République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université de M’hmed Bougara Boumerdes
Faculté des sciences
Département de biologie

Spécialité:
Biotechnologie microbienne

Module :
Enzymologie

Exposé :

Isolement et purification des

enzymes
Proposé par:
Madame HAMOUDI

Réalisé par :
AISSAT NARIMANE
BENALI NARIMANE
CHETAH GHANIA
RAMDANI KAHINA
ATIG DJAZIA
ARABI MOHAMED

Groupe : 03

2021 / 2022

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Sommaire :

I. Introduction……………………………………… 2
II. Généralités sur les enzymes……………………….2
III. Extraction et purification des enzymes…………...6
IV. Conclusion………………………………………….14
Référence …………………………………………..15

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 I. Introduction
Les enzymes sont des catalyseurs des réactions chimiques qui se déroulent chez les êtres
vivants, elles possèdent trois caractéristiques essentielles : ce sont des protéines, elles ont une
spécificité d’action élevée, et elle augmente considérablement la vitesse des réactions qu’elles
catalysent .

Leur activité varie en fonction de certains facteurs comme la température, le pH et leur

concentration.

Chaque enzyme est plus ou moins spécifique de son substrat auquel elle se lie étroitement pour
catalyser sa transformation grâce à des sites actifs.

L’activité d’une enzyme se mesure soit :

 Par la vitesse de disparition d’un substrat

 Par la vitesse d’apparition d’un produit
 Par la vitesse d’utilisation d’un cofacteur

II. Généralités sur les enzymes

II.1 Structure d’une enzyme

Les enzymes sont en général des protéines globulaires:

• la structure primaire: est constituée d’un enchaînement covalent d’acides aminés

• La structure secondaire: la séquence d’acides aminés subit des repliements pour former des
motifs hélices alpha et feuillet béta

• La structure tertiaire: certaines attractions apparaissent entre les hélices alpha et les pliures

• la structure quaternaire: protéine constituée de plus d’une chaîne d’acides aminés

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 Figure 01 : structure d’une enzyme

II.2 Rôles d’une enzyme

 La dégradation ex glycolyse (dégradation de glucose en fructose +galactose)

 La synthèse de molécules ex amidon-synthétase

 La conversion ex peroxydase

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II.3 Classification
Selon l’Union Internationale de Biochimie on distingue six grandes classes des enzymes:

a) Oxydoréductuctases :
Qui catalysent des transferts d’électrons et de protons d’un donneur à un accepteur

b) Tranfférases :
qui catalysent les transferts de groupements

c) Hydrolases :
qui catalysent des réactions d’hydrolyse (coupure des liens C-C , C-O , C-N et autres par l’eau)

d) Lyases :
qui catalysent l’addition de groupes à des liens doubles l’inverse

e) Isomérases :
qui catalysent le transfert de groupes dans une même molécule pour produire des formes isomères

Ex : conversion d’un acide aminé Len acide aminé D

f) Ligases :
qui forment des liens C-C , C-S , C-O et C-N lors de réaction de condensation couplées à
l’utilisation d’ATP

II.4 Origine des enzymes :

Les enzymes proviennent de source

 Végétale : ont joué un rôle important dans la production alimentaire les sirops la boulangerie
les boissons alcoolisés les produits laitiers
 animale (enzymes d’extraction)
 produites par fermentation (par des micro-organismes)

Enzymes d’origine végétale :

-Papaïne (extrait de papayer)

-ficine (extrait des figues)

-Amylase, béta-Glucanase (extraient de Malt)

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 • Enzymes d'origine animale :

- Chymosine, (extraient de la caillette de veaux)

- Pepsine (estomac de porc)

-trypsine (pancréas de bœufs)

Enzymes produites par les micro-organismes :

• - Endoenzymes (glucose oxydase, catalase)

• - Exoenzymes (cellulase, lactase)

Figure 02 : processus d’isolement et purification des enzymes

III. Extraction et purification des enzymes

III.1 L’extraction

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Extraction est un mot formé de deux parties d’origine latine : « ex » et « traction » qui signifie de tirer
quelque chose à l’extérieur. C’est une méthode de séparation chimique vise à isoler et à séparer une
substance spécifique des autres substances.
L'extraction consiste à libérer spécifiquement des enzymes intracellulaires par éclatement de la
membrane cellulaire.

Figure 03 : schéma représente les techniques d’ extraction

III.1.1 Critères de choix

Les enzymes peuvent être extraites de tout organisme vivant mais il est toujours préférable de choisir
les micro-organismes comme une source car :
 Leur croissance est rapide.
 Facilement optimisable.
 Leur teneur en enzymes est plus prévisible et contrôlable.
 Des végétaux et des animaux contiennent plus de matières potentiellement nocives que les
microorganismes.

