TRAVAUX PRATIQUES D’ENZYMOLOGIE

Module Génie enzymatiques

ETUDE CINETIQUE DE LA PHOSPHATASE ACIDE EN

SOLUTION OU IMMOBILISEE

MASTER MICROBIOLOGIE APPLIQUEE ET GENIE

BIOLOGIQUE (MAGBIO)

Pr N. MESKINI

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 CINETIQUE DE LA PHOSPHATASE ACIDE EN SOLUTION
ET IMMOBILISÉE

L’une des voies importante et prometteuse de la bio-ingénierie dans l’industrie

agroalimentaire est l’emploi d’enzymes immobilisées.

Les caractéristiques cinétiques (Km, Vmax et sensibilité à la température ou au pH) de

l’enzyme sont fréquemment modifiées par rapport à celles de l’enzyme native.

On se propose d’étudier l’influence de l’immobilisation sur les paramètres cinétiques

KM et Vmax de la phosphatase acide (PAC) [EC3.1.3.2]

La réaction catalysée par la phosphatase acide est la suivante :

La phosphatase acide (PAC) [EC3.1.3.2] et la phosphatase alcaline (PAL)

[EC3.1.3.3.1] sont des phosphomonoestérases non spécifiques hydrolysant des
liaisons esters lorsque l’acide engagé est l’acide phosphorique mono estérifié.

La phosphatase acide (PAC) [EC3.1.3.2] et la phosphatase alcaline (PAL)

[EC3.1.3.3.1] sont des phosphomonoestérases non spécifiques hydrolysant des
liaisons esters lorsque l’acide engagé est l’acide phosphorique mono estérifié.

Les deux groupes d’enzymes diffèrent par leur pH optimum d’action : la phosphatase
acide possède un pH optimum 5,5 et la phosphatase alcaline est de 9,8.

La phosphatase acide est très abondante dans de nombreux tissus végétaux et

animaux alors que la phosphatase alcaline se trouve dans les bactéries, champignons
(Fungi), et chez les animaux supérieurs mais pas dans les plantes.

Les phosphatases jouent un rôle dans le métabolisme cellulaire, comme par exemple
dans la phosphorylation/déphosphorylation des protéines (i.e. glucose-6-phosphate
phosphatase) dans le métabolisme des acides nucléiques, etc…

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1. DÉTERMINATION DES PARAMÈTRES CINÉTIQUES DE L’ENZYME SOLUBLE

Dosage de l’activité phosphatase

Les phosphatases acides ou alcalines catalysent l’hydrolyse des liaisons esters lorsque
l’acide engagé est l’acide phosphorique mono estérifié. Cette spécificité de substrat
permet d’utiliser un substrat synthétique dont la réaction d’hydrolyse est facile à suivre
comme par exemple le paranitrophénylphosphate.

L’hydrolyse du paranitrophénylphosphate (PNPP) libère un dérivé déphosphorylé, le

paranitrophénol (PNP), qui se transforme à pH alcalin en ion paranitrophénolate
fortement coloré en jaune. On peut donc suivre l’apparition du PNP au cours de
l’hydrolyse en enregistrant l’

absorbance du mélange réactionnel à 405 nm.

I- OBJECTIFS
A/ Etude cinétique de l’enzyme en solution par :
- Mesure de la vitesse initiale de la réaction enzymatique
- Etude de l’influence de la concentration en substrat sur l’activité enzymatique
et détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme (KM et Vmax)
- Etude de l’effet de la concentration d’enzyme sur la vitesse initiale.

B/ Etude cinétique de l’enzyme immobilisée

II- PARTIE EXPERIMENTALE

Les manipulations d'enzymologie sont délicates. Il faut donc observer impérativement
plusieurs précautions. Les pesées, les solutions, les dilutions doivent être effectuées
avec une grande précision. Les temps d'incubation doivent être strictement respectés
et enfin toute la verrerie utilisée doit être systématiquement lavée à l'eau du robinet,
rincée à l'eau distillée et égouttée.

