v>Vopt, il n’est done
pas anormal de trouver h voisin de 3 et superieur a fw
La seconde observation du tableau 4.8 conceme l’ecart de temps de retention et du
nombre de plateaux entre les deux montages pour Vensemble des solutes. H s’explique par une
difference de volume extra-colonne engendre par les tubes de connexion entre la microcolonne
et le detecteur (voir figure 4.12) : 1,41 pi en detection UV et 2,875 pi en detection ESI/MS
(aiguille d’introduction comprise). La difference de volume de 1,465 pi devrait se traduire par
une difference de temps de 22 s pour un debit liquide de 4 pl/min. Si on tient compte du
volume de la cellule du detecteur UV de 62 nl, elle serait plutot de 21 s. Dans nos experiences,
le retard observe en pLC/ESI/MS est de 17 s. En raison des variations probables du diametre
interieur sur la longueur d’un tube, cet ecart parait tout a fait acceptable.
Ce volume extra-colonne supplemental dans le montage pLC/ESI/MS du aux connexions
entre la microcolonne et le detecteur s’accompagne d’une augmentation de la variance extra-
colonne et par consequent d’une diminution du nombre de plateaux par comparaison au
montage pLC/UV. Cette demiere est plus importante pour les composes peu retenus (12 %
pour le desethyl atrazine et 4 % pour la prometryne).

tR (min) k’(3) N
pLC/UV(1) pLC/ESI/MS (2) pLC/UV(1) pLC/ESI/MS(2)

desethyl atrazine 3,20 3,48 0,05 3850 3400

simazine 4,10 4,38 0,34 4700 4500

atrazine 5,00 5,28 0,64 5800 5250

propazine 6,40 6,68 1,10 8050 7550

prometyne 8,10 8,38 1,66 8850 8500

(1) a partir de la figure 4.13

(2) a partir de la figure 4.13 en mode SIM

(3) k’ = (tR-to)/to avec to = 3,05 min (determine par pLC/UV a partir du temps de retention de Furacil)

Tableau 4.8 : Calcul du temps de retention tR, du facteur de capacite k’ et du nombre de

plateaux N des cinq composes pour les deux montages.

160
 Nous pouvons aussi, a partir de ces resultats, comparer les valeurs de variance extra-
colonne determinees experimentalement pour les deux montages a partir de la relation
suivante:

2
ct tot = —— + a 2 ext
N

ou Vr, N, o2tot, cr2ext representent respectivement le volume de retention du compose considere,

le nombre de plateaux, la variance totale et la variance extra-colonne (variances exprimees en
unite de volume). L’ordonnee a l’origine dans le trace de la droite a2tot = f (VR2) donne a2ext
(figure 4.14).
Les valeurs de o2^ determinees graphiquement correspondent a
32,5 10"3 pi2 en pLC/UV
et 44,5 10'3 pi2 en pLC/ESI/MS
soit une difference entre les deux montages Aa2ext de 12 10*3 pi2.
Les contributions dispersives importantes proviennent de rinjection, des tubes de
connexion (et des raccords) et du detecteur. a2ext se decompose done en la somme des
variances de 1’injecteur (c2^), des tubes de connexions (a2tube) et du detecteur (a2det).

C ext — O inj O tube O det

Ci dessous sont donnes les resultats du calcul de ces differentes variances pour un debit liquide
de 4 pl/min et Dm = 0,77 10‘9 m2/s.
Pour le montage uLC/UV :
- L’injection d’un volume de 60 nl conduit a une variance c2^ de 0,9 10"3 pi2 soit 3 % de
c?2ext experimental.
- Le tube en silice fondue en sortie de la microcolonne (30 cm x 50 pm d.i.) conduit a une
variance o^ube de 1,3 10*3 pi2 soit 4 % de c2^ experimental.
- Le tube en silice fondue du detecteur (29 cm x 60 pm d.i.) conduit a une variance ct2^
de 2,7 10"3 pi2 soit 8 % de o2ext experimental.
- La cellule de detection de volume 62 nl conduit a une variance c^ccii de 0,6 10'3 pi2 soit 2
% de o2ext experimental.

161
 - La constante de temps electronique x du detecteur (TR = 2,2x = 2 s soit x = 0,9 s) produit
une variance temporelle a2temps de 3,6 10"3 pi2 soit 11 % de o2^ experimental.
La somme de toutes ces variances extra-colonne equivaut a 9,1 10'3 pi2 soit 28 % de la
variance extra-colonne totale determinee experimentalement (32,5 10'3 pi2).
Pour le montage uLC/ESI/MS :
- L’injection d’un volume de 60 nl conduit a une variance o2^ de 0,9 10'3 pi2 soit 2 % de
cj2ext experimental.
- Le tube en silice fondue en sortie de la microcolonne (30 cm x 50 pm d.i.) conduit a une
variance o2tube de 1,3 10'3 pi2 soit 3 % de o2ext experimental.
- L’aiguille d’introduction de la source (22 cm x 115 pm d.i.) conduit a une variance o2^
de 27,2 10"3 pi2 soit 61 % de a2ext experimental
La somme de toutes ces variances extra-colonne equivaut a 29,4 10'3 pi2 soit 66 % de la
variance extra-colonne totale determinee experimentalement (44,5 10'3 pi2).
L’ecart entre la valeur theorique et la valeur experimentale, aussi bien en pLC/UV
qu’en pLC/ESI/MS, peut s’expliquer par une imprecision de quelques % sur la valeur des
diametres interieurs des tubes. De plus, ces calculs ne tiennent pas compte de la contribution
des raccords a la variance extra-colonne qui resulte, d’une part de leurs volumes, d’autre part
d’un changement eventuel de diametre entre un tube et le raccord pouvant entrainer une
perturbation de l’ecoulement de 1’effluent chromatographique. Enfin, cet ecart pourrait
provenir en partie d’un remplissage imparfait de la microcolonne.
Par le calcul, la difference de variance extra-colonne entre les deux montages est de
23,9 10*3 pi2 (en tenant compte de la contribution du volume de la cellule du detecteur UV) au
lieu de 12 10'3 pi2 determinee experimentalement. Cet ecart doit probablement provenir d’une
variation du diametre interieur des tubes, qui meme faible, s’accompagne de modifications
importantes dans le resultat des calculs de cr2*,*,. Ainsi, une variation de ± 10 pm sur le
diametre interieur d’un tube entrame une fluctuation de + 59 % sur le calcul de o2tube pour un
tube de 60 pm de diametre interieur moyen et 29 cm de long, ± 34 % pour un tube de 115 pm
de diametre interieur moyen et 22 cm de long.

162
 100- B

B
2
0.05 U.A. A I I) ll
i
§
3
CJ \ l M
VNl
Absorbance (1=220 nm)

0-
T
20 s
Temps (min)

100

u V £
T i i r
0 3 6 9 1
Temps (min)
f 1 2
4

3O
u

\
J T
t 6 9
20 s
Temps (min)

Figure 4.13 : Separation de cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2), atrazine (3),
propazine (4), prometryne (5) en elution isocratique a 4 gl/min. Chaque pesticide est a la
concentration de 4 mg/1 en solution dans acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60
nl. Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Chromatogramme A : Detection UV a 220 nm.
Chromatogrammes B et C : Detection ESI/MS en mode balayage (m/z 180-250, 0,7 scan/s) et
en mode SIM (m/z 188,1 -202,1-216,1 -230,1 -242,1; 1,72 cycles/s).

163
 120 j
jiLC/UV

100 --

O 80 --

60 ■ ■

40 --

20 --

o -I---------------- 1---------------- 1---------------- 1---------------- 1---------------- 1---------------- 1

0 200 400 600 800 1000 1200

volume de retention2 (^l2)

140 T
liLC/ESI/MS
120 --

100 --

80 --

40 --

20 --

volume de retention2 (jil2)

Figure 4.14 : Variance totale du montage (o2tot) en fonction du carre du volume de retention
pour la detection UV et la detection par spectrometrie de masse.

164
 En conclusion, meme si le nombre de plateaux est legerement inferieur avec Ie montage
pLC/ESI/MS par rapport au montage pLC/UV pour 1’ensemble des solutes, cette difference
nous parait tout a fait acceptable, surtout si on considere une marge d’erreur d’environ 10 %
sur leur determination. Tout comme le detecteur UV equipe d’une cellule en Z specialement
developpee pour les microcolonnes, la source electrospray apparait aussi comme une interface
de choix entre la microcolonne et le spectrometre de masse.

La dilution de chaque solute dans les deux montages a ete evaluee en calculant
differents parametres tel que :
- Cmax la concentration du solute au sommet du pic d’elution
-fie facteur de dilution au sommet du pic egal a Co/Cm* (C0 etant la concentration
du solute dans l’echantillon injecte)
- le volume du pic, equivalent a 4atot, qui represente le volume de phase mobile dans
lequel 95 % du solute est elue (atot, l’ecart-type total, est exprime en unite de volume).
En assimilant le pic d’elution a un pic Gaussien, Cmax verifie la relation

C
Vmax = jt
VR

ou q0 represente la quantite de solute introduite dans la colonne. Elle est egale a 0,24 ng pour
une concentration C0 de 4 mg/1 et un volume d’injection de 60 nl. Suite a la dilution appoirtee
par la colonne, 95 % de la quantite injectee (soit 0,228 ng) est eluee dans un volume de 4-atot
pi, ce qui correspond a une concentration moyenne de C (mg/1). Les resultats de nos calculs
sont presentes dans le tableau 4.9. Pour les deux montages pLC/UV et pLC/ESI/MS et une
microcolonne de 300 pm de diametre interieur, f est voisin de 10 pour les composes les moins
retenus et de 15 pour les composes les plus retenus, le volume de pic etant proche de 900 nl et
1400 nl respectivement. Par comparaison, avec une colonne conventionnelle de 4,6 mm de
diametre interieur et de meme longueur, la dilution theorique pour un volume d’injection de 60
nl serait 300 fois plus elevee a un debit de 1 ml/min (f est egal a 4000 pour la propazine en
detection UV). D’ou la necessite d’injecter des volumes d’echantillon bien plus importants (20

165
pi au lieu de 60 nl) pour avoir une sensibilite voisine de celle obtenue en
microchromatographie.

Cmax f volume de pic C

(mg/1) (nl) (mg/1)

ULC/UV
desethyl atrazine 0,46 8,7 823 0,28
simazine 0,40 10 954 0,24
atrazine 0,36 11,1 1048 0,22
propazine 0,34 11,8 1138 0,20
prometryne 0,28 14,3 1374 0,17

pLC/ESI/MS
desethyl atrazine 0,40 10 952 0,24
simazine 0,37 10,8 1042 0,22
atrazine 0,33 12,1 1163 0,20
propazine 0,31 12,9 1228 0,19
prometryne 0,26 15,4 1450 0,16

Tableau 4.9 : Evaluation de la dilution pour chacun des composes pour les deux montages.
Initialement, 60 nl d’une solution, dans laquelle chaque compose est a la concentration de 4
mg/1, est introduce en tete de colonne (q0 la quantite initiale = 0,24 ng). La separation est
realisee en mode isocratique.

166
 Sur la figure 4.15 sont presentes les chromatogrammes obtenus par pLCAJV et
pLC/ESI/MS (detection en mode SIM) pour rinjection de 60 nl d’une solution dans laquelle
chaque s-triazine est a la concentration de 0,1 mg/1. Suite a la dilution apportee par la colonne,
la concentration maximale des solutes dans le detecteur est voisine de 0,01 mg/1 pour les
premiers elues et de 0,007 mg/1 pour les demiers elues. Le rapport signal/bruit est compris
entre 1,6 et 5,4 en detection UV, 1,6 et 6,7 en detection par spectrometrie de masse. Nous
pouvons ainsi conclure a une limite de detection (pour un rapport signal/bruit de 3) voisine de
0,1 mg/1 avec les deux modes de detection et pour cette famille de pesticides, la separation
etant realisee en elution isocratique. Nous pouvons enfin noter que cette limite de detection est
du meme ordre de grandeur que celles etablies pour chacun de ces pesticides en introduction
directe et en mode balayage (tableau 4.6). Ce resultat s’explique par le fait que la dilution des
composes entre V injection et la detection dans le montage pLC/ESI/MS est compensee par la
plus grande sensibilite du mode d’acquisition SIM.

Les courbes d’etalonnage de la simazine et de la propazine obtenues par gLC/ESI/MS

sont donnees sur la figure 4.16. Nous avons reporte le rapport des aires simazine/atrazine et
propazine/atrazine en fonction de la concentration de la simazine (ou de la propazine), la
concentration de 1'atrazine etant de 2 mg/1. Cette demiere joue le role d’etalon interne et
permet de s’affranchir des fluctuations d’ionisation durant 1’analyse, et done de la sensibilite,
ainsi que des variations des volumes d’injection. La linearite est bien verifiee sur toute la
gamme de concentrations etudiees (0,1 mg/1 - 4 mg/1) contrairement aux courbes d’etalonnage
obtenues par introduction directe ou une saturation de l’intensite du signal apparait a partir
d’une concentration de 1,3 mg/1 (figure 4.10 et tableau 4.4). En couplage, en raison de la
dilution apportee par la colonne, la saturation du signal devrait apparaitre a partir d’une
concentration de solute de 15 mg/1. Cette concentration est bien plus elevee que celles choisies
dans cette etude.

167
 A i
16.10"* U.A. -

Temps (min)

T i i r
t 3 6 9
20 s
Temps (min)

Figure 4.15 : Separation de cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2), atrazine (3),
propazine (4), prometryne (5) en elution isocratique a 4 pl/min. Chaque pesticide est a la
concentration de 0,1 mg/1 dans acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60 nl. Phase
mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Chromatogramme A : Detection UV a 220 nm.
Chromatogramme B : Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-202,1-216,1-230,1 -242,1;
1,72 cycles/s).

168
 2,5
rapport des aires

y = 0,5645x4-0,0438

concentration de simazine (mg/1)

rapport des aires

y = 0,5115x 4- 0,0256

concentration de propazine (mg/1)

Figure 4.16 : Courbes d’etalonnage de la simazine et de la propazine par pLC/ESI/MS, avec

l’atrazine comme etalon interne a la concentration de 2 mg/1.

169
 La separation de neuf pesticides (pyridate CL9673, desethyl atrazine, carbendazime,
simazine, cyanazine, atrazine, ametryne, propazine, prometryne) par un gradient d’elution
acetonitrile-eau a un debit de 4 pl/min est presentee sur la figure 4.17 (detection UV) et la
figure 4.18 (detection par ESI/MS, mode balayage), chacun des pesticides etant a la
concentration de 5 mg/1. Tous ces pesticides sont detectes par pLC/ESI/MS en mode SIM a la
concentration de 0,2 mg/1 avec un rapport signal/bruit compris entre 1,7 et 5,3 (figure 4.19).
En detection par spectrometrie de masse, le bruit de fond est beaucoup plus important pendant
les quinze premieres minutes (figure 4.19), periode de separation pendant laquelle 1’effluent
chromatographique qui penetre dans la source d’ionisation contient un fort pourcentage d’eau.
En 1'absence de toute assistance a la nebulisation (gaz concentrique a 1’aiguille d’introduction
ou vibrations ultrasoniques) une nebulisation correcte de 1’effluent au debut du gradient
requiere d’une part une augmentation des tensions dans la source d’autre part une
augmentation de la temperature et du debit d’azote a contre-courant. Cependant, il nous est
impossible de modifier ces parametres au cours de 1'analyse et de verifier qu’ils sont
correctement optimises, en particular de controler la stabilite du signal. Nous avons done
choisi de realiser ces analyses apres avoir regie les parametres de la source pour une
composition de phase mobile equivalente a 50 % de solvant A, composition qui correspond a
celle obtenue a mi-programmation.

La sensibilite en pLC/ESI/MS en utilisant un gradient d’elution est du meme ordre de

grandeur que celle obtenue par elution isocratique. Cependant, les temps de retention ne sont
pas reproductibles d’une analyse a une autre. Le tableau 4.10 regroupe ces demiers, mesures
pour trois injections consecutives en detection ESI/MS. Nous notons des ecarts de temps non
negligeables de 6 a 11 % selon le solute. Us pourraient avoir pour origine un mauvais
reconditionnement de la colonne entre deux injections. A la fin d’une separation, la colonne est
rincee par un volume de solvant A (condition initiale du gradient) equivalent a 5 fois son
volume mort, ce qui devrait etre suffisant. Ces ecarts s’expliqueraient plutot par un mauvais
fonctionnement du systeme Acurate AC-70 (qui comprend une chambre de melange et un
diviseur de debit) du fait d’un bouchage anterieur et des difficultes de sa remise en etat.

170
 0.035 U.A. -

Temps (min)

Figure 4.17 : Separation de neuf pesticides : pyridate CL9673 (1), desethyl atrazine (2),
carbendazime (3), simazine (4), cyanazine (5), atrazine (6), ametryne (7), propazine (8),
prometryne (9) en gradient d’elution a 4 pl/min. Chaque pesticide est a la concentration die 5
mg/1 en solution dans acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60 nl. Solvant A :
acetonitrile-eau 90/10 (v/v). Solvant B : acetonitrile-eau 10/90 (v/v). Programmation (voir le
profil de gradient ci-dessous). Detection UV a 220 nm.