III.1.2 Méthodes d’extraction

Les enzymes sont des complexes biologiques sensibles nécessitent un traitement spécial pendant
l’extraction. De ce fait, il existe plusieurs méthodes pour les extraire sélectionnées selon les critères
suivantes:
 Type de la cellule utilisée :

A B C
Figure 04 : cellule végétale (A) ; cellule animale (B) et cellule bactérienne (C)

 La localisation de l’enzyme : intracellulaire, extracellulaire

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 Figure 05 : schéma représente la localisation de l’enzyme

 Les conditions de purification de l’enzyme.

 L’équipement disponible.

III.1.2.1 Méthodes physique

Choc osmotique : se fait par le changement de concentration des solutés aux extrémités de la
membrane cellulaire. L'incubation des cellules fragile dans une solution hypo-osmotique permet
d'entrer l'eau et les gonfler jusqu'à ce que les membranes lipidiques se rompent et laissent passer leur
contenu dans le milieu extracellulaire induisant ainsi l'éclatement des organites.

Figure 06 : schéma représente le phénomène d’osmose

III.1.2.2 Méthodes mécaniques

Congélation-Décongélation: cette méthode permet de détruire les membranes plasmiques des cellules
suite à la formation des cristaux de glace durant la congélation.

Homogénéisateur de type Dounce : c'est un appareil de broyage comprends un cylindre avec

réservoir et 2 pistons permettant d'effectuer un broyage fin ou ultrafin.
Le passage des cellules dans l'espace extrêmement exigu entre le piston et la paroi interne du tube
cause leur rupture.

Homogénéisateur de type potter-Elvjm : Il s’agit d’un piston cylindrique en téflon sur une tige
tourne dans un tube en verre.cette technique douce est utilisée pour perturber des tissus mous tels que
les tissus animaux.

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 Figure 07 : homogénéisateurs dounce et Potter Elvejm

Bombe à disruption : Cette technique consiste à traiter l’échantillon avec de l’azote solubilisée à
haute pression ; Par la suite, la chute brutale de la pression retourne l'azote en solution à son état
gazeux et des bulles se forment à l'intérieur des cellules qui s'éclatent. .

Broyage ou agitation avec des abrasifs : Les micro-organismes sont désintégrés par agitation
violente en présence de microbilles de verre avec rupture leur paroi

Les billes de verre : pour cette technique On utilise un appareil ressemblant à un blinder, mais sans
lames, rempli de petites billes en verre, qui en tourbillonnant furieusement dégradent les cellules
contenues dans la suspension.

Figure 08 : Schéma représente l’appareil utiliser dans l’extraction par bille de

Verre

Sonication: l'appareil utiliser dans est le sonicateur ,constitué d'un tige métallique et d'un générateur
électrique.cette appareil il consiste à la destruction des cellules par les ultrasons. Quand la tige
introduite dans la suspension cellulaire les vibrations ultrasoniques causent la croissance des bulles par
un phénomène de cavitation, bulles sont agrandies plus en plus jusqu'à L'explosion entraînant la
destruction de la paroi et par conséquence la libération de contenu cellulaire .L'efficacité de cette

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technique est liée à des paramètres tels que le pH, la température et la force ionique du milieu de
suspension, ainsi que le temps d'exposition aux ultrasons.

III.1.2.3 Extraction chimique :

Cette méthode consiste à transformer le produit de la phase aqueuse vers la phase organique en
mélangeant avec un solvant organique, et après l'extraction les deux phases sont séparées.
En détermine le solvant par des critères:
-La solubilité du produit dans la phase organique par rapport à la phase aqueuse.
-La stabilité du produit dans la phase organique.
-La sélectivité du solvant.

III.1.2.4 Enzymes lytiques

Sont des molécules capables de provoquer les cellules (les levures, les plantes et les bactéries) par
choc osmotique.

III.1.2.5 L'extraction liquide-liquide

Est l'une des opérations Les plus pratiquées dans un laboratoire, elle consiste à une séparation d'un ou
plusieurs constituants par transfert entre deux phases liquides non miscible.
On distingue deux types d'extraction liquide-liquide:
•l'extraction par échange d'ions: Il est basé sur une réaction chimique et l'échange de cations et
d'anions.lorsque le soluté traverse le solvant,La phase d'alimentation est enrichie en espèces présentes
dedans.
•l'extraction non-compensée : L'extraction peut se faire avec un réactif solvant, permettant des
transferts résultant de réactions chimiques fortes ou insolubles.

