Université des Sciences et de la Technologie Houari

Boumediene (USTHB)
Faculté des Sciences Biologiques (FSB)
Département de Biologie Cellulaire et Moléculaire (BCM)

Compte rendu

des Travaux pratiques :

Les techniques de Biologie Moléculaire

Travaux pratique du module Biologie Moléculaire

Licence L3 biochimie

- Réalisé par :

IZARIREN Ania Myriam

Année universitaire : 2022/2023

TP 1 Extraction d’ADN par la technique de SALTING OUT :
L’objectif du TP : de faire une extraction de l’ADN génomique à partir d’un
échantillon sanguin pour réaliser différent manipulation avec (clonage, PCR,
séquençage ……..)
Principe :
C’est une technique de relargage salin (salting out) qui utilise des solutions
salines à fortes concentrations.
En effet, les sels minéraux à forte concentrations nécessitent d’être entourés par
l’eau d’hydratation ceci se produit au détriment des protéines qui se trouvent
privées d’eau, il se produit alors une surconcentration qui favorise leur
agrégation et leur insolubilisation. Après centrifugation, les protéines sont
précipitées sélectivement au fond du tube et l’ADN sera libre dans la phase
supérieure.

Matériel utilisé :

Consommable /Verrerie : Matériel : Produits/Solution :

- Echantillon sanguin (5ml) - Centrifugeuse - SLR
- Tube 15ml à fond conique - Bain Marie - SLB
- Bécher - Agitateur Vortex - EDTA 0.5M
- Pipette pasteur - Balance - Tris 1M
- Micropipette (10-100l)/ - pH mètre - SDS 10%
(100-1000l) - Protéine K
- Feuille d’aluminium - Na Cl 6M
- Spatule - Ethanol 70%
- Eprouvette graduée (1000ml) - Ethanol 100%
- Microtube - TE
- Portoire - Eau distillée
Préparation des solutions :
SLR : (Solution de lyse des globules rouges)
Dans une éprouvette graduée (1000ml),
On ajoute :

10ml de TRIS 1M 20ml EDTA 0.5M On complète avec 970ml Solution de Lyse des
d’eau distillé globules rouges
SLB : (Solution de lyse des globules blancs)
Dans une éprouvette graduée (1000ml),
On ajoute :

10ml de TRIS 1M 10ml de EDTA 0.5m On complète avec 980ml Solution de Lyse des
1M d’eau distillé globules blanches

Preparation de solution de NaCl 6M :

Sodium Chloride On pèse 1g de Sodium Chloride On dilue dans 1L jusqu’à obtention de

solution NaCl 6M
La lyse des GR (globules rouges) :
- Prélever 5ml de sang sur anticoagulant(EDTA) dans un tube de 15ml à fond
conique.
- Completer le volume avec 10ml de SLR et mélanger

- Incuber à -20°C pendant 20min

- Centrifuger à 3500tours/min pendant 10 minutes à + 4 ° C

- Eliminer le surnageant qui contient les GR lysées et laisser le culot.

- Répéter les lavages (les deux étapes précédentes) (3 lavages faits) jusqu'à
obtention d'un culot clair sans globules rouges.
Lyse des GB:
- Resuspendre le culot dans 3ml de solution de lyse des globules blancs (SLB) et
vortexer

- On ajoute :

50 l SDS à 10% 50 l de PK (1mg/ml)

- Incubation toute une nuit à 37°C dans un bain marie sous agitateur ou à 65°C
pendant 3H. (Pour un résultat plus rapide on la incubé pendant 1heure)

Extraction par SALTING OUT :

- Ajouter :

Centrifuger 5
- Vérifier la présence de protéines au fond du tube et transférer leminutes
surnageant
à
dans un nouveau tube. 2000tour/min à
Précipitation de l'ADN + 4°C.
- Ajouter :

Agiter
3ml de NaCl doucement, la
2 volumes
d’Ethanol absolu méduse
100% glacé commence à
(-20°C) apparaitre
(-20°C)

- Eliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un

tube eppendorf avec 1,5 ml d’alcool éthylique à 70 %. (Pour la réhydratation)

1,5ml d’Ethanol 70%

 Récupérer la méduse avec
pipette pasteur

Laver la méduse plusieurs

fois avec l'éthanol 70%

L’ADN est conservée dans 250l de

tampon TE 10/1
TP 2 contrôles de qualité et de quantité d’ADN :
Objectif du TP :
- Contrôle quantitative : C’est de mesurer la quantité des AN (la concentration)
- Contrôle qualitative : C’est de déterminer le dégréer de pureté des AN
Principe du TP :
- Contrôle quantitatif : Elle repose sur la spectrophotométrie (absorbance par
les faisceaux lumineux)
- Contrôle qualitatif : Elle repose sur l’électrophorèse (migration sur gel /
migration se fait selon le poids moléculaire)

Consommable /Verrerie : Materiel : Produits/Solution :