Profil de gradient

171
 ^ Vu4-U*4>W vl IVmJuUW

Temps (min)

m/z 207,0
4)

.S'
"5
c

O
1----------------- r ~r
f 16 24 32
20 s
Temps (min)

m/z 192,1

§•
1
§
§
U
i---------------------r "T"
t 8 16 24 32
20 s
Temps (min)

32
20 s
Temps (min)

Figure 4.18 : Separation de neuf pesticides : pyridate CL9673 (1), desethyl atrazine (2),
carbendazime (3), simazine (4), cyanazine (5), atrazine (6), ametryne (7), propazine (8),
prometryne (9) en gradient d’elution a 4 pl/min. Chaque pesticide est a la concentration de 5
mg/1 en solution dans acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60 nl. Gradient
acetonitrile-eau (identique a la figure 4.17). Detection ESI/MS en mode balayage (m/z 180-
250, 0,7 scan/s).

172
 1
100 -

20 s
Temps (min)

Figure 4.19 : Separation de neuf pesticides : pyridate CL9673 (1), desethyl atrazine (2),
carbendazime (3), simazine (4), cyanazine (5), atrazine (6), ametryne (7), propazine (8),
prometryne (9) en gradient d’elution a 4 pl/min. Chaque pesticide est a la concentration de 0,2
mg/1 en solution dans acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60 nl. Gradient
acetonitrile-eau (identique a la figure 4.17). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-
192,1 -202,1 -207,0-216,1-228,1 -230,1 -241,1-242,1; 1,71 cycles/s).

1 2 3 CV (%)

pyridate CL9673 4,48 5,18 4,78 7,3

desethyl atrazine 11,68 11,63 10,33 6,8
carbendazime 13,13 13,08 11,68 6,5
simazine 18,93 20,28 17,28 8,0
cyanazine 21,28 23,93 19,38 10,6
atrazine 25,08 28,38 23,28 10,1
ametryne 30,68 33,28 27,98 8,6
propazine 31,53 33,88 28,68 8,3
prometryne 35,58 37,08 31,88 7,7

Tableau 4.10 : Etude de la repetabilite des temps de retention (min) en gradient d’elution a 4
gl/min.

173
 Suite au probleme precedent, nous avons decide de construire un systeme melangeur de
solvant - diviseur de debit a partir d’une chambre de melange Lee Visco de volume 15 pi, d’un
Te Upchurch (UPC 727) et de deux tubes en silice fondue (LC Packings).
Afin de s’aSranchir des changements de viscosite et de compressibilite de la phase
mobile pendant la programmation du gradient et de minimiser les pulsations engendrees par les
pompes, les pertes de charges a travers les capillaires ApcaP doivent etre largement superieures
a celle existante dans la microcolonne Ap^ax =oi.
Le diviseur de debit a ete construit a partir des deux capillaires suivants :
- (1) n = 12,5 pm Li = 17,5 cm
- (2) r2 = 25 pm L2 = 17,4 cm
Le rapport R des debits a travers les deux capillaires (1) et (2), calcule a partir de la
relation de Poiseuille, serait egal a 0,06. Experimentalement, pour une phase mobile methanol-
eau et un debit liquide total de 280 pl/min, le debit mesure est en sortie du capillaire (1) de 10
pl/min (soit R = 0,04) et en sortie de la microcolonne de 3,5 pl/min.

solvant A

tube en peek Te Upchurch

Chambre de
solvant B melange (15 pi)

(1) et (2): tubes en silice fondue

Figure 4.20 : Schema du systeme melangeur de solvant - diviseur du debit construit au

laboratoire.

Les performances de ce systeme ont ete testees a partir de la separation d’un melange
de dix phenylurees avec un gradient d’elution methanol-eau et la mesure des temps de
retention de ces composes pour trois injections consecutives.

174
 La separation de dix phenylurees (fenuron, metoxuron, monuron, monolinuron,
chlortoluron, diuron, buturon, isoproturon, linuron, neburon) en utilisant un gradient d’elution
methanol-eau a un debit de 3,5 pl/min est presentee sur la figure 4.21 (detection UV) et la
figure 4.22 (detection par ESI/MS, mode SIM), chacun des pesticides etant a la concentration
de 4 mg/1. Le tableau 4.11 regroupe les temps de retention pour trois injections consecutives
en detection ESI/MS. Les ecarts sont inferieurs ou egaux a 0,5 % pour l’ensemble des
composes, ce qui est tout a fait acceptable. Nous pouvons ainsi conclure que la non
reproductibilite des temps de retention dans 1'experience precedente etait due a un mauvais
fonctionnement du systeme melangeur-diviseur Acurate.

En detection par spectrometrie de masse, le pic d’elution du neburon n’est visible que
sur l’un des trois chromatogrammes. Ces analyses ont ete realisees apres avoir regie les
parametres de la source pour une composition de phase mobile equivalente a 40 % du solvant
A. Le neburon est elue vers 35 min dans une phase mobile dont la composition est
theoriquement de 80 % de solvant A. En realite, si nous tenons compte du volume mort entre
le melangeur et r aiguille d’introduction de la source, elle serait voisine de 70 % de solvant A.
II est done possible d’attribuer V absence de detection de ce compose a une mauvaise efficacite
du processus d’ionisation, les difFerents parametres de la source (tensions, temperature et debit
d’azote a contre-courant) n'etant pas optimises pour cette composition de phase mobile. Pour
verifier cette hypothese, les parametres de la source ont ete optimises pour une composition de
phase mobile equivalente a 70 % de solvant A, et trois injections consecutives d’une solution
de neburon (a la concentration de 4 mg/1) avec elution isocratique (70 % de solvant A) a un
debit de 3,5 pl/min ont ete effectuees. Dans ces nouvelles conditions, le neburon est detecte a
chaque essai (figure 4.23).

175
 i i i i r
0 8 16 24 32
Temps (min)

Figure 4.21 : Separation de dix phenylurees : fenuron (1), metoxuron (2), monuron (3),
monolinuron (4), chlortoluron (5), diuron (6), buturon (7), isoproturon (8), linuron (9),
neburon (10) en gradient d’elution a 3,5 pl/min. Chaque pesticide est a la concentration de 4
mg/1 en solution dans methanol-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60 nl. Solvant A :
methanol-eau 90/10 (v/v). Solvant B : methanol-eau 10/90 (v/v). Programmation (voir Ie profil
de gradient ci-dessous). Detection UV a 240 nm.

profil de gradient

176
 Temps (min)

100 -

Temps (min)

Figure 4.22 : Separation de dix phenylurees : fenuron (1), metoxuron (2), monuron (3),
monolinuron (4), chlortoluron (5), diuron (6), buturon (7), isoproturon (8), linuron (9),
neburon (10) en gradient d’elution a 3,5 pl/min. Chaque pesticide est a la concentration de 4
mg/1 en solution dans methanol-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60 nl. Gradient
methanol-eau (identique a la figure 4.21). Detection ESI/MS en mode SIM (voir annexe 5
pour les parametres d’acquisition).

177
 1 2 3 CV(%)

fenuron 14,00 13,95 13,95 0,2

metoxuron 19,60 19,45 19,40 0,5
monuron 21,30 21,25 21,20 0,2
monolinuron 24,25 24,20 24,15 0,2
chlortoluron 25,50 25,40 25,45 0,2
diuron 26,95 27,00 27,10 0,3
buturon 27,00 27,10 27,10 0,2
isoproturon 27,35 27,30 27,30 0,1
linuron 29,35 29,40 29,45 0,2
neburon 35,00

Tableau 4.11 : Etude de la repetabilite des temps de retention (min) en gradient d’elution a 3,5
pl/min.

178
 100 -

I
<D
O*
1
1

^"lAvW-V-
■*Vyk-l^l*w^AvVj,'V^A^%*’S.Si^W

10 15
Temps (min)

100 -
£
cd

i i i r
0 5 10 15
Temps (min)

100 -

Temps (min)

Figure 4.23 : Elution isocratique du neburon a 3,5 pl/min. Le pesticide est a la concentration
de 4 mg/1 en solution dans methanol-eau 50/50 (v/v). Volume d’injection de 60 nl. Phase
mobile : 70 % A (Solvant A : methanol-eau 90/10 (v/v). Solvant B : methanol-eau 10/90
(v/v)). Detection ESI/MS en mode SIM (voir annexe 5 pour les parametres d’acquisition).

179
 A partir des conditions operatoires precedemment definies injection d’un volume de 60
nl), les limites de detection en mode SIM sont voisines de 0,1 mg/1. Cette valeur est bien au
dessus de celle requise par les normes de potabilite, a savoir 0,1 pg/1 par pesticide
individualise. Le gain d’un facteur 1000 en sensibilite est done necessaire pour atteindre les
limites de detection imposees par la legislation sur l’eau.

H est tout a fait possible d’injecter des volumes d’echantillon beaucoup plus importants
sur une microcolonne sans perdre trop en efficacite, simplement en ajustant le solvant
d’echantillonnage par rapport a la phase mobile (chapitre 2.C). En effet, si les solutes sont
dissous dans un solvant de force eluante beaucoup plus faible que celle de la phase mobile, ils
resteront fixes pendant toute la duree de l’injection en tete de colonne et seront ainsi
concentres sur une toute petite quantite de phase stationnaire. Les solutes seront ensuite elues
par la phase mobile et separes. Dans notre cas particular, en chromatographie de partage a
polarite de phases inversee, l’eau peut etre choisie comme solvant d’echantillonnage (ou
"d’enrichissement").

L’infiuence du volume d’injection sur le gain de sensibilite ainsi que sur les
performances analytiques de la separation est illustree sur la figure 4.24 pour trois volumes : 1
pi (boucle interne), 10 pi et 50 pi (boucle exteme), avec detection UV. Les cinq s-triazines
(desethyl atrazine, simazine, atrazine, propazine, prometryne), chacune a la concentration de
0,1 mg/1 dans l’eau MilliQ, sont separees par elution isocratique, le debit etant fixe a 4 pl/min.
Par comparaison a un volume d’injection de 60 nl (et dans le cas ou les solutes sont dissous
dans un melange acetonitrile-eau 50/50 (v/v)) (figure 4.15), nous pouvons evaluer le gain
moyen de sensibilite (en hauteur absolue) respectivement pour les trois volumes precedemment
indiques a 21, 215 et 600. Avec un volume d’injection de 50 pi, la qualite de la separation reste
sensiblement identique. En contrepartie, le temps d’analyse augmente : de 11 min pour un
volume d’injection de 1 pi, il passe a 34 min pour un volume d’injection de 50 pi. II inclue le
temps d’injection respectivement pour les trois volumes d’injection de 15s, 150s et 750s (12,5
min). De plus, pour les volumes d’injection de 10 pi et de 50 pi, les conditions initiates
d’elution des solutes s’apparentent a une elution par gradient. En effet, apres le passage d’un
volume important d’eau (jusqu’a 16 fois le volume mort de la microcolonne pour un volume
d’injection de 50 pi), la phase mobile intraparticulaire est riche en eau. Au cours de 1’analyse,

180
elle s’enrichit progressivement en solvant organique, pour atteindre la composition de la phase
mobile pompee. Par rapport a la fin d’une programmation de gradient (ou le pourcentage de
solvant organique est le plus souvent superieur a 50 %), ces conditions favorisent les
interactions solute-phase stationnaire, ce qui se traduit par des temps de retention eleves.

Avec un volume d’injection de 1 pi, les cinq s-triazines sent aisement detectables a la
concentration de 0,1 mg/1 (dans 1’eau) par pLC/ESI en mode balayage (figure 4.25). Par
comparaison a un volume d’injection de 60 nl, le gain moyen de sensibilite (exprimee par le
rapport signal/bruit) en mode SIM est de 40. Dans ces nouvelles conditions operatoires, les
cinq pesticides sont detectes en mode SIM a la concentration de 1 pg/1 avec un rapport
signal/bruit compris entre 1 et 3,35 (figure 4.26).

Pour obtenir des limites de detection de 0,1 pg/1 par pLC/ESI/MS, il est necessaire
d’injecter des volumes d’echantillon superieurs ou egaux a 10 pi (figure 4.27 et figure 4.28).
Le bruit de fond est particulierement eleve dans l’intervalle de temps ou 1’efQuent
chromatographique contient un fort pourcentage d’eau. Une variation brusque de la ligne de
base du chromatogramme, assimilable a un pic d’elution, est a signaler avant 1’elution des cinq
pesticides, meme lorsque de l’eau MilliQ non dopee est injectee (chromatogramme B de la
figure 4.27). II pourrait s’agir d’impuretes plus polaires que les s-triazines presentes dans l’eau
MilliQ ou bien d’une transition entre deux constitutions differentes de 1’effluent (solvant de
dilution des solutes et phase mobile composee du melange acetonitrile-eau 50/50 (v/v)) qui se
traduirait par un changement brutal du regime de nebulisation.

Cette methode de concentration en tete de colonne, interessante par sa simplicity de

mise en oeuvre, ne peut s’appliquer qu’aux pesticides moyennement ou faiblement polaires
comme les s-triazines. En effet, les pesticides polaires commencent deja a migrer dans la
microcolonne pendant la duree de V injection sous V influence du solvant d’echantillonnage. De
plus, la presence d’une forte proportion d’eau dans 1’efHuent dans lequel ils eluent rend difficile
leur detection par ESI/MS (bruit de fond eleve et le signal instable). Nos meilleurs resultats
concemant la detection de l’aminotriazole (solute polaire) dans une eau MilliQ ont ete obtenus
avec un volume d’injection de 1 pi. Pour des volumes d’injection superieurs a 1 pi,
1’importance du bruit de fond rend impossible toute detection de ce compose a 1’etat de trace.

181
Par pLC/ESI/MS, nous detectons l’aminotriazole en mode balayage a une concentration de 0,1
mg/I (figure 4.30). En mode SIM, la sensibilite atteinte est de 10 jig/1 (figure 4.31).

Cette etude a done montre l’interet du couplage microchromatographie liquide-

spectrometrie de masse par V intermediate d’une interface electrospray dans 1’analyse de
polluants a l’etat de traces.
Nous obtenons des limites de detection voisine de 0,1 (ig/1 pour un certain nombre de
s-triazines grace a une methode tres simple de preconcentration en tete de colonne. Ces limites
de detection sont equivalentes aux concentrations maximales des pesticides admises dans les
eaux potables.
Pour des pesticides plus polaires, il parait tout a fait envisageable de mettre en evidence
des pollutions accidentelles, avec des concentrations de polluants de quelques gg/1, a condition
que l’echantillon d’eau etudie soit peu charge en matiere organique et inorganique. La
detection a des concentrations inferieures necessite au prealable une preconcentration par
extraction liquide-Iiquide ou liquide-solide.

Tous ces resultats experimentaux ont ete obtenus a partir de l’eau MilliQ. H est
necessaire de completer cette etude par quelques exemples d’analyse directe d’echantillons
reels (eau de robinet et eaux de riviere) afin de preciser la sensibilite de notre methode
analytique dans Ie cas de matrices chargees.

182
 0.25 U.A. -

Temps (min) Temps (min)

0.56 U.A. -

0 5 10 15 20 25 30 35
Temps (min)

Figure 4.24 : Eau MilliQ dopee avec cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2),
atrazine (3), propazine (4), prometryne (5), a la concentration de 0,1 mg/1 pour chacun des
pesticides. Volume d’injection de lpl, 10gl et 50pl. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase
mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection UV a 220 nm.

183
 100 -

Temps (min)

Temps (min)

Figure 4.25 : Eau MilliQ dopee avec cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2),
atrazine (3), propazine (4), prometryne (5), a la concentration de 0,1 mg/1 pour chacun des
pesticides. Volume d’injection de lpl. Elution isocratique a 4 gl/min. Phase mobile :
acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Chromatogramme A : Detection ESI/MS en mode balayage (m/z
180-250, 0,7 scan/s). Chromatogramme B : Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-
202,1-216,1-230,1-242,1; 1,72 cycles/s).

184
 100

«g
0
o
§"
1
c
S
3O
U

0- "T~
t 10
6s
Temps (min)

m/z 188,1
U3
O'
*E
o
§ lv^UiwUk.i^WWvi,wvJfi|fwy'N|i4w^
o
O

t
T"
10
6s
Temps (min)

m/z 216,1

i
u
w

t
6s 10
Temps (min)

Figure 4.26 : Eau MilliQ dopee avec cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2),
atrazine (3), propazine (4), prometryne (5), a la concentration de 1 pg/1 pour chacun des
pesticides. Volume d’injection de Ipl. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile :
acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-202,1-216,1-230,1-
242,1; 1,72 cycles/s).

185
 Temps (min)

m/z 216,1
=
1
c
1
o
u
T ~r
t 5 10 15
6s
Temps (min)

Temps (min)

Figure 4.27 : Eau MilliQ dopee (A) avec cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2),
atrazine (3), propazine (4), prometryne (5), a la concentration de 0,1 pg/1 pour chacun des
pesticides. Volume d’injection de 10jj.l. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile :
acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-202,1-216,1-230,1-
242,1; 1,72 cycles/s). Eau MilliQ non dopee (B).

186
 100-

Temps (min)

Temps (min)

Figure 4.28 : Eau MilliQ dopee avec cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2),
atrazine (3), propazine (4), prometryne (5), a la concentration de 0,1 gg/1 pour chacun des
pesticides. Volume d’injection de 50pl. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile :
acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-202,1-216,1-230,1-
242,1; 1,72 cycles/s).

187
 m/z

Figure 4.29 : Spectre de masse de l’aminotriazole en solution dans un melange methanol-eau

50/50 (v/v) a la concentration de 5 mg/1 pour AE = 100V. Debit liquide de 2 pl/min. Mode
d’ionisation positif.

188
 100 -

£
1
I
1
g
u

3 6

Temps (min)

m/z 85,0

03
cr
1
1
§

Alii
0
Temps (min)

Figure 4.30 : Eau MilliQ dopee avec l’aminotriazole a la concentration de 0,1 mg/1. Volume
d’injection de lpl. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 40/60 (v/v).
Detection ESI/MS en mode baiayage (m/z 80-250, 1 scan/s).