III.1.2.6 L'extraction liquide-solide

L’extraction solide-liquide consiste à extraire une espèce chimique se trouve dans un milieu solide
préalablement broyé par un solvant liquide.
 Types d'extraction liquide-solide

Décoction: consiste à chauffer la racine ou l’écorce d’une plante avec de l’eau; jusqu’à ce que cette
dernière soit bouillante et les constituant se dissolvent.
L’infusion: consiste à verser de l’eau bouillante sur des plantes (les feuilles ou les fleurs) finement
broyées puis les laisser tremper pour dissoudre leurs principes actifs.
La macération: Consiste à laisser séjourner à froid un solide dans un liquide pour en extraire les
constituants solubles dans ce liquide.
La digestion: est une macération à chaud, elle est utilisé surtout en l'industrie pharmaceutique.
La percolation: Elle s'effectue par le passage d'un fluide à travers un milieu plus ou moin perméable.

III.2 La purification
III.2.1 Définition
La purification des enzymes est l’isolement d’une enzymes de son milieu naturel et l’élimination des
protéines contaminants dans objectif d’étudier
ces propriété (la structure, sa cinétique) ou pour son utilisation en médecine (traitement, diagnostic) ou
en industrie.

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Est un ensemble d’opérations visant a enlever toutes les impuretés d’un extrait brut contenant
l’enzymes d’intérêt. En principe, n’importe quelle méthode destinée au fractionnement de protéines
peut être employée pour la purification d’enzymes (ILLANES, 2008). La purification d’une protéine
donné passe par l’étude de différents critères la caractérisant, et permettant de la séparer des autres
molécules (taille, forme, chargé...)

III.2.2 Objectifs de la purification des enzymes

La purification des enzymes a comme objectifs essentiels d’avoir :
1. un maximum du rendement de l’enzyme.
2. un maximum de pureté possible
3. un maximum du son activité catalytique.

III.2.3 Méthodes de la purification

Une fois que l’extrait de l’organite est prêt certains nombre de méthodes sont disponible pour séparer
les protéines
Méthodes par précipitation, méthodes chromatographiques, fractionnement liquide-liquide
La purification d’une protéine (enzyme, protéine de transport, hormone) devra mettre en œuvre
plusieurs techniques successives et/ou complémentaires. Les propriétés caractéristiques des protéines
peuvent être exploitées pour sépare un mélange de protéine selon :
 Leur taille moléculaire
 Leurs solubilité leurs charges électriques
 Leur affinité biologique pour d’autres molécules
 Leurs différences d’adsorption caractéristiques.
La purification des protéines nécessite des conditions rigoureuses, solution aqueuse avec une
température entre 0°C et 4 °C, pH non dénaturant

III.2.3.1 Procédées de séparation basée sur la taille moléculaire :

 Dialyse La dialyse est une technique qui sépare des substances on utilisant leur
capacité respective à franchir pores d’une membrane appelle membrane de
dialyse (en cellophane ou autre matière) les petites molécules dans le boudin
sort du sac vers le liquide de contre dialyse.

Les membranes de dialyse sont sous forme d’un cylindre allongé qu’il faut fermer de deux extrémités
et qui contient le liquide à dialysé, ce cylindre port le nom de boudin de dialyse.

Le dialyse set souvent appliqué pour concentrer une substance protéique et pour éliminer les produits
diffusible tel que les ions.

 Centrifugation

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 Elle permette de séparer les constituants d’un mélange sur la base de leur différence de densité
dans un solvant, en effet si la particule à une densité plus élevée que le fluide en lequel elle est
immergée elle tend à émigré en bas suivant la direction de force de pesanteur.

 Filtration membranaire
Consiste à séparer les particules solides qui se trouvent en suspension dans un liquide par une
membrane, tout en limitant son colmatage pour obtenir un fonctionnement stable. On
distingue deux type de procédés : filtration tangentielle et filtration frontale.

III.2.3.2 Procédés basé sur les différences de solubilité

La solubilité des protéines en solution est fonction de plusieurs facteurs : pH, température, force
ionique, propriété électrique du solvant ect… ces variables peuvent être utilisé pour séparer des
mélange protéique.

 Précipitation différentielle
Consiste à rendre une protéine insoluble dans un solvant donnée .cette solubilité dépend de
l’hydratation de ces protéines de leur structures et leur PH.
Exemple : précipitation différentielles au sulfate d’ammonium
C’est une technique douce (préserve en général la structure et donc la structure d’enzyme)
La solution protéique sulfate d’ammonium déshydratation et précipitation des protéines,
induisant ainsi le phénomène de relargage

Figure 09 : précipitation au sulfate d’ammonium

III.2.3.3 Méthodes basées sur les propriétés ionique

 Chromatographie est une méthode relativement simple de séparation du composé

désiré de ses impuretés basée sur les différentes affinités d’un composé à l’égard de deux

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 phases l’une dite stationnaire est emprisonné dans une colonne ou fixé sur un support et
l’autre, dit mobile se déplace au contact de la première
Type de la chromatographie
 Chromatographie par échange ionique

C’est une méthode utilisant le comportement acido-basique des protéines pour leur séparation
comme les acides aminées, les protéines peuvent être purifie par chromatographie sur colonne
échangeuse d’ions, cette technique exploite essentiellement les différences de signe et d’amplitude
des charges électriques net des protéines.