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 A. Réactifs
MgCl2 0,1 M KOH 0,5 M
Eau distillé à 4°C Gélatine 5%
Acétate de sodium 1 M (pH 5,7) Glutaraldéhyde 1%
PNPP 0,03 M

A. ETUDE CINETIQUE DE LA PHOSPHATASE ACIDE EN SOLUTION

Principes généraux des conditions d’un dosage d’activité enzymatique

Lors du dosage d’une activité enzymatique, le contrôle rigoureux des conditions

expérimentales s’impose afin de s’assurer de la reproductibilité des résultats. Les
principaux paramètres sont les suivants :
-le pH (tampon adéquat, de concentration suffisante)
-la quantité d’enzyme
-les effecteurs de la réaction enzymatique
-la concentration de substrat
-la température et le temps de réaction.

Conditions du dosage de l’activité phosphatasique

Pour se placer dans les conditions optimales de déroulement de la réaction, nous
effectuerons les réactions dans les conditions suivantes :
-pH = 5,7 (tampon acétate de sodium 1 M)
-à température de la salle, équilibrer les réactifs avant de déclencher la réaction
-Solution de substrat à concentration saturante
-La réaction sera déclenchée par addition de substrat ou d’enzyme suivant les
expériences à effectuer
-Le temps de réaction doit être strictement le même pour tous les essais d’un
même dosage ; ainsi il sera prudent d’attendre 1 min entre chaque tube pour le
déclenchement de la réaction et de même pour l’arrêt de la réaction.
-Le temps de la réaction t1 sera déterminé au cours de la réaction préliminaire
-Prévoir pour chaque expérience un tube supplémentaire sans substrat ou sans
extrait enzymatique (témoin ou blanc), le volume du substrat ou de l’extrait
enzymatique sera remplacé par un égal volume d’eau.
-La quantité PNP formée pendant la réaction sera déterminée par la lecture de
l’absorbance à 405 nm du tube x contre ce témoin.

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Dosage de l’activité enzymatique

On considère qu’une dilution d’un extrait enzymatique est appropriée lorsque celle-
ci engendre une absorbance ne dépassant pas 0,8 après une incubation pendant
un temps t1 à température ambiante. Si l’absorbance est supérieure à 0,8, l’extrait
enzymatique doit être dilué davantage.

A1- Détermination de la vitesse initiale de la réaction (Vi): hydrolyse du PNPP

en fonction du temps :

Le but étant de déterminer la période initiale durant laquelle la vitesse est constante et
initiale : vitesse initiale. Les mesures de vi seront effectuées durant ce temps.

Préparer 7 tubes renfermant chacun le milieu réactionnel (MR) suivant :

Constituant du MR Volume/tube (mL)

Tampon acétate de sodium 1 M pH 5,7 0,1
MgCl2 0,1 M 0,1
Eau distillée 0,8
Extrait enzymatique dilué 10 x 0,1
Initiation de la réaction : PNPP 0,03 M 0,1
Incuber x min (x = 0, 3, 5, 10, 15 et 20) à température ambiante
Arrêt de la réaction : KOH 0,5 M 2
Lire la densité optique à 405 nm

Remarque importante

Décaler le déclenchement de la réaction entre les tubes de 30 secondes.

Faire de même pour l’arrêt de la réaction.

Discuter votre protocole expérimental avec l’enseignant avant de démarrer la

manipulation.

Lire l’absorbance des tubes à 405 nm contre le tube témoin.

Tracer la courbe DO = f(t).

Déterminer le temps t de réaction situé dans la partie linéaire de la courbe (phase de

vitesse initiale). Vous conserverez ce temps pour la suite de vos expériences.

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A-2 Effet de la concentration de substrat sur la vitesse initiale de la réaction

et détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme (KM et Vmax) pour le

PNPP

Préparer les dilutions suivantes de la solution 0,03 M de PNPP dans l’eau distillée.

PNPP 30.10-3 M non dilué PNPP 3.10-3 M (dilué au 1/10)

PNPP 15.10-3 M (dilué au ½) PNPP 1,5.10-3 M (dilué au 1/20)

Remarque : initier votre réaction par addition de l’extrait enzymatique dilué au 1/10

Réactif (mL) Tube 0 Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

- Acétate de Na 1 M pH 5,7 0,1
MgCl2 0,1 M 0,1
H2O 0,9 0,8
-3
PNPP 1,5.10 M 0 0,1
-3
PNPP 3.10 M 0,1
PNPP 15.10-3 M 0,1
-3
PNPP 30.10 M 0,1
Extrait enzymatique 0,1
PNPP mM/Tube ? ? ? ? ?
Incuber pendant t1 min à température ambiante
Arrêter la réaction par 2 mL KOH 0,5 M