189
 Temps (min)

Figure 4.31 : Eau MilliQ dopee avec l’aminotriazole a la concentration de 10 pg/1. Volume
d’injection de ljil. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 40/60 (v/v).
Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 85,0-216,1; 4,1 cycles/s).

190
 2.b - Application a des echantillons reels

Sur la figure 4.32, nous pouvons comparer les chromatogrammes obtenus par detection
UV lors de rinjection de lpl d’eau MilliQ ou de 1 pi d’eau de robinet (filtree grace a un filtre
de porosite 0,45 pm) dopees avec cinq s-triazines (desethyl atrazine, simazine, atrazine,
propazine, prometryne), chacune a la concentration de 4 pg/1. Dans le cas de l’eau du robinet,
les interferences en debut d’analyse rendent impossible toute detection de la desethyl atrazine
et de la simazine. Cette etude met en evidence les limites de la detection UV (a longueur fixe)
dans les eaux naturelles. Par contre, par detection ESI/MS en mode SIM et en selectionnant
uniquement les m/z specifiques des pesticides recherches, il est possible de reduire
considerablement les interferences (figure 4.33). Ce raisonnement n’est valable que si les
composes "parasites" presents dans l’eau et susceptibles d’etre ionises dans la source ne
conduisent pas a la formation d’ions de rapport m/z identiques a ceux des composes
recherches.
L’aminotriazole n’absorbe pas en UV mais ce pesticide peut etre detecte dans une eau
de robinet a la concentration de 10 pg/1 par pLC/ESI/MS en mode SIM, le volume d’injection
etant de 1 pi (figure 4.34).

Ce travail experimental est complete par Vanalyse d’echantillons provenant d’eau de

riviere. L’etude consiste a rechercher un certain nombre de pesticides "prioritaires" et a donner
une estimation de la concentration des polluants identifies.
Le volume d’injection est fixe a 10 pi (plutot que 50 pi) afin de limiter la duree
d’analyse. Certaines s-triazines (desethyl atrazine, simazine, atrazine, propazine prometryne)
sont recherchees en mode SIM. L’elution est isocratique avec une phase mobile acetonitrile-
eau 50/50 (v/v), le debit etant proche de 4 pl/min. Afin de limiter le risque de bouchage de la
microcolonne, l’echantillon est filtre a l’aide d’un filtre de porosite 0,2 pm. De plus, un papier
filtre (LC Packings) est place dans 1’injecteur a 1’entree de la microcolonne.

191
 23.10“ U.A. - 41.10"* U.A. -

Temps (min)

Temps (min)

Figure 4.32 : (A) Eau MilliQ; (B) Eau du robinet dopees avec cinq s-triazines : desethyl
atrazine (1), simazine (2), atrazine (3), propazine (4), prometryne (5), a la concentration de 4
pg/1 pour chacun des pesticides. Volume d’injection de lpl. Elution isocratique a 4 pl/min.
Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection UV a 220 nm.

192
 100 -

§
g A
O ^WjiWv' jtlVS^j^VW
U

I
10

Temps (min)

Figure 4.33 : Eau du robinet dopee avec cinq s-triazines : desethyl atrazine (1), simazine (2),
atrazine (3), propazine (4), prometryne (5), a la concentration de 4 pg/1 pour chacun des
pesticides. Volume d’injection de lpl. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile :
acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-202,1-216,1-230,1-
242,1; 1,72 cycles/s).

193
 100 —

Temps (min)

Temps (min)

Figure 4.34 : Eau du robinet dopee avec l’aminotriazole a la concentration de 10 pg/1. Volume
d’injection de lpl. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 40/60 (v/v).
Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 85,0-216,1; 4,1 cycles/s).

194
 Aucune des cinq s-triazines n’est detectee dans l’echantillon d’eau de Seine analyse
(figure 4.35). Ce dernier est ensuite dope avec de l’atrazine a la concentration de 0,5 pgl. Le
pic d’elution alors observe sur le chromatogramme avec un rapport signal/bruit de 2,5 (figure
4.35) indique que les s-triazines sont presentes a des concentrations tres inferieures a 0,5 pg/1
dans l’echantillon non dope. Ce resultat pent s’expliquer par le temps ecoule entire le
prelevement et 1’analyse. Apres le prelevement et filtration a 1’aide d’un filtre de porosite 25
pm, 1’echantillon a ete stocke dans un refrigerateur. Durant les 27 jours de stockage, une
degradation partielle des pesticides est probable.

L’analyse d’un echantillon d’eau de l’Orge (Essonne) permet de mettre en evidence la

presence de deux des cinq s-triazines recherchees, la simazine et l’atrazine, a partir de la
detection de leurs ions moleculaires protones dont les rapports m/z sont respectivement egaux
a 202,1 et 216,1 (figure 4.36). Ce resultat qualitatif est confirme par l’analyse d’un second
echantillon preleve le jour suivant (figure 4.37). Ces triazines contiennent un atome de chlore,
element qui existe sous la forme d’un melange de deux isotopes : le CI35 et le Cl37 dont les
abondances relatives sont respectivement de 75,77 % et 24,23 %. Us sont a l’origine dans le
spectre de masse de motifs isotopiques caracteristiques de cet element (figure 4.5 et figure
4.6). La presence d’un atome de chlore dans la molecule se manifeste par la presence d’un
amas isotopique constitue de deux pics distants de deux unites de masse, et de hauteurs
proportionnelles a l’abondance relative des isotopes. Par la suite, pour confirmer la presence de
chlore dans les deux molecules, seuls les ions de rapport m/z 202,1 et 204,1 (pour la simazine)
216,1 et 218,1 (pour 1’atrazine) ont ete selectes par le spectrometre de masse (figure 4.38). Le
rapport signal/bruit des deux pics d’elution augmente comparativement a 1’experience
precedente. A partir des traces de la variation des intensites des ions de rapport m/z 202,1 et
204.1, on constate que les temps de retention des deux pics chromatographiques sont
identiques avec un rapport d’intensite egal a 3/1, equivalent au rapport des abondances
relatives du CI35 et CI37. Des resultats similaires sont obtenus pour les deux ions 216,1 et
218.1.
Pour donner une estimation de la concentration de l’atrazine dans cette eau, nous l’avons dope
avec de l’atrazine a une concentration de 0,8 pg/1. Le chromatogramme obtenu est presente sur
la figure 4.39. La simazine contenue dans l’eau non dopee est choisie comme etalon interne

195
afin de s’afiranchir d’eventuelles fluctuations de sensibilite au cours du temps et de variations
du volume injecte. Par la methode des ajouts doses (figure 4.40), la concentration d’atrazine
dans l’eau de l’Orge est evaluee a 0,2 gg/1. Le rapport des aires des pics chromatographiques
atrazine/simazine etant de 0,5 pour V analyse de l’eau non dopee (figure 4.38), la concentration
de simazine est voisine de 0,4 pg/1.

Sur le chromatogramme de la figure 4.41 obtenu a partir d’un echantillon d’eau de

Lescar (Pyrenees Atlantiques) apparait un pic chromatographique qui pourrait correspondre a
l’atrazine (dont le rapport m/z de l’ion pseudo-moleculaire est 216,1). De plus, la presence
d’un atome de chlore dans le produit detecte est confirmee a partir des traces de la variation
des intensites des ions de rapport m/z 216,1 et 218,1 (figure 4.42).
La concentration de l’atrazine dans cette eau est evaluee par la methode des ajouts doses, la
simazine etant choisie comme etalon interne a une concentration de 5 pg/1 (figure 4.43). Le
chromatogramme obtenu pour cette eau de riviere apres dopage en atrazine a la concentration
de 4 pg/1 est trace sur la figure 4.44. A partir de la droite d’etalonnage (figure 4.45), la
concentration d’atrazine est estimee a 2,8 ± 0,4 pg/1.

196
 Temps (min)

Temps (min)

Temps (min)

Figure 4.35 : (A) Eau de Seine brute; (B) Eau de Seine dopee en atrazine a la concentration de
0,5 pg/1. Analyse 27 jours apres prelevement. Volume d’injection de 10 pi. Elution isocratique
a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z
188,1-202,1-216,1-230,1-242,1; 1,72 cycles/s).

197
 100 -

2
o
§•
o

1
U

0
0 5 10 15
Temps (min)

Figure 4.36 : Eau de I’Orge brute. Analyse 12 h apres prelevement (Ie 24/04/96). Volume
dInjection de 10 pi. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50
Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-202,1-216,1-230,1-242,1; 1,72 cycles/s).

198
 Temps (min)

m/z 202,1

f
O

§
u
JwU Alj
10 15
Temps (min)

Figure 4.37 : Eau de l’Orge brute. Analyse 12 h apres prelevement (le 25/04/96). Volume
d’injection de 10 pi. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v).
Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1-202,1-216,1-230,1-242,1; 1,72 cycles/s).

199
 §
cC3

uO

0-h i
0 10 15
Temps (min)

m/z 202,1
m/z 204,1

Temps (min)

m/z 216,1
m/z 218,1

Temps (min)

Figure 4.38 : Eau de l’Orge brute (prelevement du 25/04/96). Volume d’injection de 10 gl.
Elution isocratique a 4 gl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS
en mode SIM (m/z 202,1-204,1-216,1-218,1; 1,82 cycles/s).

200
 Temps (min)

m/z 202,1
m/z 204,1

Temps (min)

m/z 216,1
m/z 218,1

Temps (min)

Figure 4.39 : Eau de l’Orge dopee en atrazine a la concentration de 0,8 pg/1 (prelevement du
25/04/96). Volume d’injection de 10 pi. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile :
acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 202,1-204,1-216,1-218,1;
1,82 cycles/s).

201
 -0,2 0,1
- 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
concentration d'atrazine rajoutee (p.g/1)

Figure 4.40 : Dosage de l’atrazine dans l’eau brute de l’Orge par la methode des ajouts doses,
la simazine etant choisie comme etalon interne.

202
 100 -

I
I
10 15
Temps (min)

m/z 216,1
I
1

I
10 15
Temps (min)

Figure 4.41 : Eau de Lescar brute. Analyse 36 h apres prelevement. Volume d’injection de 10
pi. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection
ESI/MS en mode SIM (m/z 188,1 -202,1 -216,1 -230,1 -242,1; 1,72 cycles/s).

203
 100-

Courant ionique total (%)

o— 1 I T
0 5 10 15
Temps (min)

m/z 216,1
m/z 218,1 I
Courant ionique

mkW>
!
T
0 5 10 15
Temps (min)

Figure 4.42 : Eau de Lescar brute. Volume d’injection de 10 gl. Elution isocratique a 4 gl/min.
Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 202,1-
204,1-216,1-218,1; 1,82 cycles/s).
 100

2?

1
I
1
1
g
u

1 1 " i----------------------------
0 5 10 15
Temps (min)

m/z 202,1 |
m/z 204,1

------------------------ I-------------------------- --------------------------------------------------

1 T-
0 5 10 15
Temps (min)

m/z 216,1 !
m/z 218,1

i r ----------------------
0 5 10 15
Temps (min)

Figure 4.43 : Eau de Lescar dopee en simazine a la concentration de 5 pg/l. Volume

d’injection de 10 pi. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v).
Detection ESI/MS en mode SIM (mlx 202,1-204,1-216,1-218,1; 1,82 cycles/s).

205
 100 -

Temps (min)

m/z 202,1
m/z 204,1

IWvdtVVMfrn-.rt. WWtiW

Temps (min)

m/z 216,1
m/z 218,1
I
C
c
c
o
U jt
"T"
10 15
Temps (min)

Figure 4.44 : Eau de Lescar dopee en simazine a la concentration de 5 pg/1 et en atrazine a la

concentration de 4 pg/1. Volume d’injection de 10 pi. Elution isocratique a 4 pl/min. Phase
mobile : acetonitrile-eau 50/50 (v/v). Detection ESI/MS en mode SIM (m/z 202,1-204,1-
216,1-218,1; 1,82 cycles/s).

206
 concentration d'atrazine rajoutee (fa.g/1)

Figure 4.45 : Dosage de l’atrazine dans l’eau brute de Lescar par la methode des ajouts doses,
l’eau etant dopee de simazine (etalon interne) a la concentration de 5 pg/l.

207
 CONCLUSION

Ce travail experimental nous a permis d’evaluer le potentiel analytique du couplage

microchromatographie liquide-spectrometrie de masse par 1’intermediate d’une interface
electrospray dans le cadre de 1’etude de pesticides dans l’eau.
Par un protocole operatoire simple et rapide a mettre en oeuvre, ne necessitant aucun
traitement particular de l’echantillon a analyser, nous pouvons detecter des s-triazines a des
concentrations de 0,1 pg/1 dans une eau peu chargee. Pour un pesticide polaire et thermolabile
comme l’aminotriazole, nous atteignons des limites de detections de quelques pg/1.
Nous presentons les analyses de trois echantillons d’eau de riviere. Pour deux d’entre
eux, nous sommes parvenus a identifier une ou deux s-triazines, la simazime et l’atrazine, et a
estimer leurs concentrations.

Toutes ces etudes experimentales ont ete realisees en mode deionisation positif en
limitant au maximum les fragmentations des ions dans la source. La difference de potentiel AE
appliquee entre l’extremite du capillaire de transfer! et le premier ecorceur est fixee a 100V
pour favoriser la formation des ions pseudo-moleculaires. Ces conditions operatoires limitent
l’identification des pesticides dans les echantillons a la recherche des ions parents. La presence
d’elements constitues de plusieurs isotopes permet d’affiner V identification.
Des etudes complementaires avec la recherche simultanee des ions parents et de
certains fragments caracteristiques des pesticides etudies pourrait s’averer utile pour confirmer
leur identification.
II serait interessant aussi de poursuivre ce travail en utilisant le mode d’ionisation
negatif afin de faciliter la detection certains pesticides "prioritaires" comme le glyphosate, le
dinoterbe et l’ioxynil a l’etat de traces dans les eaux.
Enfin, pour s’affranchir de risque de bouchage de la microcolonne, il serait utile de
rajouter a notre montage experimental une precolonne entre la vanne d’injection et la
microcolonne.

208
 Dans le cadre d’analyses plus completes de l’eau, nous proposons d’ajouter a notre
montage une ou plusieurs precolonnes branchees directement a la vanne d’injection. En
choisissant correctement sa phase stationnaire, la precolonne peut servir a concentrer un
echantillon tres dilue avant son injection dans la microcolonne de separation ou dans le cas de
melanges complexes a realiser un fractionnement de la matiere dissoute en families de
composes, chacune pouvant ensuite etre analysee separement (chapitre 3.2).

209
 CHAPITRE 5

APPLICATION AUX MOLECULES DE HAUTES MASSES

MOLECULAIRES - ETUDE DE VENINS DE SERPENTS

210
A : DEFINITION DU PROBLEMS POSE [17<M73]

Depuis les temps les plus recules, les hommes connaissent les effets des piqures et des
morsures provoquees par les insectes, les serpents, les poissons et les autres animaux
venimeux. Elies peuvent provoquer dans notre organisme des reactions pouvant aller de la
simple demangeaison cutanee jusqu’a une mort plus ou moins violente. Les premieres
publications decrivant des remedes et traitements remontent a l’Ancienne Egypte. Elies
preconisent par exemple 1’application de vinaigre sur une piqure de guepe.

La crainte vis-a-vis des serpents s’explique par Faction foudroyante pour certains
d’entre eux de leur venin sur les proies et les hommes. Ce n’est qu’au XVIF siecle qu’un
Florentin nomine Francesco Redi montre avec precision que le liquide s’ecoulant des crochets
d’un serpent provoque la mortalite consecutive a la morsure. Un siecle plus tard, en 1737,
Geoffroy et Hunault en France, observent que le sang de divers volatiles ainsi que celui des
chiens et des chats mordus par les viperes aspics (Vipera aspis) ne coagule plus. L’observation
n’est pas en accord avec celle que 1’italien Felix Fontana rapporte en 1781. Ce dernier, apres
avoir injecte le venin de vipere dans la veine jugulaire d’un lapin, s’apergoit que celui-ci meurt
rapidement et que son sang est coagule. II faudra attendre la fin du XIX* siecle pour savoir que
le phenomene de coagulation est influence par divers facteurs tel que la dose de venin injecte,
l’espece venimeuse ou encore l’espece envenimee.
Pour comprendre parfaitement 1’extreme complexity des venins, il importait d’en
extraire, a l’etat pur, les divers constituants et d’examiner leurs proprietes individuelles.

L’idee selon laquelle un venin renferme une multiplicity de composants n’est pas neuve.
En 1781, Felix Fontana signalait deja, dans un traite, que «le venin de la vipere, ainsi que tant
d’autres corps, est une substance formee de plusieurs principes que nous ne connaissons pas
encore. Par combien de voies difficiles et inconnues ne faudra-t-il pas passer pour avoir
quelques lumieres sur cette matiere si difficile et si obscure ?».
Une observation importante est rapportee a Sydney par C.-J. Martin vers la fin du XJX®
siecle. Cet auteur a separe le venin d’un Elapidae australien (Pseudechis porphyriacus) en

211
deux fractions en utilisant un filtre special, place sous une pression de 50 atmospheres. L’une
d’entre elles produit des hemorragies, I’autre provoque la mort par arret respiratoire. Deux
proprietes biologiques differentes peuvent done, sans conteste, coexister dans un meme venin.
En fait, on le sait par les nombreuses etudes qui s’ensuivirent, un venin en possede bien
d’autres.

