TP BIOCH 0301 - LICENCE L2 Mention SV, SVT et SpS

TP N°2 : DOSAGE ENZYMATIQUE DU GLUCOSE

A - BUT DE LA MANIPULATION :
On se propose de déterminer la concentration en glucose d’une solution inconnue grâce une
méthode colorimétrique utilisant la 4-Aminoantipyrine (méthode GOD-PAP). Le pH réactionnel est
égal à 7.
B - PRINCIPE DU DOSAGE :
Le schéma simplifié de la réaction est le suivant :

La formation de quinonéimine, qui absorbe la lumière à 500 nm, est directement liée à la présence
d’eau oxygénée dans le milieu et par conséquent à l’oxydation du glucose. Il est donc possible de
doser le glucose en mesurant la densité optique (DO) de la solution à 500 nm.
En pratique, on réalise une gamme d’étalonnage avec des concentrations de glucose comprises
entre 0 et 50 µg/mL. Cette gamme permettra d’établir le facteur de proportionnalité qui existe
entre la densité optique lue à 500 nm et la concentration de glucose contenue dans chaque
solution étalon et vous permettra de déterminer la concentration en glucose de votre solution
inconnue.

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Vous aurez également à déterminer la concentration d’une solution de saccharose, appelée
solution S. Pour cela, vous doserez le glucose dans la solution S (saccharose non hydrolysé) et dans
la solution de saccharose hydrolysé, appelée solution S’. L’hydrolyse du saccharose se fera en
milieu acide concentré (HCl 4 M) et à chaud (bain marie à 70°C) pendant 15 min.

C - MODE OPERATOIRE :

I. Préparation de la solution de saccharose hydrolysé S’ :

1) Transférer 2 mL de la solution S dans un tube à hémolyse et ajouter 0,5 mL d'HCl 4 M.
2) Agiter le tube bouché et l’incuber dans un bain marie à 70°C pour réaliser l’hydrolyse
pendant 15 min.
3) Après ces 15 min d’incubation, ajouter 0,5 mL de NaOH 4 M dans le tube S’.
4) Amener le volume du tube S’ à 4 mL avec de l’eau distillée (qsp 4 ml).
II. Préparation des tubes avec les échantillons à doser :
1) À partir d’une solution mère de glucose à 50 µg/mL, préparer des tubes contenants 0 ;
12,5 ; 25 ; 37,5 et 50 µg/mL de glucose dans un volume de 0,25 mL (= Volume de
l’échantillon à doser) comme indiqué dans le tableau ci-dessous.
2) À partir de la solution G représentant une solution inconnue de glucose, dont la
concentration en glucose est à déterminer, préparer 3 tubes (G1 ; G2 ; G3) contenant
chacun 0,25 mL de solution G.
3) À partir de la solution S qui est une solution de saccharose dont il faudra déterminer la
concentration en saccharose, préparer 3 tubes (S1 ; S2 ; S3) contenant chacun 0,25 mL
de solution S.
4) À partir de la solution S’, obtenue par hydrolyse du saccharose, préparer 3 tubes (S’1 ;
S’2 ; S’3) contenant 0,25 mL de cette solution S’.
II. Réalisation du dosage du glucose
1. Introduire 1 mL de réactif GOD-PAP dans tous les tubes.
2. Boucher les tubes et les agiter.
3. Attendre 10 min à température ambiante.
4. Lire la densité optique (DO) à 500 nm (Tube 0 de la gamme = zéro optique de l'appareil).

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 D – RESULTATS :

1. Compléter les tableaux de dosage et de résultats avec les volumes de solution mère de
glucose (50 µg/mL) à prélever et les volumes d’eau à ajouter pour amener le volume de
chaque essai à 250 µL afin d’élaborer la gamme d’étalonnage du glucose.
2. Quel est le rôle de l’ajout de NaOH 4 M dans le tube S’, après les 15 minutes d’hydrolyse
acide ?
3. Déterminer la concentration en glucose (Cfinale) pour la gamme d’étalonnage dans les tubes de
dosage (Volume échantillon + Volume du réactif = Vfinal). [DO = e x L x Cfinale]
4. Tracer la DO à 500 nm en fonction de la concentration en glucose (Cfinale) dans les tubes de
dosage (Volume échantillon + Volume du réactif = Vfinal) exprimée en µg/mL.
5. À partir de la droite d’étalonnage établie, déterminer la concentration en glucose finale (Cfinale)
en µg/mL pour les tubes de dosage G1, G2 et G3 (Volume échantillon + Volume du réactif =
Vfinal).
6. Déterminer ensuite les concentrations initiales (Cinitiale) pour les tubes G1, G2 et G3 (Volume
échantillon = Vinitial).
7. Déterminer la concentration en glucose (Cinitiale) de votre solution inconnue G en µg/mL à partir
de la moyenne des concentrations initiales (Cinitiale) trouvées pour les tubes G1, G2 et G3.
8. En utilisant la même démarche que pour la solution inconnue de glucose G, déterminer les
concentrations finales puis initiales en glucose (µg/mL) dans les tubes S1, S2 et S3 d'une part
et S'1, S'2 et S'3 d'autre part.
9. En déduire la quantité de glucose (en µg) dans les tubes S et S,’ en calculant la moyenne des
quantités contenues dans les tubes S1, S2 et S3 d'une part et dans les tubes S’1, S'2 et S'3
d’autre part.
10. Écrire la réaction de l’hydrolyse acide du saccharose et indiquer les coefficients
stœchiométriques de cette réaction.
11. En déduire la concentration en saccharose de la solution native S en M puis en µg/mL sachant
que : MM saccharose = 342 g/mole, MM glucose = 180 g/mole.

