TP 4 ACTIVITE ENZYMATIQUE ET CONDITIONS DU MILIEU

Les enzymes sont des protines qui agissent dans des conditions de temprature et pH notamment,
compatibles avec la vie.

Objectif : On cherche savoir dans quelle mesure les conditions du milieu modifie lactivit
enzymatique.

Matriel :
- 50 g Pomme de terre -solution de glucose1P (substrat)
- Eau distille - rcipient avec glace -tubes essais
-eau iode -bain-marie (35 ou 80C) -plaque de titration (puits)
-logiciel lactase -chronomtre -thermomtre digital
- pipette 10mL et 2mL et propipette -glace

Activits et droulement des activits Exigences

Comprendre ou proposer une dmarche de rsolution
La pulpe de pomme de terre contient une enzyme, lamylosynthtase
catalysant la synthse damidon partir du glucose1P.
1) Proposer un protocole exprimental permettant de tester - Mise en relation des
informations et des
linfluence de la temprature et du pH sur lactivit connaissances pour proposer un
enzymatique. protocole

Utiliser des techniques et grer le poste de travail

2) Raliser les protocoles proposs dans la fiche annexe. - Respect des tapes du
protocole
- Bonne utilisation du matriel
Appeler lexaminateur pour vrifier les rsultats et ventuellement et des produits
obtenir une aide. - Rsultats de qualit
- Paillasse bien organise et
range en fin de manipulation
Communiquer l'aide de modes de reprsentation
3) Prsenter, sous la forme de tableaux les rsultats obtenus - Titre adapt
- Travail clair et soign
lors du test de lactivit enzymatique en fonction de la - Tous les rsultats sont
temprature et lors des tests tablis par le logiciel lactase. consigns

Appliquer une dmarche explicative

4) En comparant les rsultats obtenus pour les diffrentes -Mise en relation des donnes
tempratures dune part, pour les diffrents pH dautre part et pour les exprimentales afin de rpondre
au pb pos
autres facteurs, montrer que les conditions du milieu ont une
influence sur lactivit enzymatique.
 Protocoles

Recherche de linfluence de la temprature sur lactivit enzymatique

- Broyer la pomme de terre (50g mix) avec 30 mL deau distille dans le mortier plac dans la glace.
- Filtrer la solution ainsi obtenue par broyage afin dobtenir un filtrat contenant lamylosynthtase.
- Placer le bcher contenant le filtrat dans le bac avec la glace.
- Prlever une goutte du filtrat dpos dans le verre de montre et vrifier labsence damidon.
- Prparez les deux tubes suivants : Tube 1 (tmoin) Ajouter 1 mL deau distille dans un des deux tubes
contenant la solution de glucose1P (prpar).
Tube 2 : 1 mL de filtrat (amylosynthtase).
Le tube 3 (dj prt) contient 1 mL de solution de glucose1P.
- Placez vos trois tubes la temprature de travail de votre groupe afin que leur contenu squilibre
la temprature dsire (vrifier la T atteinte au bout de 3 minutes).

Rq : Pour les tempratures suprieures la T ambiante : 35C et 80 C : utiliser le bain marie.

Pour la temprature 0C placez vos tubes dans un bcher contenant de leau et de la glace. Ajustez la
temprature en ajoutant plus ou moins deau la glace en utilisant le thermomtre digital

-puis au temps considr comme To versez la totalit du filtrat contenant lamylosynthtase du tube 2
dans le tube 3.
- Bien mlanger le contenu des deux tubes (tmoin et celui contenant enzyme+substrat) en faisant un
flux et reflux laide dune pipette 2mL rserve chacun des tubes.
- Prlevez et dposez 2 gouttes de chaque tube dans un puit de la plaquette de titration et ajoutez 1 goutte
deau iode afin de vrifier la prsence ou pas damidon.
- Ralisez ce mme test dans chacun des tubes toutes les deux minutes pendant 16 minutes
Rq : Bien mlanger le contenu de chaque tube avant chaque prlvement,

- Au bout de 8 min et 16 min coules, faites un test de dtection de glucose laide dune bandelette
ractive au glucose, dans chacun de vos tubes.

Recherche de linfluence du pH sur lactivit enzymatique

La lactase est une enzyme produite chez lhomme au niveau du Jejunum (partie centrale de
lintestin grle) elle intervient dans la digestion du Lactose en glucose et galactose.

Le logiciel lactase permet un suivi de la concentration en substrat (le lactose) en prsence de lenzyme
(la lactase) en fonction du temps, tout en pouvant faire varier diffrents paramtres :
la temprature, le pH, la concentration en substrat, la concentration en enzyme, la concentration en un
autre sucre le thiolactose

-Ouvrir le logiciel lactase

- Fixez la concentration en enzyme 25 UA, celle du substrat 50 UA et la T 37C ( T optimale de la
lactase humaine)
- Pour chaque valeur de pH attribue par le professeur, consultez la courbe de la disparition du substrat
au cours du temps et dterminer t1/2 c'est--dire le temps ncessaire pour dgrader la moiti de la quantit
initiale de substrat.
- pour chaque valeur de pH teste prciser si la structure spatiale de lenzyme est modifie (si oui
comment cela se traduit)

Recherche dautres facteurs qui modifient la vitesse de la catalyse enzymatique

Le professeur vous attribuera un paramtre tester, soit :
- leffet de la variation de la quantit de substrat prsente dans le milieu
- leffet de la variation de la quantit denzyme prsente dans le milieu ractionnel
- leffet dun inhibiteur qui est le thiolactose qui forme un complexe inactif avec lenzyme

- Fixer les autres paramtres aux mmes valeurs que prcdemment (choisir le pH optimal dtermin
prcdemment), et faire varier uniquement le paramtre attribu par le professeur.
- Comparer les vitesses de la raction enzymatique observes suite aux variations de ce paramtre.
Pour lactivit T :
2 binmes 0C (glace)
2 binmes 35C (bain marie prrgl)
2 binmes temprature ambiante
2 binmes 80C (bain marie prrgl)

- Rcuprer le tube plac a 0C et celui plac 80C ou aucune activit enzymatique na pu tre observe.
- Placer les au bain marie pendant 10 min la temprature optimale de lamylosynthtase dtermine (35)
- Vrifier, dans chacun de ces tubes, si lenzyme a agit : synthse damidon partir du glucose.

Possibilit de faire une courbe de Gauss (temps en fonction de la Temprature)

Pour lactivit pH : pH : 4 14
pH 2 et 3 toutes les enz sont dnatures pas de raction
ph 4 : t1/2 = 80 sec
pH 7 : 10 sec
pH 10 : 12 sec
pH 12 : 60 sec

Puis le professeur vous attribuera un paramtre tester, soit :

- leffet de la variation de la quantit de substrat prsente dans le milieu
- leffet de la variation de la quantit denzyme prsente dans le milieu ractionnel
- leffet dun inhibiteur qui est le thiolactose qui forme un complexe inactif avec lenzyme