Les venins de serpents sont probablement les Guides de secretion les plus concentres
produits par des organismes vertebres. La fraction sechee du venin varie entre 15 et 50 % du
poids brut dans la plupart des cas. Par comparaison, la fraction sechee des Guides secretes par
les mammiferes est de 0,1 a 1 % en poids dans le cas de la salive et de 0,5 a 0,8 % pour les
sues gastriques. Les principaux composants des venins sont des proteines ou peptides (plus de
90 % du poids de venin seche), et e’est a ces composes que les proprietes toxiques et
biologiques des venins sont dues. Ils sont classes en fonction de leur activite biologique.
Une propriete des venins est d’initier la digestion des proies du serpent. II n’est done
pas etonnant d’y rencontrer une multiplicity d’enzymes aux activites differentes. Ainsi, certains
venins, ceux des Crotalidae et des Viperidae par exemple, sont connus pour leur effet
necrosant et les perturbations de la coagulation du sang qu’ils engendrent. Ils contiennent en
effet des enzymes (proteines de taille importante) ou d’autres facteurs encore mal connus qui
detruisent les proteines et les constituants des membranes cellulaires.
Une autre propriete de nombreux venins est d’immobiliser rapidement les proies du
serpent. Des toxines agissent en particular au niveau des nerfs ou des muscles squelettiques,
frequemment au niveau de la jonction qui relie le nerf et le muscle, la jonction neuromusculaire.
Plus generalement, les toxines (on parle souvent de polypeptides dans le cas de proteines de
petite taille), usuellement depourvues de toute activite enzymatique, empechent un mecanisme
physiologique de fonctionner normalement en mimant et prenant la place d’une molecule
souvent vitale. Les neurotoxines s’attaquent au systeme nerveux; les cytotoxines s’en premient
aux cellules de differents tissus en perturbant les echanges entre l’interieur et l’exterieur de la
cellule, induisant une perte de 1’equilibre physiologique provoquant la mort des cellules
(necroses); les cardiotoxines detruisent les cellules musculaires du coeur, provoquant l’arret
cardiaque, etc.
De nos jours, le traitement le plus efficace en cas de morsures graves chez 1’homme
consiste a lui injecter une dose d’antivenin (appele aussi antidote). Ces antivenins sont

212
fabriques par injection de doses controlees de venin de serpent a des chevaux. Us produisent
des anticorps leur permettant de lutter centre la toxicite du venin injecte. B suffit ensuite
d’effectuer des prises de sang chez le cheval immunise et d’en extraire les anticorps qui
peuvent alors etre injectes chez une personne mordue. Pour une meilleure specificite et qualite
des antivenins, une identification rigoureuse des serpents utilises pour leur preparation est
indispensable.
Enfin, si les venins sent potentiellement dangereux, ils peuvent tout de meme rendre de
nombreux services; il suffit pour cela d’apprendre a utiliser leur puissance destructrice a des
fins constructives au profit de la medecine et de la science. Les venins de serpents sont
actuellement utilises soit comme medicaments dans le traitement des thromboses ou de
1’hemophilic par exemple, soit comme outils ou matiere premiere dans la recherche medicale
(transmission de Linflux nerveux, coagulation sanguine) ou la recherche biochimique. Ainsi,
1’analyse detaillee des venins de serpents pourrait permettre de trouver de nouvelles molecules
presentant un grand interet therapeutique.

Pres de deux mille cinq cents especes difierentes de serpents sont actuellement
repertoriees. Environ quatre cents d’entre elles sont venimeuses et reputees dangereuses pour
1’homme. On a coutume de les classer selon cinq grandes families : les Elapidae (les cobras, les
bungares, les serpents corails et les mambas, des reptiles essentiellement terrestres); les
Hydrophiidae (les serpents de mer); les Viperidae (les viperes); les Crotalidae (les crotales);

les Atractaspididae (les serpents fouisseurs). A cela, il convient de signaler les quelque quatre
cents especes differentes de Colubridae (les couleuvres) dont les venins sont, a quelques
exceptions pres, moins toxiques pour 1’homme. B semblerait que le venin de certains serpents
dits non-venimeux soit toxique, mais ne presente pas de danger pour 1’homme, car le serpent
n’arrive pas a injecter le venin lorsqu’il mord, ses crochets etant positionnes trop en arriere de
sa bouche.
Les mecanismes de defense et d’attaque des serpents venimeux peuvent etre tres divers.
Certaines especes ont developpee des comportements d’intimidation de l’agresseur ou de la
proie qui ont fait leur renommee. Ainsi, lorsqu’il se sent menace, le cobra «cracheur» africain,
Naja nigricollis, se dresse et deploie sa collerette. B peut aussi cracher son venin qui, s’il est

re?u dans les yeux, exerce une action necrosante sur la comee. Lorsqu’il est injecte dans
l’organisme, le venin de ce serpent se caracterise par deux actions toxiques dominantes : une

213
action paralysante et une action cardiotoxique. Le Laticauda colubrinae, egalement de la
famille des Elapidae et dont la toxicite du venin est proche de celle du cobra, est en revanche
tres timide et totalement depourvu d’agressivite.
Les serpents venimeux sont largement distribues a la surface du globe. On rencontre les
Elapidae en Afrique (cobras, mambas), en Asie (cobras, bungares) et en Amerique (serpents

corails). Les Hydrophiidae, dont la plupart sont complement adaptes a la vie aquatique,
vivent dans les mers tropicales et equatoriales depuis la cote est de V Afrique jusqu’a la cote
ouest de 1’Amerique. Ils abondent particulierement dans le sud-est asiatique et dans divers Hots
du Pacifique. Les Viperidae abondent en Europe, jusqu’en Asie du sud-est. On les rencontre
aussi frequemment en Afrique. Les Crotalidae vivent en Ameriques du Nord et du Sud ainsi
qu’en Asie. Les Atractaspididae, enfin, se rencontrent en Afrique et au Proche-Orient.

On estime entre 100 000 et 500 000 le nombre de deces dans le monde provoques par
des morsures de serpents venimeux, dont 75 % en Asie. Sur ce continent, outre les morsures
d’Echis et de viperes de Russell (Daboia Russelli), des milliers de personnes meurent suite aux

morsures de cobras du genre Naja. Pendant tres longtemps, une seule espece etait identifiee, le
Naja naja. En fait, les recherches ont montre qu’il existait une grande variete d’especes Naja

selon les regions: 1’espece Naja naja (en Inde et dans les pays frontaliers); P espece Naja
oxiana (entre la mer Caspienne et le nord de PInde); 1’espece Naja kaouthia (entre le nord de
l’Inde, la Malaisie et le Vietnam); Pespece Naja atra (entre Pest de la Chine et la Thailande);
P espece Naja sumatrana (entre la Peninsule de Malaisie et en Indonesie equatoriale); Pespece
Naja sputatrix (entre Java et Pile Flores); P espece Naja samarensis (dans le sud des

Philippines); et Pespece Naja philippinensis (dans le nord des Philippines). Dans certaines
regions, deux especes peuvent tout a fait coexisted
Les cobras sont responsables en grande partie de la mort par morsure de serpent. Chez
les hommes, une morsure de cobra peut engendrer divers symptomes, dont les plus importants
sont les effets neurotoxiques graves et la necrose de tissus. Et Pincidence relative de ces
symptomes varie enormement selon les differentes especes precedemment decrites. Ces
differences indiquent des differences de composition des venins. Les anticorps pouvant limiter
les symptomes sont par consequent differents. Et un antivenin, efficace pour une des especes,
Pest probablement moins pour les autres especes. De tels problemes ont ete rencontres :
L’antivenin indien, fabrique a partir de venin preleve sur un Naja naja, s'est revele peu efficace

214
en cas de morsure par un Naja philippinensis. Aussi, l’antivenin fabrique a partir de venin
preleve sur un Naja sumatrana est inefficace en cas de morsure par un Naja kaouthia. Enfin, le
venin du Naja atra est difficilement neutralise par la plupart des antivenins de cobra disponibles
sur le marche.
Une etude systematique, basee non seulement sur la morphologic de l’appareil
venimeux des serpents, mais egalement sur 1’identification des composants de leurs venins,
presenterait de nombreux avantages. Elle pourrait ameliorer 1’efficacite du traitement en cas de
morsure par un serpent venimeux en ameliorant la specificite des antivenins. D’autre part, un
meilleur dosage des anticorps pourrait diminuer les risques de reactions allergiques ou
anaphylactiques (reaction immune tres forte et rapide a 1'egard d’une substance etrangere
injectee) rencontrees chez certains patients.

Les venins de serpents etant composes en majorite des proteines, leur analyse par
spectrometrie de masse necessite l’emploi d’une technique d’ionisation adaptee aux molecules
de hautes masses moleculaires. L’ionisation en phase gazeuse etant limitee par les degradations
thermiques de composes lors de leur volatilisation, il a fallu attendre le developpement de
nouvelles techniques d’ionisation tel que la desorption par laser assistee par matrice (connue
sous le nom de MALDI) ou encore 1’ionisation par electronebulisation. II devient alors possible
de mesurer des masses moleculaires superieures a 100 kDa ([57] et chapitre LB).
Les venins renfermant une multiplicite de composants, il est preferable de proceder a
une separation par chromatographic en phase liquide avant analyse par spectrometrie de masse
afin de detecter un maximum de composants et de simplifier 1’interpretation de nos resultats.

L’objectif de ce travail est d’evaluer les performances de notre outil analytique, un

spectrometre de masse equipe d’une source electrospray et couple a une chromatographie en
phase liquide, pour 1’identification de composes de masses moleculaires elevees. Nous avons
pour cela choisi comme application l’etude de trois extraits de venin du genre Naja (famille des
Elapidae), deux standards correspondant au Naja naja et Naja kaouthia et un echantillon

preleve sur un serpent du genre Naja (le Naja bland). Par comparaison des masses
moleculaires determinees, nous voulons proposer une classification de V echantillon inconnu.

215
B : RESULTATS EXPERIMENTAL^

En raison des risques de bouchage des microcolonnes, nous avons prefere realiser nos
analyses de venins avec une colonne de petit calibre, c’est a dire de 1 mm de diametre interieur.
La colonne de 15 cm de longueur est remplie au laboratoire de phase stationnaire Nucleosil Cig
300 A, 5pm (annexe experimentale). Un capillaire en silice fondue (30 cm x 50 pm d.i.) en
sortie de colonne facilite la connexion au detecteur UV equipe d’une cellule haute pression en
Z de parcours optique 22 mm. Le spectrometre de masse equipe d’une interface electrospray
est place en serie. Les deux detecteurs sont relies par un capillaire en silice fondue (20 cm x 50
pm d.i.). Le montage experimental est illustre sur la figure 5.1.

L’interface electrospray est maintenant equipee d’une assistance pneumatique a la

nebulisation. Avant de proceder au couplage LC/UV/ESI/MS, nous aliens etudier par
introduction directe 1’influence de quelques parametres tels que le debit liquide et la
composition de la phase mobile sur l’intensite du signal, lorsque la nebulisation electrostatique
est assistee par une circulation d’azote concentrique a 1’aiguille d’introduction.

216
 Interface electrospray Quadripole
Detecteur UV
Pompe HPLC Melangeur
A 1 Colonne de petit calibre

Pompe HPLC
B
r
debit

Vanne d'injection

Figure 5.1 : Schema du montage LC/UV/ESI/MS.

217
 1 - ETUDE EN INTRODUCTION DIRECTS

Afin de comparer ces nouveaux resultats avec ceux obtenus precedemment avec la
nebulisation electrostatique pure, cette etude experimental est faite a partir d’atrazine en
solution dans des melanges acetonitrile-eau.

A la difference de la nebulisation electrostatique pure, l’intensite du pic de l’ion MET

reste a peu pres constante sur une tres large gamme de debit liquide (2-200 pl/min) puis
diminue legerement a partir de 300 pl/min lorsque la nebulisation electrostatique est assistee
par une circulation d’azote (figure 5.2). Le spectrometre de masse equipe d’une source
electro spray se definit done comme un detecteur a concentration. Ce resultat peut s’interpreter
de la fagon suivante. A 2 pl/min, les gouttelettes sont formees a l’extremite de 1’aiguille
d’introduction en raison des repulsions electrostatiques elevees entres les charges de meme
signe presentes a la surface du liquide. En augmentant le debit liquide, la nebulisation du
liquide est facilitee par l’ajout d’une circulation d’azote concentrique a 1’aiguille
d’introduction. Les gouttelettes ainsi formees sont moins chargees et plus volumineuses. La
diminution d’efficacite de production d’ions en phase gazeuse serait compensee par une
introduction plus importante de produit par unite de temps dans la source. Et le nombre total
d’ions atteignant le detecteur par unite de temps resterait a peu pres constant.
Avec 1’assistance pneumatique, l’intensite du pic de l’ion MET devient independante de
la composition de la phase mobile (figure 5.3), ce qui devrait faciliter le couplage LC/ESI/MS
lorsque les separations sont realisees par gradient d’elution. Pour une solution aqueuse
d’atrazine, l’intensite du signal est maximale pour un debit liquide de 50 pl/min (figure 5.4). Et
plus generalement, l’intensite du signal reste a peu pres constante sur la gamme de debit liquide
50-200 [il/min (figure 5.5). Cependant, en comparaison avec une solution d’atrazine dans un
melange acetonitrile-eau 60/40 (v/v), l’intensite du signal diminue plus rapidement a partir de
300 pl/min.

L’interface electro spray avec assistance pneumatique apparait done comme une
interface de choix pour le couplage LC/ESI/MS avec des colonnes de petit calibre, et plus
particulierement lorsque la separation est realisee par gradient d’elution. Pour des colonnes de
diametres superieurs a 2 mm, une division de 1’effluent en sortie de colonne est necessaire.

218
 sans assistance

avec assistance

debit liquide (nl/min)

Figure 5.2 : Influence du debit liquide sur l’intensite du pic de l’ion MET de l’atrazine
en mode balayage. L’atrazine est en solution dans un melange acetonitrile-eau 60/40 (v/v) a la
concentration de 2,5 mg/1.

219
 100 T

60 - -

30 -- ■a— 50 jil/min (avec assistance)

■ 2 jil/min (avec assistance)
20 --
X 2 fil/min (sans assistance)

% d'acetonitrile

Figure 5.3 : Influence de la composition de la phase mobile sur l’intensite du signal

MET de l’atrazine en mode balayage. L’atrazine est en solution a la concentration de 2,5 mg/1.

220
 sans assistance
avec assistance

debit liquide (pl/min)

Figure 5.4 : Influence du debit liquide sur l’intensite du pic de l’ion MFT de Fatrazine
en mode balayage. L’atrazine est en solution dans l’eau a la concentration de 2,5 mg/1.

221
 60 - •

30 --
CH3CN-H20 60/40 (v/v)

debit liquide (ftl/min)

Figure 5.5 : Influence du debit liquide sur l’intensite du pic de l’ion MFT de Fatrazine
en mode balayage. Comparaison entre deux phases mobiles : acetonitrile-eau 60/40 (v/v) et
eau. L’atrazine est en solution a la concentration de 2,5 mg/1.

222
 2 - ANALYSE DE VENINS DE SERPENTS

Ce travail consiste a mettre en evidence le maximum de composants contenus dans

chacun des extraits de venin brut, essentiellement des proteines. Avant de proceder aux
analyses, un reglage des deux lentilles de V interface El (l’extremite du capillaire de transfert) et
Si (le premier ecorceur) par introduction directe sur une molecule test est indispensable afin
d’optimiser la detection d’un maximum d’ions multicharges pour chacune des proteines.

L’influence de la variation de AE (variation de El, Si constant) sur 1’intensite relative

des ions multicharges pour une molecule de haute masse moleculaire est presentee sur la figure
5.6 pour l’angiotensine I. L’ionisation de cette molecule (M=1296,0 Da) conduit a la formation
de deux ions MH1" et MH22' respectivement a m/z 1297,0 et 649,2 dont I’intensite relative
depend fortement de la valeur du AE applique. En augmentant AE, l’abondance de l’ion
monocharge croit au detriment de l’abondance de l’ion doublement charge. Plus generalement,
il est observe un deplacement de l’enveloppe des ions multicharges vers les m/z eleves
(nombres de charge faibles) en augmentant AE [174]. Les ions multicharges sont formes par la
fixation d’un ou plusieurs IT (ou Na4). En augmentant AE, nous favorisons les collisions entre
les ions et les molecules de gaz residuelles dans la region a pression reduite, et par consequent
la perte d’un ou plusieurs H4. La determination de la masse d’une proteine sera d’autant
meilleure que le nombre d’ions multicharges sera important. Les lentilles El et Si sont reglees a
partir d’une solution d’insuline porcine (M=5777,6 Da) en optimisant la formation des ions
MH/+ et MH/4 (figure 5.7).

Enfin, le spectrometre de masse est etalonne avec un melange d’insuline porcine (m/z =
1445,4; m/z = 1156,5) et de neurotensine (m/z = 837,4).

223
 120V

649,2 (2+)
100- 165V

>
"3
e
'O
C
CO
c
1297,1 (1+)

—r—f—...........i
600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z

1297,0 (1+)
100- 270V

&
.1
ca
o
649,3(2+)
to
§

wk,uii*Ui uI,

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

m/z

Figure 5.6 : Spectres de masse de l’angiotensine I (M=1296,0 Da) en solution dans un melange
acetonitrile-eau 25/75 (v/v) + 0,1 % de TFA a la concentration de 40 mg/1 pour trois valeurs
de AE (120V, 165V, 270V). Debit liquide de 40 pl/min. Mode d’ionisation positif

224
 1156,4 (5+)
100-

(D
1
<D

1
1445,1 (4+)

0 A.
600 800 1000 1200 1400 1600 1800
m/z

Figure 5.7 : Spectre de masse de l’insuline porcine en solution dans un

melange acetonitrile-eau 25/75 (v/v) + 0,1 % de TFA a la concentration de 50 mg/1 pour AE =
140V. Debit liquide de 40 pl/min. Mode d’ionisation positif.

