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la phosphatase alcaline
Enzymologie 2
Cabaret Laurine
Martin Laetitia
Groupe C2
01/10/2010
I. Introduction
Le but de cette manipulation est de dterminer les paramtres cintiques dune enzym
dtudier linfluence de la concentration en substrat et de la prsence dun inhibiteur su
vitesse de raction.
Dans ce TP, nous allons utiliser une prparation commerciale de phosphatase alcaline d
veau. Il sagit dune enzyme alcaline 2 substrats, capable dhydrolyser les monoesters
phosphoriques selon la raction suivante :
II. Principe
2-
+ 2O
H 4 HPO
+
PNPP incolore
De plus, pour connatre la quantit de produit apparu dans le milieu, on ralise une gam
talon de tubes contenant diffrente concentration (connues) de produit. On trace la dr
DO = f ([PNP]). En reportant labsorbance dune solution de concentration inconnue, on
peut en dduire sa concentration.
Afin de raliser la gamme talon et les milieux dincubation, nous devons pralablemen
prparer les solutions de substrats de concentrations diffrentes.
1) Solution de PNPP :
Nous voulons prparer 6 tubes de solution de PNPP 2,5 mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM,
0,167mM, 0,125mM, partir dune solution mre de 5mM. Pour cela, nous effectuons u
dilution en cascade.
C1 V1 = C
2 V2
V1 = 20mL
Donc V
1 = (C
2 V2 )/ C1 V= (0,0025 * 0,02) / 0,005 = 10 mL
Il faut donc prlever 10mL de la solution mre, et ajouter 10mL deau pour la diluer 2 fo
2) Solution de glycrophosphate :
Comme prcdemment, nous voulons prparer 2 tubes de solution de glycrophosphat
2,5mM et 1mM, partir dune solution mre 5mM.
7mL 4mL
C 1 V1 = C
2V2
Vf1 = 10mL
Donc V
1= ( 2
CV2)/ C1 V= (0,0025 * 0,0014) / 0,005 = 7 mL
Il faut donc prlever 7mL de la solution mre et ajouter 7mL deau pour la diluer 2 fois.
1) Gamme talon n1 :
Nous prparons la gamme talon puis nous mesurons la DO dans chaque tube 410 nm
longueur donde laquelle le produit (PNP) absorbe. Nous traons, ensuite, la droite ta
DO corrige = f (quantit de PNP)
CF tableau 1 et figure 1a
n = CV
2) Milieux dincubation :
Cf tableau 2
[PNPP] = (C
PNPP.VPNPP) / V
total
[PNPP] = (C
PNPP.VPNPP) / V
total
-3
[PNPP] = (17,85.10
. 1,75)/2 = 15,6 M
[PNPP]B = 20,90 M
[PNPP]C = 31,25 M
[PNPP]D = 62,5 M
[PNPP]E = 124,95 M
[PNPP]F = 324,71 M
[PNPP]G= 625,0 M
Cenz Venz = C
tubeVtube
Cf tableau 2 figure 2
Commentaire :
Daprs les courbes obtenues, on peut voir que la DO augmente au cours du temps, et
faon linaire pendant environ 1min. Ce qui signifie que la quantit de produit dans le
milieu augmente.
De plus, on remarque que plus la concentration en substrat est grande (croissante de A
plus la pente de la courbe, dans les temps initiaux, est importante. Ainsi, la vitesse
dapparition du produit dans le milieu, augmente avec la concentration en substrat.
Ensuite, pour un temps > 1minute, Il ny a plus de relation linaire (pour les milieux A,
D, E). En effet, la quantit de substrat dans le milieu, diminue au fur et mesure de la
raction. Ainsi, il y a de moins en moins de produit form donc labsorbance naugmen
plus de faon linaire.
Pour F et G, on remarque que pour un temps > 1min, la courbe reste linaire. Effectivem
la quantit de substrat est encore suffisante pour que la raction seffectue une vitess
initiale, maximale.
On obtient :
Reprsentation graphique :
On obtient alors des valeurs approximatives de Vmax et Km :
Si on reporte cette valeur sur la gamme talon n1, on trouve Vmax = 24,9 mole/min
Km = 23,4 mole/L
Ainsi, il est ncessaire de linariser cette reprsentation, afin de diminuer ces incertitud
et obtenir des valeurs beaucoup plus prcises. Nous allons donc utiliser les reprsentat
de Lineweaver-Burke, et Hanes-Woolf.
Vi =
= = +
= . +
Reprsentation graphique :
A partir de la reprsentation de Lineweaver-Burke, on peut en dduire celle de Hanes-
Woolf :
= . + = . +
=[PNPP]. +
Reprsentation graphique :
Les reprsentations graphiques de ces deux relations, sont prfrables celle de Micka
Menten, car elles sont linaires et donc plus prcises pour la dtermination des constan
cintiques Vmax et Km, dune raction enzymatique.
