CHU BAB-EL-OUED LABOTOIRE CENTRALE

UNITE DE BIOCHIMIE

TP N° 06
Dosage colorimétrique d’acide urique
(Méthode à l uricase)

Responsable du TP : TP réalisé par :

-Dr Guenda -Dr Yahia cherif. A

 I. Introduction
-Chez l’humain, l’acide urique est le produit principal du catabolisme des nucléosides puriques,
adénosine et guanosine.
-Les principales causes d’hyperuricémie sont la goutte primaire (hyperproduction métabolique des
purines ou trouble de l’urico-élimination rénale), ou la goutte secondaire dont la cause peut être
une maladie rénale ou l’administration de médicaments (diurétiques, chimiothérapie...)
L’hyperuricémie peut aussi être attribuée à une défectuosité d’une des enzymes impliquées dans le
métabolisme de purines ou à une hémopathie.
-L’hypouricémie est beaucoup moins courante que l’hyperuricémie.
II. Modalités de prélèvements
-Sérum non hémolysé, plasma prélevé sur héparine ou EDTA.
-Urines des 24h alcalinisées par NaOH (prévenir la précipitation de l’acide urique) et diluées
(1+9) dans l’eau distillée avant dosage.
L’acide urique est stable :
• 3 jours à température ambiante.
• une semaine à 2-8°C.
• jusqu’à 6 mois congelé à –20°C.
III. Les différentes méthodes de dosage :
a) Méthode enzymatique
1. Méthode Enzymatique colorimétrique en point final utilisant une peroxydase et une
réaction auxiliaire (Uricase – Peroxydase) utilisé dans notre TP
Actuellement, l’acide urique est dosé essentiellement par une technique utilisant une uricase
(urate oxydase) décomposant l’acide urique en allantoïne et dioxyde de carbone dans un milieu
tamponné (phosphate) à pH 7,4 ; avec réduction concomitante de peroxyde d’hydrogène
Acide urique URICASE CO2 + Allantoine + H2O2
Le peroxyde d’hydrogène formé réagit avec un chromogène accepteur d’oxygène en présence
de la (POD) pour donner un composé coloré (une quinone-imine colorée en rose) c’est le
principe de la réaction de Trinder.
H2O2 POD H2O + ½ O2

½ O2 + chromogène réduit (incolore) chromogène oxydé (coloré) DO (λ)

L’intensité de la coloration obtenue, mesurée par spectrophotométrie à 520 nm est

proportionnelle à la concentration de l’acide urique dans le milieu réactionnel.
Avantage : Spécifique, Sensible.
2. Méthode enzymatique (uricase) dans l’UV sans réaction auxiliaire
• Ces techniques font appel à une mesure de la diminution de l’absorbance de l’acide urique
dans l’ultraviolet (UV). Le maximum d’absorption est à 293 nm à pH alcalin. En milieu acide,
le maximum est déplacé à 283 nm.
• Elles procèdent à une déprotéinisation par l’acide perchlorique afin d’éliminer les protéines
sériques qui sont une composante majeure de l’absorbance dans ce domaine spectral de
mesure.
• Des techniques utilisant ce principe sans déprotéinisation, avec un blanc du spécimen, une
mesure en bichromatisme, ou en cinétique, sont adaptées à certains analyseurs.
3. Technique utilisant une catalase et une aldéhyde déshydrogénase (ADH) avec une
mesure dans l’ultraviolet
• La réaction, décrite par Haeckel, exploite l’oxydation par le peroxyde d’hydrogène de
l’éthanol par une catalase en acétaldéhyde, transformé en acétate sous l’action de l’aldéhyde
déshydrogénase, avec production équimolaire de NADH plus H+.
• Cette technique est facilement adaptée à de nombreux analyseurs automatisés, mais elle a été
largement supplantée par les techniques utilisant l’urate oxydase et une peroxydase.
b) Méthode chimiques colorimétriques
Les Méthodes chimiques colorimétriques d’oxydation de l’acide urique par un réactif utilisant
l’acide phosphotungstique ne sont pratiquement plus utilisées.
IV. Dosage de l’acide urique par la méthode à l uricase :
Utilisant la méthode de dosage par un seul étalon (standard)

Matériel nécessaire :
o Spectrophotomètre réglé à 520 nm ;
o Cuve de dosage d’1cm ;
o Equipment du laboratoire : Portoir, Tubes secs, Micropipettes (1000, et 25 µL),
Embouts
o Réactifs : Réactif de travail (RT) [flacon R1 (Enzymes), flacon R2 (Tampon)], Etalon,
Contrôles (PN, PP).
Mode opératoire :
- Préparation des réactifs :
On verse sans délai le contenu du flacon R1 (Enzymes) dans le flacon R2 (Tampon), on agite
doucement jusqu’à la dissolution complète
-Conditions du test :
Longueur d’onde = 505 nm (495-505)
Cuve de 1 cm
Température = 37°C
• Régler le spectrophotomètre à la longueur d’onde souhaitée ;
• Pipetage en suivant le Protocol ci-après ;

Réactif de travail : RT (µL) 1000

Blanc, Etalons, contrôle ou enchantions : (µL) 25

• Mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante 25 °C.