225
 Une solution de 2 mg/ml d’extrait de venin brut dans 0,1 % de TFA (acide
trifluoroacetique) est preparee puis filtree a l’aide d’un filtre de porosite 0,45 pm. 30 pg de
cette solution sont injectes. La separation est realisee avec un gradient dilution eau-
acetonitrile a 0,1 % de TFA. Le melange des solvants degazes est obtenu sous haute pression a
520 pl/min. En sortie d’un diviseur de debit, constant a partir de deux capillaires (200 cm x 50
pm d.i.) et (30 cm x 50 pm d.i.), le debit liquide n’est plus que de 40 pl/min. L’effluent est
analyse par absorption UV avec la longueur d’onde fixee a 214 nm (liaison peptidique NH-CO)
puis par spectrometrie de masse avec ionisation par electronebulisation et acquisition en mode
balayage (m/z 500-1800).

Nous allons demontrer la faisabilite de notre methode analytique par une application
concemant 1’etude d’un echantillon de venin brut d’un serpent inconnu du genre Naja, le Naja
blanc (preleve sur un seul serpent originaire de Thailande). Pour tenter d’identifier ce serpent

en tant que Naja naja ou Naja kaouthia, deux standards du genre Naja, nous proposons
- de comparer les chromatogrammes obtenus par detection UV et ESI/MS pour notre
echantillon avec ceux des deux standards
- de comparer les trois listes de masses de proteines (empreintes digitales) determinees
par ESI/MS
- et de comparer les masses de proteines determinees par ESI/MS avec des donnees de
la litterature afin de controler la precision de nos determinations.

La comparaison des chromatogrammes des trois extraits de venins bruts fait apparaitre
une similitude entre l’echantillon de Naja blanc et le standard Naja kaouthia, aussi bien par
detection UV (figure 5.8) que par detection ESI/MS (figure 5.9). Nous pouvons egalement
noter pour la detection ESI/MS la stabilite de la ligne de base pour toute la duree de l’analyse
alors que la composition de la phase mobile varie au cours du temps.
Par detection ESI/MS, il nous a ete possible de determiner un certain nombre de
masses moleculaires de proteines. Pour cela, nous avons calcule une moyenne de spectres de
masse acquis pendant une periode de temps ou un pic d’elution ou un epaulement est observe
sur le chromatogramme. Nous obtenons ainsi un spectre de masse avec une ou plusieurs

226
enveloppe(s) d’ions multicharges (si melange de composes). A partir d’un programme de
deconvolution de notre logiciel, il nous est facile de connaitre la masse d’une proteine (ou de
plusieurs proteines).
Trois exemples de spectre de masse obtenus pour le Naja blcmc pour les pics B3, B5 et
B12 sont donnes sur la figure 5.10. Ce sont des spectres de masse caracteristiques de
molecules de masses moleculaires importantes avec la presence de plusieurs ions multicharges
(nombre de charges compris entre 4 et 8). Par deconvolution, les masses moleculaires ont ete
determinees egales a 7822,1 Da; 7616,0 Da; et 6738,4 Da respectivement.
L’ensemble des resultats obtenus pour les trois extraits de venin sont regroupes dans le
tableau 5.1 ainsi qu’un certain nombre de masses moleculaires connues pour les deux standards
Naja naja et Naja kaouthia[175].

- Pour les deux echantillons de standards, plusieurs masses moleculaires de proteines

comprises entre 6 et 8 kDa ont pu etre determinees et attributes a des toxines connues. L’ecart
maximal entre les masses moleculaires mesurees et les masses moleculaires calculees pour les
toxines identifies est respectivement de 1,6 Da pour l’echantillon de Naja naja et de 1,3 Da
pour l’echantillon de Naja kaouthia. La precision de nos mesures nous permet aisement de
distinguer et d’identifier les deux especes de serpent du genre Naja.
- Avec une exactitude de +/- 0,8 Da, la plupart des masses moleculaires mesurees pour
l’echantillon de Naja blanc correspondent bien aux masses moleculaires mesurees pour
l’echantillon de Naja kaouthia. Nous pouvons ainsi conclure que le Naja blanc appartient a
l’espece Naja kaouthia.

A partir de cette etude, nous pouvons conclure que le couplage LC/ESI/MS est une
methode d’analyse rapide et liable pour des etudes preliminaires de melanges complexes.
Cette approche analytique devrait permettre d’identifier et de classer les serpents sur la
base de leurs empreintes digitales. Elle pourrait egalement etre utilisee lors d’un controle de
qualite des lots de venin brut destines a la production de serums antivenimeux ainsi qu’a
1’identification de nouvelles molecules dont l’activite biologique serait exploitee a des fins
therapeutiques.

227
 0.4 U.A. - Naja naja

0.4 U.A.
Naja blanc

Temps (min)

0.4 U.A. - Naja kaouthia

Temps (min)

Temps (min)

Figure 5.8 : Analyse de trois extraits de venin brut de serpent du genre Naja. Detection UV a
214 nm. Injection de 30 pg d’extrait de venin brut (2 mg/ml dans solvant A). Separation en
gradient d’elution a 40 pl/min. Solvant A : 0,1 % TFA. Solvant B : 0,1 % TFA / 90 %
acetonitrile. Progranimation : conditions initiales 20 % B, 20 % B de 0 a 5 min puis 20 % a 60
% B en 40 min (1 % B/min).

228
 i i i i r
0 10 20 30 40
Temps (min)

BIO
100 Naja blanc

B9 Bll

y B12
&
#c B8
B3
c
o ii, J
U
B1 82
\JaI
0 10 20 40
Temps (min)

Figure 5.9 : Analyse de trois extraits de venin brut de serpent du genre Naja. Detection
ESI/MS en mode balayage (m/z 500-1800, 0,42 scan/s). Injection de 30 pg d’extrait de venin
brut (2 mg/ml dans solvant A). Separation en gradient d’elution acetonitrile-eau a 40 pl/min.

229
 B3 moyenne dc 24.056 a 24.968 min: 7822,1 Da naja Diane
1118,3 (7+)
100-

1304,8 (6+)

1565,8 (5+)
976,9 (8+)

m/z

B5 moyenne de 29.788 a 30.396 min : 7616,0 Da

1270,3 (6+)
100 -
1089,0 (7+)

1524,4 (5+)

m/z

B12 moyenne de 35.911 a 36.301 min : 6738,4 Da

1348,6 (5+)

1124,3 (6+)

963,0 (7+)
1686,3 (4+)

Figure 5.10 : Trois spectres de masse extraits du chromatogramme du Naja Blanc (detection
ESI/MS, figure 5.9).

230
Pic Masse mesuree Masse calculee Toxine
Aq/'a nq/a
A1 6817,3
A2 7534,3
A3 7836,4 7837,0 Neurotoxine Longue 1
A4 7824,2 7878,5 7823,0 7879,0 Neurotoxine Longue 3 et 4
A5 6781,6 6783,2 Cytotoxine 1
A6 6736,8 6737,2 Cytotoxine 3
A7 7006,0 7006,4 Cytotoxine Homologue
AS 6754,5 6755,3 Cytotoxine 2
A9 6672,7
A10 6806,3
Aq/a blanc
B1 6849,3 6879,9 6965,7
B2 6975,9
B3 7822,1
B4 6845,2
B5 7616,0
B6
B7 6736,0 6708,9
B8 6986,5
B9 6646,9
BIO 6693,3
Bll 6764,8
B12 6738,4
Naja kaouthia

Cl 6850,5 6878,3 6965,5

C2 6976,0 6974,7 Neurotoxine Courte 1
C3 7822,0 7821,0 Neurotoxine Longue 1
C4
C5 7615,2
C6 6709,0 6709,2 Cytotoxine 3
Cl 6736,2 6709,4 6737,2 6709,2 Cytotoxine 2 et 3
C8 6985,8 6986,4 Cytotoxine Homologue
C9 6646,8 6646,2 Cytotoxine 5
CIO 6692,9 6693,2 Cytotoxine 1
Cll 6764,6
C12 6738,3 6739,3 Cytotoxine 4

Tableau 5.1 : Masses moleculaires mesurees et comparaison avec des masses moleculaires
calculees de toxines connues. On notera V analogic entre le Naja blanc et le Naja kaouthia.

231
 3 - AMELIORATIONS ENVISAGEES

Pour la separation d’un melange complexe de proteines par chromatographic liquide de

partage a polarite de phases inversee, une elution par gradient acetonitrile-eau avec 0,1 % de
TFA dans les solvants est le plus souvent choisie comme condition experimentale. Le TEA est
utilise pour ses proprietes d’agent de paire d’ions avec les composees basiques. Ainsi, les
proteines, sous forme de paires d’ions dans la phase mobile apparaissent vis a vis de la phase
stationnaire en tant que composes neutres. Elies interagissent plus avec la phase stationnaire,
ce qui se traduit par une meilleure separation des composes en sortie de colonne, une
amelioration de la symetrie des pics chromatographiques et par des temps de retention plus
longs. De plus, le TFA se presente comme un modificateur de choix car il est tres volatil et
absorbe peu a 214 nm, longueur d’onde caracteristique de la liaison peptidique, ce qui est tres
interessant pour une detection UV.
Cependant, la formation de paires d’ions est defavorable au processus de desorption
mis en jeu dans 1’ionisation par electronebulisation. L’ajout de TFA dans la phase mobile
s’accompagne done d’une baisse de sensibilite importante pour la detection de proteines par
ESI/MS.
Jusqu’a present, les difficultes experimentales rencontrees en ionisation par electronebulisation
lorsque le TFA est present dans 1’effluent (baisse de sensibilite et instability du spray) etaient
attribute seulement a sa conductivity electriques elevee. Des etudes recentes ont montre qu’il
ne fallait pas negliger la formation de paires d’ions dans l’eflfluent (figure 5.11, eq5) et des
reponses a ce probleme ont ete proposees[176] [177l

L’equilibre de formation de paires d’ions peut etre deplace par l’ajout d’un acide faible
et moins volatil que le TFA (Tvap 72,4 °C) dans 1’effluent. Le TFA s’evapore plus facilement
de la gouttelette chargee que 1’acide faible. Ainsi, pendant la reduction de volume de la
gouttelette chargee, l’equilibre acide se deplace par la loi d’action de masse vers la
deprotonation de l’acide faible (figure 5.11, eq6). Et si l’equilibre de formation de la nouvelle
paire d’ions formee entre la proteine ionisee et l’anion de l’acide faible est suffisamment
reversible, l’ion solute peut desorber plus facilement.

232
 Le mecanisme general propose pour la suppression du signal en presence de TFA et
1’augmentation de ce signal par l’ajout d’un acide faible est propose dans la figure ci-dessous.

( )
1 2 HzO ------ H 0+ + Off
3

( )
2 H20 + CF COOH
3 CF COO" + H 0+
3 3

(M+H)+^ + H20
(3) M+HgO^

(4) H20 + RCOOH RC00'+H 0+ 3

(M+H)+t + CF COO‘
3

(5) [(M+H)^CF COO']"-°"

3

CF COO" + RCOOH CFsCOOH^ + RCOO"

( )
6 3

(M+H)+^ + RCOO"
[(M+Hj^RCOO"]"" °"
(7)

Figure 5.11 : Mecanisme propose pour la suppression du signal d’un compose basique en
presence de TFA. Amelioration de la sensibilite par l’ajout d’un acide faible dans 1’effluent.
(1) : Processus initial d’ionisation par electronebulisation en mode positif, avec electrolyse et
separation des charges. (2) : Equilibre d’ionisation du TFA. (3) : Protonation des molecules de
l’echantillon et transfer! en phase gazeuse sous l’effet d’un champ electrique intense. (4) :
Equilibre d’ionisation d’un acide faible. (5) : Equilibre de formation de paire d’ions entre Fion
solute basique et V anion du TFA, empechant la desorption de l’ion solute. (6) : Evaporation du
TFA et deplacement d’equilibre d’ionisation de 1’acide faible par la loi d’action de masse. (7) :
L’equilibre de formation de la paire d’ion est suffisamment reversible pour permettre a l’ion
solute de desorber[177].

Des etudes ont ete realisees par l’ajout post-colonne de cinq acides faibles (1’acide
formique Tvap 100,7 °C, 1’acide acetique Tvap 118,5 °C, 1’acide propionique Tvap 141,1°C,
1’acide butyrique Tvap 163,5 °C et 1’acide valerique Tvap 187,0 °C). A l’exception de 1’acide
formique, la sensibilite est amelioree. Le meilleure resultat est obtenu avec 1’acide butyrique
pour lequel la temperature de vaporisation est un bon compromis entre une faible volatility (par
rapport au TFA) et une volatility suffisante afin que la gouttelette diminue suffisamment et que

233
ie champ electrique a sa surface soit suffisant pour la desorption des ions. Mais pour le confort
de l’experimentateur, il est recommande d’employer l’acide propionique plutot que l’acide
butyrique.
Les meilleures sensibilites ont ete obtenues pour l’ajout d’une solution composee de 75
% d’acide propionique et de 25 % d’isopropanol (en volume), en post-colonne pour un rapport
1:2 avec V effluent de la colonne pour des debits liquides compris entre 100 et 400pl/min
(l’isopropanol etant rajoute pour abaisser la tension superficielle en debut de gradient).
Ces conditions experimentales dependent des composes analyses et doivent etre
optimisees en fonction du debit liquide et de la phase mobile (ou de la programmation du
gradient).

234
CONCLUSION GENERALE
ET PERSPECTIVES

235
 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

L’objectif principal de notre travail experimental a consiste en la realisation d’un

couplage chromatographie liquide-spectrometrie de masse par rintermediate d’une interface
d’ionisation par electronebulisation (interface electrospray) et revaluation des performances de
cette methode pour f etude de polluants dans l’eau. Nous nous sommes plus particulierement
interesses a 1’analyse de pesticides "prioritaires", de masses inferieures a 400 Da, pour lesquels
la concentration maximale admissible dans une eau potable est de 0,1 pg/1.
Les debits liquides acceptes par l'interface etant de quelques pl/min en 1’absence
d’assistance pneumatique, les separations chromatographiques ont ete effectuees a l'aide d'une
microcolonne de 300 pm de diametre interieur. Avant de realiser le couplage, les difficultes
inherentes a la microchromatographie liquide (limitation des volumes mort, debit liquide de
quelques pl/min) ont ete resolues par detection UV avec un detecteur equipe d’une cellule en Z
specifique a la microchromatographie.
Une etude preliminaire effectuee a partir de solutions etalons par introduction directe a
permis d'optimiser les differents parametres de la source d’ionisation et de preciser les
sensibilites pour un grand nombre de pesticides.

Apres la realisation du couplage, nous avons mis au point une methode analytique
permettant 1’identification et la quantification de pesticides directement dans l’eau. Par rapport
aux methodes de routine developpees dans les laboratoires de controle (principalement la
chromatographie gazeuse couplee a la spectrometrie de masse), qui necessitent un traitement
de 1’echantillon par extraction liquide-liquide ou liquide-solide afin de concentrer les composes
et des precedes de derivation pour les pesticides thermolabiles, la methode developpee
presente un interet dans la mesure ou elle est sensible (avec des limites de detection inferieures
ou egales aux concentrations maximales admissibles dans une eau potable), rapide et possede
une bonne specificite pour un grand nombre de composes. Le critere de rapidite s’avere
particulierement interessant en cas de pollution accidentelle pour etre capable d’etablir
rapidement un premier diagnostic.
Bien que l’essentiel de notre travail repose sur Vanalyse de pesticides, nous nous
sommes interesses a l’etude de composes de hautes masses moleculaires susceptibles d’etre

236
presents egalement dans les eaux, ces demiers pouvant etre d’origine naturelle ou provenir de
rejets urbain, industriel ou agricole. Cette deuxieme etude nous a permis d’evaluer l'utilite de
notre systeme pour la detection de molecules de hautes masses moleculaires, et en particulier
des proteines.
Les venins de serpents representent une source inestimable de proteines, dont une
partie seulement sont aujourd’hui identifies. Es ont ete choisis comme application pour cette
etude.

Les principaux resultats obtenus au cours de cette etude experimentale sont resumes ci-
dessous :

- L'etude en introduction directe a montre le potentiel de ce mode d'ionisation pour

V analyse de nombreux pesticides, de famille chimique et de polarite tres differentes, avec des
limites de detection le plus souvent comprises entre 0,1 et 0,4 mg/1 en mode d’ionisation
positif, et pouvant atteindre dans certains cas 0,01 mg/1 en mode d’ionisation negatif. Les
limites de detection de pesticides polaires et thermolabiles comme l’aminotriazole sont
comparables a cedes obtenues pour des pesticides peu thermolabiles comme les s-triazines.
L’ionisation par electronebulisation est une technique d’ionisation douce, qui conduit
a la formation d’ions parents. Des informations sur la structure d’un compose sont accessibles
par fragmentations induites par collision (CID) dans la region a pression reduite. Ainsi, au sein
d’une meme famille de pesticides, nous pouvons differencier plusieurs composes non seulement
par la masse de l’ion parent et du massif isotopique, mais egalement par la mise en evidence de
certains groupes de substitution (derive isopropyl pour les s-triazines, derive methyl ou
methoxy pour les phenylurees,...).
Au debut des travaux, les debits liquides sont limites a quelques pl/min car la source
utilisee n’est pas equipee d’une assistance a la nebuhsation. Dans ce cas, l’intensite du signal
depend fortement de la composition de la phase mobile, et les conditions optimales sont
verifiees pour un melange de solvants acetonitrile (ou methanol) - eau dont les proportions en
volume varient de 50/50 a 60/40. Pour des phases mobiles contenant un pourcentage eleve
d’eau, la nebuhsation de la solution devient instable et l’intensite du signal specifique du solute
diminue fortement. Ces observations ont ete verifiees en couplage.

