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Proteomic, Travaux Diriges

Biochimie (Université de Béjaïa)

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PLATE-FORME BIOMOLECULES
TECHIQUES D'ANALYSE DU PROTEOME.
INTRODUCTION A LA PROTEOMIQUE
COURS / TP

EXERCICE 1
L'isolement et les analyses préliminaire d'une enzyme E ont
révélés sa présence sous deux formes E1 et E2 possédant
respectivement les pHi 6,25 et 6,35.

Les deux formes sont constituées chacune de 4 monomères

appelés A1, B1, C1 et D1 pour la forme E1 et A2, B2, C2 et
D2 pour la forme E2
Les masses moléculaires des monomères de types A, B, C
et D sont 60000, 30000, 20000 et 10000, respectivement.
Seuls les monomères de types B et C sont reliés par des
ponts dissulfures. Les valeurs des pHi de chaque monomère
sont données dans le tableau suivant :

Forme E1 Forme E2
Monomère pHi Monomère pHi
A1 6,3 A2 6,5
B1 6,3 B2 6,3
C1 6,1 C2 6,1
D1 6,3 D2 6,3
L'association des deux monomères de types B et C possède un pHi de 6,2
Trois électrophorèses bidimensionnelles (E2D) ont été réalisées sur l'enzyme E :

E2D N°1: Première dimension : isoélectrofocalisation non dénaturante

Deuxième dimension : Electrophorèse en présence de SDS et de ß-mercaptoéthanol
E2D N°2 : Première dimension : isoélectrofocalisation en présence d'urée 9M
Deuxième dimension : Electrophorèse en présence de SDS et de
ß-mercaptoéthanol
E2D N°3 : Première dimension : isoélectrofocalisation en présence d'urée 9M et
de ß-mercaptoéthanol
Deuxième dimension : Electrophorèse en présence de SDS et de ß-mercaptoéthanol

Etablir les électrophorégrammes correspondant pour chacune des 3 éléctrophorèses

bidimensionnelles. Annoter les polarités et les composants de chaque bande ou tache.
Justifier vos réponses

EXERCICE 2
QUESTION 1: L'étude biochimique approfondie d'une protéine a permis d'élucider sa
structure oligomérique comme étant une composition de deux chaînes A (PM : 20 Kd
chacune) et deux Chaînes B (PM : 40 Kd chacune) liées par des liaisons faibles et des ponts
dissulfure suivant le schéma ci-dessous :

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Avant d'analyser la protéine par électrophorèse sur gel de polyacylamide en présence de

SDS, trois traitements différents ont été réalisés :
Traitement 1 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v) et urée 8 M.
Traitement 2 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v), urée 8 M et
Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v).
Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v)
Traitement 3 : incubation de la protéine en présence du Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v),
uniquement.

1. Rappeler le rôle des composés : SDS, DTT et urée.

2. Schématiser les profils électrophorétiques correspondant à chaque traitement de la
protéine. Justifier votre réponse.

QUESTION 2:

Afin d'étudier par voie de la protéomique les changements affectant des cellules
cancéreuses chez l'Homme, des auteurs ont procédé à la préparation d'échantillons
protéiques à partir de cellules saines et de cellules malades.
Le tampon de lyse utilisé dans cette étude est constitué d'une solution contenant, entre
autres, CHAPS (détergent non ionique) 4% (p/v) et Tris-HCl (pH 7,8) 40 mM.
L'électrophorèse en première dimension est une isoélectrofocalisation sur un gradient de
pH 4,7-5,9 effectuée dans un tampon composé de l'urée 8 M, CHAPS 2% (p/v), Ampholyte
0,2% (p/v), Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) et le bleu de Bomophénol 0,001% (p/v)
Avant la réalisation de l'électrophorèse SDS-PAGE (deuxième dimension), les gels de la
première électrophorèse ont subit l'équilibration dans deux tampons de compositions
suivante :

1er tampon d'équilibration (pH 7,0): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS 2%
(p/v) et DTT 130 mM.
2ième tampon d'équilibration (pH 7,8): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5 M, SDS
2% (p/v) et iodoacétamide 135 mM.
L'électrophorèse en SDS-PAGE a été réalisée sur un gradient 4-20% en polyacrylamide dans
un tampon de pH 8,3 contenant Tris 25 mM, Glycine 192 mM et SDS 0,1% (p/v).

Après coloration, trois protéines ; P1, P2 et P3 d'intensité variable selon l'état des cellules
(normales ou cancéreuses) apparaissent sur les gels de la deuxième dimension. Elles sont
identifiées par leurs coordonnées de points isoélectriques (PI) et de poids moléculaires (PM)
qui sont (4,8, 20), (5,3, 40) et (5,8, 80) pour P1, P2 et P3.

La figure suivante représente une zone du protéinogramme couvrant les PI de 4,7 à 5,9 et
les PM de 20 Kd à 80 Kd. Les 3 protéines d'intérêt sont indiquées par une flèche.

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Les protéinogrammes de la deuxième dimension ont été comparés à ceux de la base de

données SWISS-2-DPAGE (http://expasy.org/ch2d).
Après leur élution des gels, les protéines d'intérêt ont été soumises à une digestion par la
trypsine dans un mélange constitué de bicarbonate d'ammonium 25 mM et de la trypsine
0,02% (p/v).
Les peptides résultant de l'action de la trypsine sont identifiés par spectrométrie de masse
MALDI-TOF. Les empreintes peptidiques obtenues sont comparées à la base de données
Suiss-Prot ave le moteur de recherche MASCOT.

1/ Préciser les quantités ou les volumes des réactifs nécessaires pour la préparation de :
- 70 ml du deuxième tampon d'équilibration
- 150 ml de tampon d'électrophorèse SDS-PAGE.
On donne les PM suivants : urée : 60,06, Tris : 121,14, iodoacétamide : 184,96, Glycine :
75,07

2/ Rappeler le rôle du CHAPS et de l'iodoacétamide

3/ Rappeler le mode d'action de la trypsine
4/ Rappeler la signification d'une empreinte peptidique générée par spectromètrie de
masse MALDI-TOF.
5/ Préciser sur l'électrophorégramme les protéines P1, P2 et P3. Justifier vos réponses

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