• Une solution rose dont l’intensité varie en fonction de chaque concentration est obtenue, et
qui reste stable pendant au moins 30 min.
- Mesure des absorbances :
- Les absorbances obtenues sont les suivants :
Solution Blanc réactif Etalon PCC1 PCC2
Absorbance 0.126 0 ,175 0 ,10 0,171
 Solution S1 S2 S3 S4 S5
Absorbance 0,05 0,116 0,119 0,13 0,146

- Calcul :

➢ Le résultat est déterminé d’après la formule suivante

DO (échantillon) * [étalon] /DO(étalon)
Sachant que C étalon = 100 mg/L

Solution PCC1 PCC2

Concentration 57 97,7
(mg /L)

Solution S1 S2 S3 S4 S5
Concentration 28.57 66 68 74.28 83.42
(mg /L)
Concentration 25 50 56 88 91
de cobas (mg /L)

- Interprétation :
A. Validation des contrôles
La norme de PCC1 est [42,6-57,6] C’est validé

La norme de PCC 2 est [93-129] C’est validé

B. Valeurs Normales :

Prélèvement Age/sexe Intervalle des valeurs normales

Sang Enfant 20 – 55 mg/L
Homme 35 – 72 mg/L
Femme 26 – 60 mg/L
Urines de 24H 250 – 750 mg/24H

C1 = 28.57 mg/l Hypo-uricémie

C2= 66 mg /l uricémie normal

C3= 68 mg/l uricémie normal

C3= 74,28 mg/l Hyper-uricémie

C3= 83,42 mg/l Hyper-uricémie

 V. Exploration Physiopathologique :
A. Variations physiopathologiques :
L'acide urique constitue le produit final du métabolisme des bases puriques provenant du
catabolisme des acides nucléiques, mais aussi d'une synthèse endogène ou de l'alimentation.

Au pH physiologique, l'acide urique est presque totalement ionisé et est présent dans le plasma
sous forme d'urate de sodium. L'acide urique et l'urate sont des molécules relativement insolubles
qui précipitent facilement dans des solutions aqueuses telles que l'urine ou le liquide synovial,
pouvant provoquer des lithiases ou de l'arthrite.

1. Variations physiologiques :
- Age : élevé à la naissance puis diminue pour ré-augmenter à l'adolescence surtout chez les
garçons ;
- Sexe : les valeurs adultes homme sont de 20-30% supérieures par rapport à la femme ;
- Grossesse : l'acide urique diminue pendant les 5 premiers mois (due à l’augmentation de la
clairance),
- Poids : corrélation positive avec le poids chez l'adulte, surtout pour les poids > 80 Kg
- L’uricémie augmente après les repas, l’exercice physique et l’alcoolisme.

2. Variations pathologiques
Hypo-uricémie (<35 mg/L) : elles sont rares ;

- Insuffisance hépatique sévère

- Déficit héréditaire en xanthine oxydase, avec xanthinurie
- Déficit génétique de l’adénosine désaminase
- Sécrétion inappropriée d'ADH
- Médicaments hypo-uricémiants : allopurinol ...

Hyper-uricémie (>72 mg/L)

- Régime anormalement riche en purines

- Augmentation du catabolisme des acides nucléiques (hémopathies, cancers, traitements
cytolytiques… etc.)
- Maladies congénitales du métabolisme des purines dont la plus répandue est la maladie de
Lesch-Nyhan caractérisée par un déficit en hypoxanthine-guanine phosphoribosyl
transférase (HGPRT) qui s'accompagne d'une hyperuricémie et de complications cliniques
(déficits neurologiques).
- Goutte idiopathique
- Déficit partiel en HGPRT (Kelley seegnilen )
- Néphropathie hyperuricémique juvénile familiale (diminution de l’uraturie)
- IRC
- Acidose lactique
- iatrogéne,chimiothérapie ,diurétiques
- glycogenose de type 1: toxémie gravidique ,hyperparathyroidïe ,myxœdeme