237
 Par la suite, la source d'ionisation a ete equipee d’une assistance pneumatique a la
nebulisation. II devient alors possible de travailler a des debits liquides variant de quelques
dizaines a quelques centaines de pl/min, et Pintensite du signal apparait beaucoup moins
dependante de la composition de la phase mobile. Dans ces nouvelles conditions, il est
envisageable de realiser des etudes de pollution accidentelle par introduction directe
d’echantillons d’eau, dans le but de rechercher certains pesticides "prioritaires". Cependant,
cette etude ne pourrait qu’etre qualitative et non quantitative en raison de la competition entre
les differents composes pour desorber. En deplagant les equilibres d’ionisation en faveur de
Pun (ou plusieurs) des composes, le nombre de chaque famille d’ions arrivant au detecteur ne
serait pas representatif du nombre de molecules de chacun des pesticides initialement presents
dans l’eau.
Enfin, ces limites de detection de ces pesticides pourrait etre abaissees en remplagant
la serie de lentilles entre le premier ecorceur et les filtres d’entree de l’analyseur par un
hexapole. En efFet, les premiers resultats obtenus chez la societe Analytica ont montre qu’il
etait possible de gagner un facteur 10 (ou plus) pour les molecules de petites masses,
inferieures a 400 Da, ce qui est le cas pour la plupart des pesticides.

- En couplage, apres concentration des pesticides en tete de colonne, nous pouvons

detecter des s-triazines a des concentrations de 0,1 pg/1 dans une eau peu chargee. Pour un
pesticide polaire et thermolabile comme l’aminotriazole, nous atteignons des limites de
detections de quelques pg/1.
Nous presentons les analyses de trois echantillons d’eau de riviere. Pour deux d’entre
eux, nous sommes parvenus a identifier une ou deux s-triazines, la simazine et l’atrazine, et a
estimer leurs concentrations dans les eaux brutes.
Ces etudes experimentales ont ete realisees en mode d’ionisation positif en limitant au
maximum les fragmentations des ions dans la source. Avec une difference de potentiel AE de
100 V appliquee entre l’extremite du capillaire de transfer! et le premier ecorceur, nous
favorisons la formation des ions MH^. Dans ces conditions operatoires, les pesticides dans les
eaux de riviere sont identifies a partir des ions parents, tout en tenant compte de la presence
d’isotope(s) dans la molecule. En complement de ce travail, une recherche simultanee des ions
parents et de certains fragments caracteristiques des pesticides pourrait s’averer utile pour leur
identification.

238
 H serait interessant aussi de poursuivre ce travail en mode d’ionisation negatif afin
d’etre capable d’analyser certains pesticides "prioritaires" comme le glyphosate, le dinoterbe et
l’ioxynil a I’etat de traces dans les eaux.
Dans le cadre d’analyses plus completes de l’eau, avec la recherche simultanee d’un
grand nombre de pesticides, il serait interessant de rajouter a notre montage
chromatographique une ou plusieurs precolonnes. La precolonne peut servir a concentrer un
echantillon tres dilue avant son injection dans la colonne analytique tout en limitant les risques
de contamination ou de pertes en composes puisqu’il n’y a ni transfert, ni evaporation, ni
fractionnement. Dans le cas de melanges tres complexes, un prefractionnement de la matiere
dissoute en families de composes, suivi de P analyse de chacune des fractions, faciliterait
1’interpretation des resultats.

- L’etude des trois echantillons de venin de serpent nous a permis de presenter un

deuxieme domaine d’application de l’ionisation par electronebulisation : la mise en evidence de
molecules de hautes masses moleculaires.
Comme les venins de serpents contiennent un tres grand nombre de composes, en
majorite des proteines, il est preferable de proceder a une separation par chromatographic en
phase liquide avant l'analyse par spectrometrie de masse afin de simplifier Pinterpretation de
nos resultats. En raison des risques de bouchage des microcolonnes, nous avons prefere
realiser nos analyses de venins avec une colonne de petit calibre (de 1 mm de diametre
interieur). La source etant equipee d’une assistance a la nebulisation (de type pneumatique), la
colonne de separation a ete directement couplee au spectrometre de masse, sans division de
P effluent chromatographique.
Nous avons analyse trois echantillons de Naja : un echantillon preleve sur un serpent
inconnu du genre Naja (le Naja blanc) et deux echantillons de standards du genre Naja (le
Naja naja et le Naja kaouthia) pour lesquels quelques proteines ont deja ete identifiees.

L’ionisation par electronebulisation des proteines conduit a la formation de plusieurs ions

multicharges. Nous avons determine un certain nombre de proteines de masses moleculaires
comprises entre 6 et 8 kDa qui ont pu etre attributes a des toxines connues. L’ecart maximal
entre les masses moleculaires mesurees et les masses moleculaires calculees pour les toxines
identifiees des deux standards est de 1,6 Da. Notre precision de mesure nous permet aisement

239
de distinguer et d’identifier ces deux especes de serpent du genre Naja et de conclure que le
Naja blcmc appartient a l’espece Naja kaouthia.

Les separations ont ete realisees avec des phases mobiles qui contiennent 0,1 % de
TFA. Or, si la formation de paires d’ions entre les proteines et f anion du TFA est favorable
pendant l’etape d’elution dans la colonne, elle est au contraire defavorable au processus de
desorption mis en jeu dans l’ionisation par electronebulisation. H devrait etre possible
d’ameliorer ces resultats, c’est a dire de caracteriser davantage de composes dans les
echantillons, en ajoutant dans 1’effluent en sortie de colonne un melange d’acide propionique et
d’isopropanol.
Dans le domaine de l’eau, nous pourrions envisager de poursuivre cette etude sur les
composes humiques, colloi'des de masses moleculaires elevees (superieures a 100 kDa). Ds sont
presents dans les eaux naturelles comme dans les eaux usees. Ce sont des composes encore mal
definis, qui peuvent solubiliser des petites molecules ou former des complexes avec certains
ions metalliques.

En conclusion, cette etude a permis de mettre en evidence l'interet du mode d'ionisation

par electronebulisation dans un couplage LC/MS pour l'etude de polluants dans l'eau, en
particulier pour l'identification et la quantification de pesticides a l'etat de traces, sans
traitement de l’echantillon. Enfin, il a ete demontre l’utilite de cet outil analytique pour la
detection de molecules de hautes masses moleculaires comme par exemple les proteines.

240
 Liste des principaux symboles utilises

A, B, C Coefficients de requation de Knox h=f(v), respectivement d’anisotropic

d’ecoulement, de diffusion longitudinale et de resistance au transfert de
masse
A(x) Absorbance
c Concentration du solute dans V effluent
Co Concentration du solute dans 1’echantillon injecte
Cmax Concentration du solute au sommet d’un pic d’elution
d Distance entre l’extremite d’un capillaire et une plaque metallique
d= Diametre interieur de la colonne chromatographique
d.e. Diametre exterieur
d.i. Diametre interieur
dp Diametre des particules de la phase stationnaire
dt Diametre interieur d’un tube de connexion
D Debit de la phase mobile
Da Unite de masse
Dm Coefficient de diffusion moleculaire du solute dans la phase mobile
Ds Coefficient de diffusion moleculaire du solute dans la phase liquide
stationnaire
Ec Champ electrique a l’extremite du capillaire
Eon Champ electrique limite de nebulisation en mode monospray
AG° Variation d’enthalpie libre totale de solvatation d’un ion dans une
gouttelette chargee
AGe Variation d’enthalpie due aux interactions de l’ion considere avec les autres
ions contenus dans la gouttelette
AG°S Variation d’enthalpie libre de solvatation d’un ion
AG* Enthalpie libre d’activation
h Hauteur de plateau reduite
H Hauteur equivalente a un plateau theorique (KEPT)
Hco, Hauteur equivalente a un plateau theorique dans la colonne
chromatographique
k’ Facteur de capacite d’un solute

241
kE Constante de vitesse du processus de desorption d’un ion
1 Chemin optique de la cellule de detection d’un detecteur absorptiometrique
L Longueur de la colonne chromatographique ou d’un tube
m/z Rapport de la masse par le nombre de charge d’un ion
N Nombre de plateaux theoriques
Ncol Nombre de plateaux theoriques contenus dans une colonne
chromatographique
Nobs Nombre de plateaux theoriques observe
N Nombre de charges elementaires a la surface d’une gouttelette
AP Perte de charge d’une colonne

Q Charge de la gouttelette
Qo Quantite de solute injectee
r Rayon interieur d’un tube
r’ Rayon exterieur d’un tube
R Rayon d’une gouttelette
Re Rayon critique de desorption d’un ion d’une gouttelette chargee
Rr Rayon critique de l’instabilite de Rayleigh
R Constante des gaz parfaits
to Temps de retention d'un compose inerte
tR Temps de retention d’un solute
Tr Temps de reponse du detecteur
u Vitesse lineaire de la phase mobile
vc Difference de potentiel appliquee entre l’extremite d’un capillaire et une
plaque metallique
Vd Volume de la cellule de detection
Vdis Potentiel d’apparition d’une decharge
Vo Volume d’echantillon injecte
Potentiel limite de nebulisation en mode monospray
Vr Potentiel de deceleration
Vr Volume de retention d’un solute
Xm Distance entre l’ion desorbe et la surface de la gouttelette definie pour l’etat
de transition
5 Largueur du pic a mi-hauteur

242
 s Porosite totale d’une colonne chromatographique
e0 Permittivite du vide
S(X) Absorptivite molaire
y Tension superficielle de la phase mobile ou d’une solution
rj Viscosite de la phase mobile
X Longueur d’onde
v Vitesse reduite de la phase mobile
0O Demi-angle du cone de Taylor
ct Ecart-type du pic chromatographique
aCoi Ecart-type du a la colonne chromatographique
CText Ecart-type du aux efFets extra-colonne
a2tot Variance totale observee
a2ext Variance due aux efFets extra-colonne
5, 3,9,

coi, cr2det, a2mj, Variances respectivement dues a la colonne chromatographique, au

tube detecteur, a l’injecteur et au volume mort des tubes de connexion
temps Variance due a la constante de temps du detecteur
Const ante de temps du detecteur

243
 ANNEXE EXPERIMENTALE

Origine des substances

- Les pesticides 1, 8-19 (Lyonnaise des Eaux, CIRSEE, Le Pecq), 2-7 (Interchim, Montlugon),
et 20-26 (Cluzeau Info-Labo, Ste Foy la Grande) ont servi de modele (tableau 1).

Nom usuel

1 desethyl atrazine 14 glyphosate

2 simazine 15 ioxynil
3 atrazine 16 pyridate CL9673
4 ametryne 17 isoproturon
5 propazine 18 chlortoluron
6 cyanazine 19 diuron
7 prometryne 20 fenuron
8 aminotriazole 21 metoxuron
9 carbendazime 22 monuron
10 methomyl 23 monolinuron
11 aldicarbe 24 buturon
12 dinoterbe 25 linuron
13 diquat dibromide 26 neburon

Tableau 1 : Pesticides utilises comme standards.

- Nous remercions Michel Guillod et Pierre-Alain Panchaud (Reptiles du Monde, Suisse) de

nous avoir donne un echantillon de Naja blanc ainsi qu'un echantillon du standard Naja naja.
Nous remercions egalement Dr Andre Menez et Dr Jean-Claude Boulain (CEN-Saclay) de
nous avoir donne un echantillon du standard Naja kaouthia.

- L'influence de la variation de AE sur l'intensite relative des ions multicharges a ete etudiee par
introduction directe avec une solution d'angiotensine I (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier).
Et avant de realiser l'analyse des venins de serpents, les lentilles du spectrometre de masse ont
ete optimisees avec une solution d'insuline porcine (Novo-Nordisk, Danemark).

244
 Nature des solvants

Les solvants utilises (acetonitrile, methanol) sont de qualite analytique (pro analysi,
Merck, Nogent-sur-Mame). L'eau provient du systeme de filtration Millipore (Bedford, MA,
USA). L'acide trifluoroacetique est pour sequengage des proteines (Merck, reference 108178).
L'acide formique est de qualite analytique (pro analysi, Merck).

Montage de la microchromatographie liquide

En elution isocratique, la phase mobile est delivree par une pompe Jasco PU980
(Prolabo, Fontenay-sous-Bois). Un degazeur (Prolabo, modele GT 103) est place entire le
reservoir de phase mobile et la pompe. Un diviseur de debit, l'Acurate AC-70 (LC Packings,
Amsterdam, Pays-Bas) ou fabrique au laboratoire, convertit un debit de 200-500 pl/min en
quelques pl/min. Les echantillons sont injectes a l’aide d’une vanne Valeo (VICI, Schenkon,
Suisse) munie d'une boucle interne (volume d'injection de 60 nl, 1 pi) ou d'une boucle exteme
(volume d'injection de 10 pi ou 50 pi). La colonne de 300 pm de diametre interieur et 15 cm
de longueur est remplie de Zorbax Rx Cg 80 A, 5pm (LC Packings, reference FUS-15-05-C8).
En gradient d'elution (avec deux pompes Jasco PU980), le melange des deux solvants
degazes A et B est realise avant la division de l'efiluent. Deux types de melangeur statique ont
ete utilises pour les experiences : l'Acurate AC-70 (qui combine a la fois un melangeur et un
diviseur de debit) et le melangeur Lee Visco (modele 174).
Un tube en silice fondue (30 cm x 50 pm d.i., LC Packings, reference FS-50) en sortie
de colonne facilite la connexion au detecteur UV ou au spectrometre de masse.
Le detecteur UV-visible a longueur d'onde variable (Kontron, St Quentin en Yvelines,
modele 432) est equipe d'une cellule en Z haute pression de parcours optique 22 mm (volume
interne inferieur a 90 nl).

L’eau du robinet est filtree a Faide d’un filtre de porosite 0,45 pm (Merck, Nogent-sur
Marne, reference CR25). Les echantillons d’eau de riviere sont filtres a l’aide d’un filtre de
porosite 0,2 pm (Merck, reference Anotop, 25MM).

245
 Montage de la chromatographie liquide avec une colonne de petit
diametre (1 mm d.i.)

Les separations de venins de serpents sont obtenues par un gradient d'elution eau-
acetonitrile avec 0,1 % d’acide trifluoroacetique. Le melange des deux solvants degazes A et B
se fait dans une chambre de melange de 1,7 ml (melangeur SUS Shimadzu modele 228-28000-
91, Touzart et Matignon, Courtaboeuf) a 520 pl/min. En sortie du diviseur de debit (fabrique
au Iaboratoire), le debit est de 40 pl/min. Les echantillons sont injectes a 1’aide d’une vanne
Valeo (VTCI, Schenkon, Suisse) munie d'une boucle exteme de 50 pi. La colonne de 1 mm de
diametre interieur et de 15 cm de longueur est remplie de Nucleosil Cig 300 A, 5pm. La
colonne est connectee a l'injecteur par l'intermediaire d'un tube en peek (4 cm x 0,12 mm d.i.,
Upchurch, Oak Harbor, WA, USA). Un tube en silice fondue (30 cm x 50 pm d.i., LC
Packings, Amsterdam, Pays-Bas, reference FS-50) en sortie de colonne facilite la connexion au
detecteur UV en serie avec le spectrometre de masse.
Le detecteur UV-visible a longueur d'onde variable (Kontron, St Quentin en Yvelines,
modele 432) est equipe d'une cellule en Z haute pression de parcours optique 22 mm.

Quelques mg de venin de serpent sont dissouts dans 1 ml de solvant A. Apres filtration

sur un filtre de porosite 0,45 pm (Merck, Nogent-sur-Mame, reference CR 25), 20 a 30 pi de
la solution sont injectes.

Remplissage de la colonne

Le schema de l'appareillage utilise pour le remplissage d'une colonne de 1 mm de

diametre interieur et 15 cm de longueur est represente sur la figure 1. D est compose d'une
reserve de solvant, d'une pompe Waters M6000A (Bedford, MA, USA), d'un reservoir de
remplissage de 4,6 mm de diametre interieur et de tubes de connexion de 1 mm de diametre
interieur (tubes et raccords de VICI, Schenkon, Suisse). La phase stationnaire choisie pour la
separation de proteines est la Nucleosil Cig 300 A, 5pm (Macherey-Nagel, Duren, Allemagne).
La bouillie est preparee a partir de 80 mg de phase Nucleosil dans 2 ml d'acetonitrile (soit une
concentration en phase stationnaire de 0,04 g/ml). Le solvant de remplissage utilise est
l'acetonitrile.