La colonne de chromatographie est formée de long tube remplis de particules synthétique

contenant des groupements fixés chargée.

On distingue deux type d’échangeuse d’ion s selon la nature de la substance qui sert de support ou
groupement chimiques chargés

-Résine échangeuses d’ions ;

-Les échangeurs doux dérivent de cellulose, portés par les dérivées de cellulose ou autres
polymères glucidique, dans tous les cas il existe des échangeurs de cation et échangeurs
d’anion. ceux possédant un groupement anion fixe sont appelé résine échangeuse de cations a
l’inverse ceux possédant un groupement cation fixe sont appelé résine échangeuse de anions.

-Les matériaux les plus utilisés sont des dérivés de cellulose ils sont peut dénaturant comparé
aux résines, mais par contre moins résistante aux conditions extrêmes physiques et chimiques
en particulier à la pression et pH.

 Chromatographie par adsorption

La phase solide est constituée d’une résine adsorbante qui fixe, faiblement et de façon
non spécifique, certains composés en solution par l’entremise de liaisons de van der
waals lorsqu’on charge la colonne, la phase mobile (l’éluant est généralement un
solvant) modifie ensuite les propriétés de la résine, ce qui force la désorption des
composés qui y étaient adsorbés et permet leur séparation au cours de l’élution
 Chromatographie de partage
Fonctionne par partage de solutés entre deux phases non miscibles ; l’une mobile et
l’autre stationnaire. Plus la répartition des composés d’un mélange dans la phase
stationnaire est grande plus leur rétention est grande et inversement. L’affinité de
chaque constituant pour la phase stationnaire dépend de sa solubilité dans cette phase
et de sa polarité
 Chromatographie d’exclusion
La phase stationnaire est un gel ou un réseau macromoléculaire exerçant un véritable
effet de tamis vis-à-vis de grosses molécules, celles-ci migrant plus vite que les
molécules de plus faible poids moléculaire qui elles peuvent diffuser librement dans la
phase stationnaire alors que les premières ne le peuvent pas

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  Chromatographie d’affinité
On utilise ici une interaction plus spécifique pour obtenir une séparation, en mettant à
profit un système biologique du type antigène-anticorps, enzyme-inhibiteur ou autre.
Un ligand ayant la propriété de fixer spécifiquement une molécule ou un groupe de
molécules est lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi, au moment du
chargement de la colonne, les composés qui ont une affinité pour le ligand sont fixés
alors que les impuretés sont éliminées. Par la suite, les composés sont élués avec un
solvant dont les caractéristiques chimiques favorisent leur dissociation d’avec le
ligand
 L’électrophorèse
On appelle électrophorèse le déplacement des particules chargées dans un champ électrique
continu, le déplacement de la particule dépend de plusieurs facteurs :
Temps de migration, force ionique et pH du tampon, de la température du courant électrique
appliqué.

Les différences de migration des protéines dans un champ électrique peuvent être mise à profit
pour leurs séparations.

On distingue : l’électrophorèse sur papier et l’électrophorèse sur acétate de cellulose

Les composée protéiques ont séparée en zone ou en bandes. La révélation est réalisée en colorant
par le noir amide ou le rouge ponceau qui se fixent sur les protéines et persiste même après lavage
des appareils spéciaux (densitomètres) permettes de mesuré l’intensité de coloration de chaque
bande et de déduire le pourcentage de chaque zone de migration qui est proportionnelle à la
quantité des protéines dans le mélange.

Figure 10 : représente l’électrophorèse

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IV. Conclusion
Les enzymes sont des protéines qui assurent la catalyse biologique. Elles accélèrent les réactions
métaboliques d'un organisme vivant. Ces enzymes sont essentielles pour la vie, ils sont utilisés dans
différents domaines tel que : l'industrie des détergents, de l'amidon, l'agroalimentaire (alimentation
humaine et animale), la chimie fine et le secteur de la santé, ainsi que les domaines de l'analyse et des
capteurs.

L’obtention d’une enzyme soit d’une source végétale ou animale ou microbienne passe toujours par
les deux étapes extraction et purification. Ces deux étapes sont indispensable pour obtenir le
maximum de rendement et de pureté ,ces dernières restent liées aux techniques de séparation
utilisées .

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Références

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ILLANES A.(2008). Enzyme biocatalysis principales and applications. Springer.

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15
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131).

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moléculaire. G oren jski Tisk. Paris (p : 34-40-42-45-303).

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