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Groupe :
Nom :
Prénom :

Compte-rendu du TP "Dosage enzymatique du glucose" :

1) Écrire l’équation de la réaction d’hydrolyse du saccharose et indiquer les coefficients
stœchiométriques des réactifs et des produits obtenus après hydrolyse.

2) Pourquoi ajoute-t-on du NaOH 4 M dans le tube d’hydrolyse S,’ après l’hydrolyse acide ?

3) Compléter le tableau de dosage :

Tube N° 0 1 2 3 4 G1 G2 G3 S1 S2 S3 S'1 S'2 S'3
[Glucose] (en µg/mL) dans
tube AVANT ajout du
0 12,5 25 37,5 50
réactif GOD-PAP =
[Glucose] Initiale
Volume de solution mère de
glucose à 50 µg/mL (µL)

H2O (µL)

[Glucose] (en µg/mL) dans

tube APRÈS ajout du réactif
GOD-PAP = [Glucose]
Finale
Volume Solution G inconnue
250 250 250
(µL)

Volume Solution S (µL) 250 250 250

Volume Solution S' (µL) 250 250 250

Volume Réactifs GOD-PAP 100

1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
(µL) 0

Boucher les tubes, les homogénéiser et attendre 10 minutes à T°C ambiante

0,15 0,31 0,48 0,68 0,53 0,54 0,55 0,09 0,09 0,09
DO à 500 nm 0 0 0 0
7 6 9 0 1 3 6 8 4 6

4) Tracer la droite d’étalonnage (y = p * x) : DO500nm = f([glucose] Finale en (mg/mL)) et

déterminer la valeur de la pente de la droite : p = (yb-ya) / (xb-xa)

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4) Compléter le tableau de résultats :
Étude de la solution inconnue de glucose = G
[Glucose] Finale (mg/mL) Tube G1 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] Finale (mg/mL) Tube G2 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] Finale (mg/mL) Tube G3 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] Initiale (mg/mL) Tube G1 (Tube avant ajout du réactif)
[Glucose] Initiale (mg/mL) Tube G2 (Tube avant ajout du réactif)
[Glucose] Initiale (mg/mL) Tube G3 (Tube avant ajout du réactif)
[Glucose] Initiale moyenne (mg/mL) de la solution G = CG
Étude de la solution de saccharose non hydrolysé = S
[Glucose] (mg/mL) Tube S1 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] (mg/mL) Tube S2 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] (mg/mL) Tube S3 (Tube après ajout du réactif)
Moyenne [glucose] (mg/mL) de la solution S = CS
Masse Glucose (mg) Tube S1
Masse Glucose (mg) Tube S2
Masse Glucose (mg) Tube S3
Moyenne Masse Glucose (mg) de la solution S = QS
Étude de la solution de saccharose hydrolysé = S'
[Glucose] Finale (mg/mL) Tube S’1 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] Finale (mg/mL) Tube S’2 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] Finale (mg/mL) Tube S’3 (Tube après ajout du réactif)
[Glucose] Initiale (mg/mL) Tube S’1 (Tube avant ajout du réactif)
[Glucose] Initiale (mg/mL) Tube S’2 (Tube avant ajout du réactif)
[Glucose] Initiale (mg/mL) Tube S’3 (Tube avant ajout du réactif)
Moyenne [glucose] Initiale (µg/mL) de la solution S' = CS’
Masse Glucose (mg) Tube S'1 (Tube après ajout du réactif)
Masse Glucose (mg) Tube S'2 (Tube après ajout du réactif)
Masse Glucose (mg) Tube S'3 (Tube après ajout du réactif)
Masse Glucose (mg) Tube S'1 (Tube avant ajout du réactif)
Masse Glucose (mg) Tube S'2 (Tube avant ajout du réactif)
Masse Glucose (mg) Tube S'3 (Tube avant ajout du réactif)
Moyenne Masse Glucose (µg) de la solution S' = QS’
Détermination de la concentration de la solution de Saccharose dans le tube S
Masse de Glucose (µg) dans le tube S' à la sortie du bain-marie, après
neutralisation et ajout de l’eau (V = 4mL)
Nombre de mole de Glucose dans le tube S' à la sortie du bain-marie, après
neutralisation et ajout de l’eau (V = 4mL)
Nombre de mole de Saccharose dans le tube S' avant l'hydrolyse (VSol S = 2 mL)
[Saccharose] (en M) dans le tube S
[Saccharose] (µg/mL) dans le tube S