246
 Le circuit complet (y compris la colonne avec le fiitte en sortie) est rince a l'acetonitrile. Cette
operation permet egalement de deceler toute fbite eventuelle au niveau des raccords. La
colonne, bouchee en aval du fiitte, est remplie d'acetonitrile. Une fois homogeneisee par
agitation, la bouillie est introduce dans le reservoir de remplissage jusqu'au ras du raccord
superieur. Apres avoir enleve le bouchon en bas de colonne, la phase stationnaire est poussee
sous pression dans la colonne par deplacement de l'acetonitrile. A un debit de 1 ml/min, la
pression monte rapidement. Lorsque la pression attaint 3000 psi (200 bar), le debit est abaisse
a 0,8 ml/min et la pression se stabilise vers 5000-5500 psi (335-370 bar). Cette pression est
appliquee ensuite pendant 1 heure. Au bout d'une heure, le debit est diminue progressivement
jusqu'a l'arret de la pompe. II faut alors attendre la decompression totale du liquide avant
d'enlever la colonne.

reservoir de remplissage
(d.i. 4,6 mm)

tube de connexion (d.i. 1 mm)

colonne (d.i. 1 mm)

reservoir de
solvant

Figure 1: Schema du systeme de remplissage de colonne de 1 mm d.i.

247
 Test de la colonne

Chaque colonne est testee a partir d'une separation de digestion enzymatique d'insuline
porcine avec un gradient d'elution eau-acetonitrile (et 0,1 % d’acide trifluoroacetique). La
digestion enzymatique de l'insuline porcine (M=5777,6 Da) est realisee selon le protocole
operatoire suivant: 3 mg d'insuline porcine sont dissouts dans 2,94 ml d'une solution aqueuse
de NH4HCO3 a 1 % et 60 pi de protease V8 de Staph aureus (1 mg/ml dans une solution
aqueuse de NH4HCO3 a 1 %) sont ajoutes. Apres 4 heures d'incubation a 37°C, la reaction est
interrompue par l'ajout de 300 pi d'acide acetique glacial. Un aliquot du melange (63,5 pi soit
10 nmoles d'insuline porcine avant digestion) est lyophilise puis redissout dans 300 pi d'une
solution aqueuse a 0,1 % de TFA et 2 % d'acide acetique glacial. 30 pi de la solution finale est
injectee dans la colonne. Un exemple de separation est presentee sur la figure 2.

0.02 U.A.

Temps (min)

Figure 2 : Separation d'une digestion enzymatique d'insuline porcine par la protease V8

de Staph aureus (1 nmole d'insuline porcine avant digestion) avec une colonne de 1 mm
remplie de Nucleosil Cig et detection UV a 214 nm. Separation en gradient d’elution a 40
pl/min. Solvant A : 0,1 % TFA Solvant B : 0,1 % TFA / 90 % acetonitrile. Programmation :
conditions initiales 10 % B, 10 % a 40 % B en 60 min puis 40 % a 80 % B en 10 min.

248
 Le couplage LC-electrosprav-MS

Le spectrometre de masse Nermag RIO-10 a filtre quadripolaire est equipe d'une source
electrospray Analytica (Analytica, Brandford, CT, USA) distribuee en France par
Quad'Service. Un detecteur de type "Coniphot" convertit d'abord les ions en electrons, mais
ceux-ci sont convertis a leur tour en photons grace a un ecran phosphore. Transmis par un
guide de lumiere jusqu'au photomultiplicateur, le flux lumineux est amplifie et reconvert^ en
courant electronique. Scelle dans un tube a vide, le photo-multiplicateur ofire l'avantage d'etre
insensible aux variations de pression et aux pollutions. Ce detecteur est monte hors de l'axe du
quadripole afin de reduire le bruit de fond provoque par les rayonnements en source et au
niveau de I'analyseur.

Avant de realiser le couplage, les differents parametres de la source (tensions, position

du capillaire de nebulisation, debits de gaz) ont ete optimises par introduction directe avec une
solution test, a l’aide d’un pousse-seringue Harvard Apparatus (Southnatick, MA, USA,
modele 1140-001).

La source APCI

II s'agit d'une source APCI Analytica (Analytica, Brandford, CT, USA) distribuee en
France par Quad'Service (Poissy, France). Les etudes preliminaires ont ete realisees par
introduction directe avec une solution test de reserpine (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier) a
la concentration de 2,5 mg/I dans un melange methanol-eau 50/50 (v/v) avec 0,015 % d'acide
formique.

249
 ANNEXE 1

FORMULES DEVELOPPEES DES PESTICIDES

s-triazines
X

RtHN N nhr2

Nom Ri r2 X M (Da)

simazine Et Et Cl 201,1

atrazine Et iPr Cl 215,1

ametryne Et iPr sch3 227,1

propazine iPr iPr Cl 229,1

cyanazine Et -C(CN)(CH3)2 Cl 240,1

prometryne iPr iPr sch3 241,1

desethyl atrazine H iPr Cl 187,1

carbendazime
-------N

NH-COOCH,

250
methomyl

CH3 — C = NO-CO-NH-CH3

sch3

M= 162,0 Da

aldicarbe
ch3
I
ch3— C — CH = no-co-nh-ch3

sch3

M= 190,1 Da

phenylurees

Ri ■NH-CO-N(CH3)(R3)
\ /
r2

Nom Ri r2 R3 M (Da)

fenuron H H ch3 164,1

monuron Cl H ch3 198,1

isoproturon -CH(CH3)2 H ch3 206,1

chlortoluron ch3 Cl ch3 212,1

monolinuron Cl H och3 214,1

metoxuron och3 Cl ch3 228,1

diuron Cl Cl ch3 232,0

251
buturon Cl H -CH(CH3)(C=CH) 236,1

linuron Cl Cl OCH3 248,0

neburon Cl Cl C4H9 . 274,1

aminotriazole NH,

-n-N

I
M=84,0 Da

glyphosate
o
HOOC-CH2-NH-CH2— P-----OH

OH

M=169„0 Da

OH
dinoterbe

M=240,l Da

252
diquat

pyridate CL9673
HO

253
 ANNEXE 2

TOXICITE DES PESTICIDES

La Commission des Communautes europeennes a public une directive regissant la

classification et l’etiquetage des substances dangereuses : Directive de la Commission du ler
mars 1991 portant la douzieme adaptation au progres technique de la directive 67/548/CEE du
Conseil concemant le rapprochement des dispositions legislatives, reglementaires et
administratives relatives a la classification, Femballage et l’etiquetage des substances
dangereuses (91/325/CEE) (publiee au Journal officiel des Communautes europeennes du
8.7.91). "La classification vise a identifier toutes les proprietes physico-chimiques,
toxicologiques et ecotoxicologiques d’une substance et les proprietes physico-chimiques et
toxicologiques d’une preparation pouvant presenter un risque lors de sa manipulation ou de
son utilisation normale. Apres identification de chaque propriete dangereuse, la substance ou la
preparation doit etre etiquetee de maniere a indiquer le(s) risque(s) afin de proteger
l’utilisateur, le grand public et l’environnement".
Les substances et preparations sont d’abord classees dans des categories de danger. Les
risques particuliers attribues aux substances dangereuses sont ensuite definis, ainsi que les
phrases les accompagnant (phrases R). Enfin, les conseils de prudence sont precises avec les
phrases les accompagnant (phrases S).

L’attribution du terme tres toxiques, toxiques ou nocives pour les substances ou

preparations est pratiquee selon les criteres suivants :

CATEGORIC DL50 orale DL50 cutanee CL50 inhalation

rat rat ou lapin rat
(mg/kg) (mg/kg) (mg/litre/4 heures)
tres toxiques <25 <50 3 0,5

toxiques 25 - 200 50 - 400 0,5-2

nocives 200 - 2000 400 - 2000 2-20

254
La dose letale 50 : DL50, exprimee en mg par kg de poids corporel, correspond a la dose
entrainant la mart de 50% des individus apres une administration.
La concentration letale 50 : CL50, exprimee en mg/l, correspond a la concentration
entrainant la mart de 50 % des individus exposes, pour une certaine duree (exprimee en
heures).

Les substances ou preparations peuvent egalement entrainer d’autres effets qui doivent
aussi etre pris en compte tels que :
- les effets corrosifs
- les effets irritants

Voici quelques exemples d’attribution de phrases indiquant des risques et des conseils
de prudence
Phrases de risque (phrases R)
R 22 Nocif en cas d’ingestion
R 36 Irritant pour les yeux
R 38 Irritant pour la peau
R 40 Possibility d’effets irreversibles (par allusion aux risques possibles de cancer et
mutation genetiques)
R 43 Peut entrainer une sensibilisation par contact avec la peau

Combinaison de phrases R
R 20/22 Nocif par inhalation et par ingestion
R 20/21/22 Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion
R 36/37/38 Irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau
R 48/22 Nocif: risque d’effets graves pour la sante en cas d’exposition prolongee par
ingestion

Conseils de prudence (phrases S)

S2 Conserver hors de la portee des enfants
S 13 Conserver a l’ecart des aliments et boissons, y compris ceux pour animaux
S 22 Ne pas respirer les poussieres
S 26 En cas de contact avec les yeux, laver Immediatement et abondamment avec de
l’eau et consulter un specialiste

255
S 36 Porter un vetement de protection approprie
S 37 Porter des gants appropries

Combinaison de phrases S
S 24/25 Eviter le contact avec la peau et les yeux
S 36/37 Porter un vetement de protection et des gants appropries

Des donnees toxicologiques concemant certains des pesticides etudies au cours de cette
these sont presentees ci-dessous.

atrazine R 20/22
R 36
R 40
R 43
S26
S 36/37
DL50 orale = 1750 mg/kg chez le rat et la souris

carbendazime R 40
S 36/37
DL50 orale = 10000 mg/kg chez le rat

monuron R 22
R 40
S 22
S 24/25
S 36/37
DL50 orale = 3600 mg/kg chez le rat

diuron R 36/37/38
S2
S 13
DL50 orale = 3400 mg/kg chez le rat

linuron R 38
R40
S2
S 13
S 36/37
DL50 orale = 1500-4000 mg/kg chez le rat

256
 aminotriazole R40
R 48/22
S 36
S 37
DL50 orale = 5900 mg/kg chez le rat

1 glyphosate R 20/21/22
R 36/37/38
S 26
S 36
DL50 orale = 4300 mg/kg chez le rat ou la souris

257
 ANNEXE 3

LA SOURCE APCI

Description de la source APCI - Mecanisme de formation des ions a pression

atmospherique

Un schema de la source APCI developpee par Analytica est donne sur la figure 1.

L’echantillon introduit dans la source est nebulise a l’extremite du capillaire

dIntroduction sous Vaction d’un gaz nebuliseur. En plus du gaz nebuliseur, un second gaz
entraine et concentre les gouttelettes de tallies dispersees vers un tube chauflfe (ou APCI gas
heater) a une temperature comprise entre 200°C et 350°C, temperature qui depend
principalement du solute analyse. Un separateur de gouttelettes est place a I’entree du tube afin
de recueillir par collision les gouttelettes les plus volumineuses. Seules les gouttelettes de
petites tallies penetrent dans le tube chauflfe. Pendant leur traversee dans le tube, les
gouttelettes sont transformees en vapeur. L’echantillon vaporise, entraine par le gaz porteur,
quitte alors la region chauflfee et penetre dans la region de la source ou se trouve V aiguille de
decharge portee a un potentiel d’environ + 1 kV (le signe dependant du mode d’ionisation
recherche : + en mode d’ionisation positif et - en mode d’ionisation negatif). Les molecules de
solute sont ionisees, a pression atmospherique, par echange de charge avec des ions reactifs
produits a partir de molecules de solvant.
Ainsi, 1’ionisation en mode + (en mode -) d’un solute M initialement en solution par exemple
dans un melange methanol-eau resulte d’un processus en 4 etapes :
1- Nebulisation de la solution
2- Vaporisation des gouttelettes
3- Formation d’un plasma d’electrons et d’ions H30+, MeOH2+,... (d’ions OH",...) sous
1’efFet de la decharge couronne
4- Echange de charges M + MeOH2+ —> MHf + MeOH en mode +
M + OH —> (M-H)' + H20 en mode -
Ce mode d’ionisation conduit uniquement a la formation d’ions monocharges.

258
 Un gaz chauffe a 200°C a contre-courant aide a la desolvatation des ions.
Un capillaire en verre metallise a ses deux extremites assure la transmission des ions
formes a pression atmospherique vers une chambre intermediate. Les ions sont ensuite
focalises vers Ventree de l’analyseur par une serie de lentilles.

cylindre

Figure 1 : Schema de la source d’ionisation chimique a pression atmospherique (APCI)

commercialisee par Analytica.

Etudes preliminaires

Nos premieres experiences avec la source APCI ont ete realisees par introduction
directe avec une solution test de reserpine (M=608,7 Da) a la concentration de 2,5 mg/1 dans
un melange methanol-eau 50/50 (v/v) avec 0,015 % d’acide formique. Pour ce compose, il est
recommande de fixer la temperature du tube de vaporisation Ti a 350°C. La temperature du
gaz contre-courant T; est maintenue a 200°C quelque soit le compose analyse. Dans ces
conditions operatoires, notees 350°C/200°C, nous avons etudie Vinfluence du debit liquide sur
l’intensite du pic de l’ion MFC (m/z=609,7) entre 15 et 1000 pl/min. Les resultats sont
presentes sur la figure 2.

259
 debit liquids (jil/min)

Figure 2 : Influence du debit liquide sur l’intensite du pic de l’ion MET de la reserpine
en mode balayage. La reserpine est en solution dans un melange methanol-eau 50/50 (v/v) avec
0,015 % d’acide formique a la concentration de 2,5 mg/1.

A 15 (il/min, le signal est faible et tres instable. En augmentant le debit liquide, le signal
devient plus intense et plus stable. L’intensite du signal est maximale entre 200 et 1000 pl/min.
En conclusion et pour limiter la pollution de la source APCI, nous avons choisi de faire
nos etudes de sensibilite pour un certain nombre de pesticides a un debit liquide de 200 pl/min
de preference a 1000 pl/min. La temperature du gaz contre-courant sera fixee a 200 °C. Enfin,
la temperature du tube de vaporisation sera a optimiser pour chacun des composes (ou classe
de composes) etudies. Nous avons regroupe les valeurs T1/T2 dans la liste ci-dessous.

Ti/T2
atrazine 350°C/200°C
propazine 350°C/200°C
carbendazime 250°C/200°C
methomyl 225°C/200°C
aldicarbe 225°C/200°C

260
 isoproturon 250°C/200°C
chlortoluron 250°C/200°C
diuron 250°C/200°C
pyridate CL9673 250°C/200°C

En conclusion

La spectrometrie de masse avec ionisation a pression atmospherique par

electronebulisation (source electrospray) est largement utilisee en biochimie pour 1’analyse de
molecules thermolabiles de hautes masses moleculaires (M > 1,5 kDa). Au contraire, la
spectrometrie de masse avec ionisation a pression atmospherique par echange de charge
(source APCI) s’adresse plus specifiquement a des molecules thermolabiles de petites masses
(M < 1 kDa) difficilement protonables et/ou ne possedant pas de H mobile. A present, la
majorite des applications concement des etudes de medicaments et de leurs metabolites dans
des matrices complexes biologiques [4] [178"1801. De plus, 1’ionisation par electronebulisation et
V ionisation par electronebulisation assistee pneumatiquement ne sont compatibles qu’avec des
debits de 1-5 pl/min et 20-200 pl/min respectivement. Cette restriction de debit a longtemps
limite le nombre d’applications concemant Vanalyse de pesticides, en particulier les pesticides
polaires, dans l’eau par LC/MS avec interface a pression atmospherique, les separations etant
le plus souvent realisees avec des colonnes conventionnelles a des debits voisins de 1 ml/min.
Le developpement recent des interfaces APCI facilite le couplage LC/MS, les debits optimums
etant de 200-1000 pl/min. Dans ces conditions, une division de 1’effluent en sortie d’une
colonne conventionnelle n’est plus necessaire. Par consequent, le couplage LC/MS avec une
source APCI apparait comme une methode de choix pour 1’analyse en routine de pesticides, et
en particulier pour les pesticides polaires[531[54]I152J.
Nous avons evalue les performances de cette technique d’ionisation pour notre groupe
de pesticides (tableau 3.2) et compare les sensibilites avec celles obtenues a partir de
l’ionisation par electronebulisation. Les resultats et la discussion sont presentes dans le chapitre
4.A.

261
 ANNEXE 4

Formules chromatographiques utilisees

* Facteur de capacite d’un solute (k’) :

k' = tR : temps de retention du solute

to : temps de retention d’un compose inerte

* Nombre de plateaux theoriques (N):

N = 5,54 5 : largeur du pic a mi-hauteur

* Coefficient de diffusion moleculaire du solute dans la phase mobile (Dm) :

6,9.W15TjjMs
D = T : temperature en Kelvin
TjV°'6
\|/: facteur dissociation du solvant
Ms : masse molaire du solvant (g)
r|: viscosite du solvant (Pa s)
V : volume molaire du solute (cm3/mol)
\]/ est egal a 1 pour des solvants non donneur de liaison hydrogene; 1,5 pour V ethanol; 1,9 pour
le methanol et 2,6 pour l’eau.
En premiere approximation, dans le cas d’un melange de solvants A et B
(vj/Ms)a+b = xa(v|/Ms)a + xb(xj/Ms)b, xa et xb designant les fractions volumiques de A et B dans
le melange.