Compléter ce tableau en calculant les concentrations de PNPP en mmol.L-1 pour

chaque tube de la gamme.
-Présenter et discuter avec l’enseignant votre protocole expérimental pour mener à
bien cette partie de la manipulation.
-Lire les absorbances des tubes de 0 à 4 contre le témoin.
-Convertir les DO en concentrations molaires de produit formé (PNP) en utilisant le
coefficient d’extinction molaire à 405 nm e = 1,88. 104 M-1 cm-1.
-Interpréter l’allure de la courbe obtenue.
-Tracer sur un même graphe les courbes 1/vi = f(1/[S])
-Déterminer graphiquement les valeurs de KM et de Vmax de l’enzyme pour le PNPP.

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2. DÉTERMINATION DES PARAMÈTRES CINÉTIQUES DE L’ENZYME
IMMOBILISÉE

L’enzyme est piégée dans le réseau d’un polymère naturel (la gélatine ou collagène ±
dénaturé), puis l’ensemble est réticulé par pontage à l’aide de glutaraldéhyde (cf.
Annexe 2).
2.1 Immobilisation (co-réticulation en bloc de gélatine)
Dans 4 flacons introduire successivement :
· 0,4 mL de solution enzymatique (phosphatase acide)
· 1 mL de gélatine à 5 % dans le tampon acétate pH 5,7 maintenue en surfusion à
45°C.
Utiliser une pipette en plastique ou un cône préalablement tiédi.
· 0,5 mL de glutaraldéhyde à 1 % dans le tampon préparé par dilution extemporanée
en tampon 5,7 de la solution à 25 %.(Solution de glutaraldéhyde commercial est à
25%).
Agiter doucement de manière à éviter la formation de bulles d’air, les éliminer au
besoin en les perçant.
Placer les flacons à 4 °C pendant 10 min puis les remettre 15 min à température du
laboratoire pour laisser se développer la réaction de pontage.
Rincer soigneusement la surface du gel et les parois du flacon avec 2 fois 5 mL de
tampon 5,7 pendant 5 min.

Égoutter les flacons puis les placer au bain thermostaté à 30°C pendant 5 min pour
permettre l’équilibrage de température.

2.2 Mesure de la vitesse initiale

Le volume réactionnel pour la réaction enzymatique est de Vr = 1,1 mL (on ne tient

pas compte des 1,9 mL de la phase solide1), la prise d’essai d’enzyme est de Ve = 0,4
mL. La mesure de l'absorbance

se fait dans un volume de lecture Vlect = 3,1 mL.

Dans les flacons, réaliser la gamme suivante :

Réactif (mL) Tube 0 Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

Acétate de Na 1 M pH 5,7 0,1
MgCl2 0,1 M 0,1
H2O 0,9 0,8
PNPP 1,5.10-3 M 0 0,1
PNPP 3.10-3 M 0,1

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PNPP 15.10-3 M 0,1
PNPP 30.10-3 M 0,1
Incuber pendant t1 min à température ambiante en agitant
fréquemment
Arrêter la réaction par 2 mL KOH 0,5 M
Transvaser le surnageant des flacons dans des cuves de
spectrophotomètre

*En cas d'apparition de trouble ou de particules, filtrer, en particulier pour le tube 0

3 . RÉSULTATS

· Calculer [PNP] dans les différents milieux réactionnels.

· Tracer les courbes DA en t1 min = f([PNP] et 1/DA en t1 min = f(1/[PNP]) pour l’enzyme
soluble et pour l’enzyme immobilisée.
· Déterminer les constantes cinétiques KM (en mmol.L-1) et Vmax (en μkat/L de milieu
réactionnel) (ou S 0,5 et V max app pour l’enzyme immobilisée).
· Déterminer la concentration d’activité catalytique (en μkat.L-1) de l’enzyme soluble.
· Conclure
Données : e = 1,88. 104 M-1 cm-1.