Lineweaver-Burke :
- Vmax =
- Km =
Hanes-Woolf :
- Vmax = 27,2 mole/L/min
- Km = 34,42 mole/L
Cf figure 4b et 4b
3) Ordre de la raction :
Daprs la courbe de Mickaelis-Menten, pour des faibles concentrations en substrat (de
0,3 M), on a une courbe linaire.
[PNPP] >> Km donc
, V = Vm/Km)
( . [PNPP]
Pour des concentrations en substrats importantes (de 200 500 M), on a un plateau.
+
ASZn2 = (27,2. 0,002) / (0,1 . 0,25) = 2,2 mol/min/mg
2+
Or lactivit spcifique obtenue en prsencedansde Mgles conditions optimales est cinq
2+
fois plus forte que lactivit spcifique en prsence
. de Zn
ASMg2+= AS
Zn2+. 5 = 2,2 . 5 = 11,0 U/mg
Lactivit spcifique que nous trouvons est lgrement plus leve que celle donne pa
fabriquant.
1) Gamme talon n2
Nous ralisons une deuxime gamme talon de tube, puis nous mesurons la DO 410n
Cf tableau 4 et figure 1b
Tube 1: n= 0 mol
Tube 2: n=PNP
(C. VPNP) = (0,5 . 0,2) = 0,10 mole
De la mme manire, on obtient :
Tube 1: C= 0 mol/L
Tube 2: C=PNP
(C. VPNP) / Vtot = (0,5 . 0,2) / 5 = 20 mol/L
Tube 3: C= 40 mol/L
Tube 4: C= 60 mol/L
Tube 5: C= 80 mol/L
Tube 6: C= 100 mol/L
Dans cette partie, nous allons tudier linfluence dun inhibiteur : le glycrophosphate (GRO-P)
vitesse de la raction enzymatique. Pour cela, nous allons prparer des sries de tubes de
concentration en inhibiteur et en substrat (PNPP) diffrente. Nous allons ensuite, lancer la rac
enzymatique dans chaque tube, pendant 3min exactement, afin de pouvoir comparer les vitess
avec celles obtenues prcdemment.
Enfin, nous mesurons la DO 410nm.
2V2 C1 = C
C1V1 = C 2V2/V1
2V2 C1 = C
C1V1 = C 2V2/V1
Afin de dterminer la quantit de produit libr (en mole/L), on reporte les valeurs de
DO sur la gamme talon n2. Pour obtenir la vitesse de la raction, on divise ces valeur
le temps dincubation (3min). On a alors, une vitesse en mole/L/min.
CPNP = C . 5/4
PNP (NA2HPO4)
Cest la valeur de la concentration non dilue, que lon divise par le temps dincubation.
Nous traons, ensuite, les courbes V= f ([PNPP] (figure 3) pour chaque concentration de
glycrophosphate.
Commentaire :
Sur la figure 3, on observe que la vitesse de raction sans inhibiteur est suprieure ce
avec inhibiteur. Effectivement, pour une mme concentration en substrat (124,9 mole
la vitesse est de 23,74 mole/L/min sans inhibiteur, alors quelle est de 12,5 mole/L/m
avec une concentration en inhibiteur de 0,25mM. Ainsi, on peut dire, que le
glycrophosphate diminue la vitesse dhydrolyse du substrat.
De plus, on remarque, que plus la concentration en inhibiteur est importante, plus la vit
de raction est faible. On voit que pour la mme concentration de substrat que
prcdemment, la vitesse est de 12,5 mole/L/min pour une concentration de
glycrophosphate de 0,25mM, et de 3,73 mole/L/min pour une concentration de 1,25m
Pour conclure, la vitesse de raction est diminue par la prsence dinhibiteur, et dauta
plus que sa concentration est importante.
Commentaire :
Sur la figure 4a, on peut voir que chaque courbe se coupe en un mme point sur laxe des ordo
On a alors une valeur de (1/Vmax) identique pour chacune.
Ainsi, linhibiteur a une influence sur le Km de la raction, mais pas sur la Vitesse maximale. On
donc en dduire, que le glycrophosphate agit comme un inhibiteur comptitif, cest--dire qu
prend la place du substrat naturel de lenzyme. Celle-ci prsente, alors, une plus faible affinit
son substrat (PNPP) : le Km augmente.
Km kcat
E+S ES EP= [ES] + [EI] + [E]
[E]totale
Ki
EI
Vi = = Avec = +1
= = ( . )+
=( . )+
Pour 1/V = 0 on a,
( . )+ =0
=
Ce qui correspond lintersection des droites avec laxe des abscisses.
Kmapp = Km . =
KI =
Pour la srie A : KI =
Reprsentation de Dixon
=( . )+
= . +
=( . [GRO-P]+ ( . + 1))
Commentaire :
Sur la figure 5, on observe que les droites convergent en un seul et mme point de
coordonnes (-Km, 1/Vmax).
Dmonstration : Cf annexes
On peut donc en dduire les paramtres cintiques Km et Vmax.
Km =
Vmax =
VII. Conclusion