7] = (tJaYa (*7b)Yb > Ya et yB designant les fractions molaires de A et B dans le melange,

masse molaire
V
masse volumique

262
 ANNEXE 5

Parametres d’acquisition de la figure 4.22

Chromatogramme A:
Recherche des ions MET et MNa+

m/z 165,1-187,1-199,1-207,1-213,1-215,1-221,1-229,1-233,0-235,1-237,1-249,0-
251,1-255,0-259,1-271,0-275,1-297,1
1,03 cycles/s

Chromatogramme B :
00.00 min m/z 165,1-187,1-199,1-201,1-221,1-223,1-229,1-231,1-251,1-253,1
1,54 cycles/s
23.00 min m/z 213,1-215,1-217,1-235,1-237,1-239,1-199,1-201,1-221,1-223,1
1,54 cycles/s
26.30 min m/z 207,1-229,1-233,0-235,0-237,0-239,1-255,0-257,0-259,0-261,1
1,54 cycles/s
28.50 min m/z 249,1-251,1-253,1-271,0-273,0-275,0-277,1-279,1-297,1-299,1-301,1
1,41 cycles/s

Parametres d’acquisition de la figure 4.23

m/z 249,1-251,1-253,1-271,0-273,0-275,1-277,1-279,1-297,1-299,1-301,1
1,41 cycles/s

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J. Chromatogr. 1987, 405, 117-124
Stepwise gradient elution using switching valves in micro high-performance liquid
chromatography

98 J. F. Banks, M. V. Novotny
J.Microcol. Sep. 1990, 2, 84-87
A step gradient system for microcolumn liquid chromatography based on a multiple-loop valve

99 T. Takeuchi, D. Ishii
J. Chromatogr. 1982, 253, 41-47
Continuous gradient elution in micro high-performance liquid chromatography

100 K. E. Karlsson, M. Novotny

HRC&CC 1984, 7,411-413
A miniature gradient elution system for liquid chromatography with packed capillary columns

275
101 Y. Hirata, F. Nakata
J. Chromatogr. 1984, 294, 357-360
Gradient elution system for high-performance liquid chromatography with narrow-bore packed
columns

102 K. Slais, R. W. Frei

Anal. Chem. 1987, 59, 376-379
Open-tubular mixer for gradient preparation in microbore high-performance liquid
chromatography

103 R. P. Scott, P. Kucera

J. Chromatogr. 1979, 185, 27-41
Use of microbore columns for the separation of substances of biological origin

104 H. E. Schwartz, B. L. Karger, P. Kucera

Anal. Chem. 1983, 55, 1752-1760
Gradient elution chromatography with microbore columns

105 F. Andreolini, A. Trisciani

J. Chromatogr. Science 1990, 28, 54-60
Gradient elution system for packed capillary column liquid chromatography

106 A. Berloni, A. Capiello, G. Famiglini, P. Palma

Chromatographia 1994, 39, 279-284
Generation of split-flow micro-gradients for capillary HPLC

107 J. P. Chervet, M. Ursem, J. P. Salzmann, R. W. Vannoort

HRC 1989, 12, 278-281
Ultra-sensitive UV detection in micro separation

108 y Takeuchi, T. Miwa

Anal. Chim. Acta 1994, 292, 275-279
Effect of cyclodextrin as mobile phase additive on fluorescence intensity of dansylamino acids
in microcolumn liquid chromatography

109 T. Takeuchi, T. Miwa

Chromatographia 1994, 38, 555-558
Signal enhancement by on-column fluorimetric detection in microcolumn liquid
chromatography with cyclodextrin-bonded stationnary phases

276
110 R. Boussenadji, P. Dufek, M. Porthault
LC-GC 1993, 11, 451-454
Determination of phenylurea herbicides in water using microcolumn HPLC with UV and
electrochemical detection

111 V. F. Ruban
J. Chromaiogr. 1993, 619, 111-115
Determination of dopamine and its metabolites in microdialysates by capillary LC with
electrochemical detection

112 A. Hirose, Y. Iwasaki, I. Iwata, K. Ueda, D. Ishii

HRC&CC 1981, 4, 530-531
Post-column colorimetric detection with xylenol orange in microHPLC of rare earth metals

113 J. A. Apffel, U. A. Brinkman, R. W. Frei

Chromatographia 1983, 17, 125-131
Use of non segmented flow, post-columns reaction detection with miniaturized HPLC systems

114 P. Kucera, H. Umagat

J. Chromatogr. 1983, 255, 563-579
Design of a post-column fluorescence derivatization system for use with microbore columns

115 J. P. Gagne, A. Carrier, L. Varfalvy

J. Chromatogr. 1993, 647, 13-20
Evaluation of the performance of capillary liquid chromatography-FAB-MS systems with
precolumn addition of glycerol as a viscous matrix

116 A. Capiello, F. Bruner

Anal. Chem. 1993, 65, 1281-1287
Micro flow rate particle beam interface for capillary LC/MS

117 A. Capiello, G. Famiglini, F. Bruner

Anal. Chem. 1994, 66, 1416-1423
Determination of acidic and basic/neutral pesticides in water with a new microliter flow rate
LC/MS particle beam interface

118 M. Stastna, M. Krejci, V. Kahle

J.Microcol. Sep. 1994, 6, 435-442
Simple detector for microcolumn LC using electrospray ionization

277
119 T. Heath, A. B. Giordani
J. Chromatogr. 1993, 638, 9-19
Reversed-phase capillary high-performance liquid chromatography with on-line UV,
fluorescence and electrospray ionization mass spectrometric detection in the analysis of
peptides and proteins

120 J. P. Chervet, M. Ursem, J. P. Salzmann, R. W. Vannoort

LC-GC 1989, 7, 514-518
Performance comparison of flow cells for UV detection in capillary liquid chromatography

121 S. Murray, N. B. Rendell, G. W. Taylor

J. Chromatogr.A 1996, 738, 191-199
Microbore high performance liquid chromatography electrospray ionisation mass spectrometry
of steroid sulphates

122 Y. Hua, W. Lu, M. S.Henry, R. H. Pierce, R. B. Cole

Anal. Chem. 1995, 67, 1815-1823
On-line high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry
for the determination of brevetoxins in "red tide" algae

123 I. A. Fleet, J. J. Monaghan, D. B. Gordon, G. A. Lord

Analyst 1996, 121, 55-59
Microbore liquid chromatography-electrospray mass spectrometry of selected synthetic
pyrethroid insecticides

124 R. F. Straub, R. D. Voyksner

J. Chromatogr. 1993, 647, 167-181
Determination of penicillin G, ampicillin, amoxicillin, cloxacillin and cephapirin by high-
performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry

125 R. A. Newman, A. Fuentes, T. Y. Minor, K. T. Me Manus, D. A. Garteiz

J. Liquid Chromatogr. 1994, 17, 403-417
Determination of echinomycin (NSC-526417) in human plasma : comparison of conventional
HPLC to a capillary HPLC, electrospray ionization and mass spectrometry system

126 K. E. Karlsson
J. Chromatogr. 1993, 647, 31-38
Deuterium oxide as a reagent for the modification of mass spectra in electrospray microcolumn
liquid chromatography-mass spectrometry

278
 J. Hermansson, I. Hermansson, J. Nordin
J. Chromatogr. 1993, 631, 79-90
Characterization of a Chiral-AGP capillary column coupled to a micro sample-enrichment
system with UV and electrospray mass spectrometric detection

128 K. Mock, M. Hail, I. Mylchreest, J. Zhou, K. Johnson, I. Jardine

J. Chromatogr. 1993, 646, 169-174
Rapid high-sensitivity peptide mapping by liquid chromatography-mass spectrometry

129 M. G. Qian, D. M. Lubman

Anal. Chem. 1995, 67, 2870-2877
Analysis of tryptic digests using microbore HPLC with an ion trap storage/reflection time-of-
flight detector

130 E. C. Huang, J. D. Henion

Anal. Chem. 1991, 63, 732-739
Packed-capillary liquid chromatography/ion-spray tandem mass spectrometry determination of
biomolecules

131 S. J. Lane, K. A. Brinded, N. L. Taylor, P. J. F. Watkins, M. E. Harrison

Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 953-956
Analysis of the Squalestatins by on-line packed capillary liquid chromatography combined with
electrospray mass spectrometry

132 P. R. Griffin, J. A. Coffinan, L. E. Hood, J. R. Yates m

Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1991, 111, 131-149
Structural analysis of proteins by capillary HPLC electrospray tandem mass spectrometry

133 M. Hail, S. Lewis, I. Jardine, J. Liu, M. Novotny

J. Microcol. Sep. 1990, 2, 285-292
Detection and sequence analysis of tryptic peptides by microcolumn liquid chromatography-
tandem mass spectrometry using an electrospray interface

134 J. Liu, K. J. Volk, E. H. Kerns, S. E. Klohr, M. S. Lee, I. E. Rosenberg

J. Chromatogr. 1993, 632, 45-56
Structural characterization of glycoprotein digests by microcolumn liquid chromatography-
ionspray tandem mass spectrometry

135 H. Nakayama, K. Uchida, F. Shinkai, T. Shinoda, T. Okuyama, K. Seta, T. Isobe

J. ChromatogrA 1996, 730, 279-287
Capillary column high-performance liquid chromatographic-electrospray ionization triple-stage
quadrupole mass spectrometric analysis of proteins separated by two-dimensional
polyacrylamide gel electrophoresis. Application to cerebellar protein mapping

279
136 M. T. Davis, D. C. Stahl, S. A. Hefta, T. D. Lee
Anal. Chem. 1995, 67, 4549-4556
A microscale electrospray interface for on-line, capillary liquid chromatography/tandem mass
spectrometry of complex peptide mixtures

137 J. R. Perkins, C. E. Parker, K. B. Tomer

J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1992, 3, 139-149
Nanoscale separations combined with electrospray ionization mass spectrometry : sulfonamide
determination

138 C. E. Parker, J. R. Perkins, K. B. Tomer, Y. Shida, K. O’Hara

J. Chromatogr. 1993, 616, 45-57
Nanoscale packed capillary liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry :
analysis of penicillins and cephems

139 P. E. Andren, R. M. Caprioli

J. Mass Spectrom. 1995, 30, 817-824
In vivo metabolism of substance P in rat striatum utilizing microdialysis/liquid
chromatography/micro-electrospray mass spectrometry

140 A. L. Burlingame, S. C. Hall, D. A. Maltby, J. P. Salzmann, C. J. Hughes, T. Hutton Me

Kenna, S. A. Jarvis, A. E. Ashcroft, E. Kapp
Micromass, Application note 223
Protein digest analysis using a nanobore HPLC-nanoflow electrospray interface

141 W. E. Pereira, C, E. Rostad, T. J. Leiker

Anal. Chim. Acta 1990, 228, 69-75
Determination of trace levels of herbicides and their degradation products in surface and
ground waters by gas chromatography/ion-trap mass spectrometry

142 G. Durand, D. Barcelo

Anal. Chim. Acta 1991, 243, 259-271
Confirmation of chlorotriazine pesticides, their degradation products and organophosphorus
pesticides in soil samples using gas chromatography-mass spectrometry with electron impact
and positive- and negative-ion chemical ionization

143 Methods for the determination of organic compounds in drinking waters. US

Environmental Protection Agency. PB 91-231480 (December 1988, revised in July 1991)-
Methode EPA 525.1. Determination of organic compounds in drinking water by liquid-solid
extraction and capillary column gas chromatography/mass spectrometry

280
144 Methods for the determination of organic compounds in drinking waters. US
Environmental Protection Agency. PB 91-231480 (December 1988, revised in July 1991)-
Methode EPA 505. Analysis of organohalide pesticides and commercial polychlorinated
biphenyl products in water by micro-extraction and gas chromatography

145 Methods for the determination of organic compounds in drinking waters. US

Environmental Protection Agency. PB 91-231480 (December 1988, revised in July 1991)-
Methode EPA 507. Determination of nitrogen - and phosphorus - containing pesticides in
water by gas chromatography with a Nitrogen-Phosphorus detector

146 G. Durand, D. Barcelo

J. Chromatogr. 1990, 502, 275-286
Determination of chlorotriazines and their photolysis products by liquid chromatography with
photodiode-array and thermospray mass spectrometric detection

147 T. R. Steinheimer
J. Agric. FoodChem. 1993, 41, 588-595
HPLC determination of atrazine and principal degradates in agricultural soils and associated
surface and ground water

148 M. Berg, S. R. Muller, R. P. Schwarzenbach

Anal. Chem. 1995, 67, 1860-1865
Simultaneous determination of triazines including atrazine and their major metabolites
hydroxyatrazine, desethylatrazine, and deisopropylatrazine in natural waters

149 S. Nelieu, M. Stobiecki, F. Sadoun, H. Virelizier, L. Kerhoas, J. Einhom

Analusis 1994, 22, 70-75
Solid phase extraction and LC-MS or SFC-MS for the analysis of atrazine metabolites in water

150 H. Bagheri, E. R. Brouwer, R. T. Ghijsen, U. A. Th. Brinkman

J. Chromatogr. 1993, 647, 121-129
On-line low-level screening of polar pesticides in drinking and surface waters by liquid
chromatography-thermospray mass spectrometry

151 D. Volmer, K. Levsen, G. Wiinsch

J. Chromatogr. A 1994, 660, 231-248
Thermospray liquid chromatographic-mass spectrometric multi-residue determination of 128
polar pesticides in aqueous environmental samples

152 D. R. Doerge, S. Bajic

Rapid Commun. Mass Spectrom. 1992, 6, 663-666
Analysis of pesticides using liquid chromatography/atmospheric-pressure chemical ionization
mass spectrometry

281
153 C. H. Marvin, I. D. Brindle, C. D. Hall, M. Chiba
J. Chromatogr. 1990, 503, 167-176
Development of an automated high-performance liquid chromatographic method for the on­
line pre-concentration and determination of trace concentrations of pesticides in drinking water

154 C. E. Goewie, P. Kwakman, R. W. Frei, U. A Th. Brinkman, W. Maasfeld, T. Seshadri, A.

Kettrup
J. Chromatogr. 1984, 284, 73-86
Pre-column technology in high-performance liquid chromatography for the determination of
phenylurea herbicides in water in the presence of their anilines

155 H. Bagheri, J. Slobodnik, R. M. Marce Recasens, R. T. Ghijsen, U. A. Th. Brinkman

Chromatographia 1993, 37, 159-167
Liquid chromatography-particle beam mass spectrometry for identification of unknown
pollutants in water

156 Methods for the determination of organic compounds in drinking waters. US

Environmental Protection Agency. Supplement I. PB 91-146027 (July 1990)-Methode EPA
547. Determination of glyphosate in drinking water by direct-aqueous-injection HPLC, post
column derivatization andfluorescence detection

157 M. A. Alawi
Chromatographia 1986, 22, 40-42
Determination of pyridate and its main metabolite CL-9673 in plant materials

158 Methods for the determination of organic compounds in drinking waters. US

Environmental Protection Agency. Supplement I. PB 91-146027 (July 1990)-Methode EPA
549. Detemination of diquat and paraquat in drinking water by liquid-solid extraction and
HPLC with ultraviolet detection

159 P. Subra, M. C. Hennion, R. Rosset

Analusis 1989, 17, 163-184
Analyse de la matiere organique contenue dans des eaux de distribution par les methodes
chromatographiques

160 M. C. Hennion
Trends Anal. Chem. 1991, 10, 317-323
Sample handling strategies for the analysis of non-volatile organic compounds from
environmental water samples

282
1611. Hayati, A I. Bailey, Th. F. Tadros
J. Colloid Interface Sci. 1987, 117, 205-221
Investigations into the mechanisms of electrohydrodynamic spraying of liquids. I. Effects of
electric field and the environment on pendant drops and factors affecting the formation of
stable jets and atomization

162 S. G. Lias, J. E. Bartmess, J. F. Liebman, J. L. Holmes, R. D. Levin, W. G. Mallard

Gas-Phase Ion and Neutral Thermochemistry
J. Phys. Chem. Reference Data 1988,17,n°l
published by the American Chemical Society and the American of Physics for the National
Bureau of Standards

163 S. Zhou, M. Hamburger

Rapid Commun. Mass Spectrom. 1995, 9, 1516-1521
Effects of solvent composition on molecular ion response in electrospray mass spectrometry :
Investigation of the ionization processes

164 R. D. Voyksner, T. Pack

Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991, 5, 263-268
Investigation of collisional-activation decomposition process and spectra in the transport
region of an electrospray single-quadrupole mass spectrometer

165 P. C. Goodley, D. Garteiz, K. T. Me Manus

MS Application Note, Hewlett-Packard
HPLC-electrospray-CID-MS : A high sensitivity alternative to MS/MS

166 R. Kostiainen, A. P. Bruins

Rapid Commun. Mass Spectrom. 1994, 8, 549-558
Effect of multiple sprayers on dynamic range and flow rate limitations in electrospray and
ionspray mass spectrometry

167 L. Tang, P. Kebarle

Anal. Chem. 1991, 63, 2709-2715
Effect of the conductivity of the electrospray solution on the electrospray current. Factors
determining analyte sensitivity in electrospray mass spectrometry

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J. Chim. Phys. 1993, 90, 1345-1366
Source d’ions a vaporisation electrostatique. Approche de modelisation simplifiee

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Communication personnelle

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Les venins de serpents

171 A. Menez
Pour la Science 1993, n°190, 34-40
Les structures des toxines des animaux venimeux

172 R. Stocklin
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Experientia 1991, 47, 205-209
Asiatic cobras : Systematics and snakebite

174 J. A. Loo, H. R. Udseth, R. D. Smith

Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 207-210
Collisional effects on the charge distribution of ions from large molecules, formed by
electrospray-ionization mass spectrometry

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Proceedings of the 42nd ASMS Conference on the Mass Spectrometry and Allied Topics,
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Signal enhancement for gradient reverse-phase high-performance liquid chromatography-
electrospray ionization mass spectrometry analysis with trifluoroacetic and other strong acid
modifiers by post column addition of propionic acid and isopropanol

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J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1991, 2, 164-167
Quantitative analysis by high-performance liquid chromatography atmospheric pressure
chemical ionization mass spectrometry : The determination of the renin inhibitor CP-80,794 in
human serum

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Determination of L-365,260, a new cholecystokinin receptor (CCK-B) antagonist, in plasma
by liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry

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