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Paramètres KM et Vmax de la phosphatase acide libre et immobilisée Date

Nom : Prénom : Master MAGBio :

FORMULES LITTÉRALES À ÉTABLIR

e 405 nm = 1,88. 104 M-1 cm-1 Dt =__________ min

Vi = mol.L-1.s-1

catc (b) = μkat.L-1 (contrôler les unités de Vmax)

Tube N° 1 2 3 4
[ PNPP] en M 1,5.10-3 3.10-3 15.10-3 30.10-3
[PNPP] en
mmol.L -1

A405
1/[PNPP] en
L.mmol-1
1/ A405

Km =

Vmax =

catc (b) =

ENZYME IMMOBILISÉE

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 Flacon N° 1 2 3 4
[ PNPP] en M 1,5.10-3 3.10-3 15.10-3 30.10-3
[PNPP] en
mmol.L-1
[pNPG] en
mmol.L-1
A (l = 405
nm)

1/[pNPG] en
L.mmol-1

S 0,5 ou K M app =

Vmax app=

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 ANNEXE 1

Extraction de la phosphatase acide à partir du germe de blé

Il est important de noter que toutes les manipulations d’extraction et de purification doivent
s’effectuer à basse température (0-4°C) afin d’éviter une éventuelle dégradation de
l’enzyme.

1) Préparer un homogénat en broyant 6 g de blé germé dans 10 mL d’eau distillée froide

(4°C) dans un mortier maintenu à froid. Maintenir le mélange à 4 °C pendant 20 minutes
avec une agitation occasionnelle.
2) Filtrer le mélange à la gaze et éliminer les résidus.
3) Centrifuger le filtrat à 10 000 g et 4°C pendant 5 minutes.
4) Décanter avec précaution le surnageant n°1 dans une éprouvette graduée et noter le
volume. Cette fraction I représente l’extrait brut de votre préparation enzymatique.
5) Conserver 1 mL de la fraction I dans la glace pour le dosage de l’activité enzymatique.
Vous faites exactement la même chose pour les autres fractions qui seront préparées
ultérieurement.

C. Purification partielle de la phosphatase acide

1) Placer un erlenmeyer dans de la glace puis transvaser votre extrait enzymatique dedans.
Ajouter ensuite 2 mL de MnCl2 (1 M) pour 100 mL d’extrait enzymatique suivi d’une
agitation.
2) Centrifuger le filtrat à 10 000 g et 4 °C pendant 5 minutes. Récupérer le surnageant 2 et
noter son volume (fraction II)
3) Récupérer le culot n°2 avec 5 mL de tampon acétate de sodium (0,05 M, pH 5,7) et
conserver le mélange dans de la glace. Ce mélange sera nommé fraction III.
4) Transférer la fraction II (surnageant n°2) dans un erlenmeyer de 100 mL préalablement
placé dans de la glace.
5) Pour 100 mL de la fraction II, ajouter en petites quantités 54 mL de la solution saturée
de sulfate d’ammonium (pH 5,5 et à 4 °C). L’addition du sulfate d’ammonium devrait
s’effectuer sur une période d’environ 15 min avec agitation.
6) Maintenir l’agitation pendant 15 min supplémentaires.
7) Séparer le culot n°3 par centrifugation à 10 000 g pendant 5 min à 4 °C.
8) Préparer la fraction IV à partir du culot n° 3 avec 5 mL de tampon acétate de sodium
(0,05 M, pH 5,7) et conserver le mélange dans de la glace.
9) Placer le surnageant n°3 dans un erlenmeyer de 100 mL pour un deuxième
fractionnement au sulfate d’ammonium. Ajouter pour 100 mL de surnageant n°3, en petites
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quantités, 51 mL de la solution saturée de sulfate d’ammonium (pH 5,5 et à 4 °C).
Maintenir l’agitation pendant 15 min supplémentaires.
10) Incuber ensuite le mélange dans un bain-marie préchauffé à 70°C pendant exactement
3 min.
11) Placer ensuite le mélange dans un bain d’eau glacée pendant 5 min.
12) Centrifuger le mélange comme précédemment et noter le volume du surnageant n°4
(fraction V) par centrifugation à 10 000 g pendant 5 min à 4 °C.
13) Reprendre le culot obtenu avec 5 mL d’eau distillée froide. Agiter et centrifuger le
mélange à 10 000 g pendant 5 min pour éliminer les protéines insolubles. La partie soluble
constituera votre préparation enzymatique finale et sera notée fraction VI.

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