- Tube 15ml à fond conique - Spectrophotometre - Agarose
- Bécher - Cuve électrophorèse - TEA
- Microtube horizontale - TBE
- Micropipette (10-100l)/ - Cuves - Eau distillée
(100-1000l) - Balance - Bleu de
- Portoire - Moule de dalle bromophenole
- Erlenmeyers d’agarose - Glycérol
- Eprouvette graduée - Balance - Eau distillé
- Tubes Eppendorf - UV tray
- Feuilles d’aluminium - Micro-onde
- Spatule - Peigne

Préparation des solutions :

TBE :
- Pour préparer 250ml de TBE x1 à partir de TBE x10 :
- On ajoute :

25ml de TBE x10 225ml d’eau distillé Pour obtenir 250ml de

TBE x1
Les étapes de contrôle qualitatif et quantitatif des acides nucléiques :
1- Spectrophotométrie : contrôle quantitative.
 Dans un tube Eppendorf 1,5 ml mélanger 5μl de solution d'ADN avec 195μl
d'eau distillée.
• Mélanger en faisant plusieurs vai et vient à la pipette.

Tube Eppendorf 1,5 ml 5l de solution d’ADN Ajouter 195l d’eau

distillée

 Au spectrophotomètre régler l'appareil à 260 nm

• Déterminer le blanc en déposant 200μl d'eau dans une cuve de

spectrophotométrie.

Cuves Rincer la cuve avec de l'eau,

la sécher en tapotant sur du papier
 Ajouter la solution d'ADN Calculer la DO de votre
échantillon.

 Refaire la même procédure à 280 nm

L’absorbance des bases azotées se fait à Do (260nm)

L’absorbance des protéines se fait à Do (280nm)
Rapport = R → DO(260nm)/DO(280nm)
Quantité d’ADN :
ADN : est pur quand le R varie entre 1.8--2
R<1.7 : Signifie qu’il y a une contamination par les protéines
R>2 : Signifie qu’il y a une contamination par l’ARN
 2- Electrophorèse : contrôle qualitatif.
 Préparation de gel d'agarose à 0,5% :
• Peser 0.25 d'agarose dans un erlenmeyer

• On ajoute 0,25g d'agarose dans 50ml de TBE (1M)

50ml de TBE 1M 0.25g d’agarose

On le met 1min30s dans On rajoute une goutte

le micro-onde de BET sous la hotte
Préparation de notre moule Verser le mélange dans la cuve

 Créer des puits avec une peigne et laisser 20min jusqu’à la polymérisation.

• Enlever la peigne délicatement et mettre le support dans la cuve.

 Préparation des échantillons d'ADN :

5ul de la solution 3ul de Tampon de Dilution avec 2l

mère de l’ADN charge d’eau distillée
dans l’eppendorf (Glycérol + Bleu de
bromophenole)
 • Placer les échantillons d'ADN pendant 3min a 60-65°C
• Transférer les échantillons sur la glace pendant 2-3min

Mélanger le colorant de charge et l'ADN Remplir les puits en faisant attention

sur un morceau parafilm et prélever le de ne pas déchirer le fond du gel
mélange avec une micropipette

Placer le support avec le gel chargé Remplir la cuve de tampon TBE

dans la cuve d'électrophorèse

Fermer la cuve, brancher les fils et

mettre sous tension
er jusqu’à ce que le Couper l’alimentation, débrancher
charge arrive à proximité les connections et récupérer le gel
gel dans son support.

Visualisez les bandes d’ADN sous

une source de lumière UV.
Les marqueurs du PM déterminent la taille
On a 3 cas d’obtention d’ADN :
Cas 01 : ADN intacte : Apparition d’une bande bien visible
Cas02 : ADN dégradé : Apparition d’une trainée
Cas03 : ADN contaminé :
1- Protéines : Apparition d’une trainée sous la bande
2- ARN : Apparition d’une trainée en dessous la bande
TP 3 : PCR (Polymerase Chain Reaction)
Le principe :
C’est est une technique d'amplification d'ADN in vitro. Une réaction qui permet
l’amplification de fragments d’ADN de manière exponentielle. C’est réaction
cyclique qui repose sur le principe de la réplication de l’ADN par l’ADN
polymérase

Matériel : Equipement : Produits/Solution :

- Tubes PCR - Thermocycleur - Taq Polymérase
- Erlenmeyers - ADN
- Bécher - MgCl₂
- Microtube - dNTPs
- Micropipette - Glycerol
- Portoire - Amorces spécifiques
- Tubes Eppendorf

Préparation d’échantillons :
On réalise les tubes d’ADN pour l’amplification par le thermocycleur,
 Dans
d’Ep

On mets :
- ADN (20- 50
g/l) →
1l
- dNTPs →
5l H₂O → 20l
- Amorce sens et anti-sens → 2l/amorce
- Taq Polymérase → 1l MgCl₂ → 2l

Avant de lancer thermocycleur :

otocole Choisir le protocole
(qui nous arrange)

- Cycle de
PCR :

- Pré
dénaturation à 95°C → 3minutes

- Dénaturation thermique de l'ADN à 95°C → 30secondes

- Hybridation des amorces à 50°C-65°C → 30secondes à 1minutes

- Elongation à 72°C → 1minute

- Elongation finale à 72°C → 2minutes (se fait 1fois)

- Conservation à 4°C → temps ∞