Université Hassan II CASABLANCA

Faculté des sciences et techniques de

Mohammedia

Département de génie des procédés Environnement :

Cycle d’ingénieur en génie des procédés et Environnement

Module : Biochimie

Compte rendu du TP

Préparé par :

-OUMAHDI Alae-eddine

- ZOUITINA Chaimae

- MAWADYI Ayamn

Encadré par :

- Prof. AMINE Aziz

-Prof. MOHAMMADI Hasna

Année universitaire : 2022/2023

1
 Liste des figures
Figure 1 : Résultats du test d’identifications des cétoses. ................................... 4
Figure 2 : Les différents Types du lait. ............................................................... 6
Figure 3 : Les différents Types du lait après chauffage et sans filtration. ........... 6
Figure 4 : Réaction de DNS avec les sucres réducteurs...................................... 8
Figure 5 : Mode opératoire de dosage des sucres réducteurs issus de la réaction
enzymatique. .................................................................................................... 10
Figure 6 : Les différents concentrations du Maltose après chauffage. .............. 11
Figure 7 : Principales différences entre une cellule végétale et une cellule
animale (Jesslyn Shields ; 2019)....................................................................... 20
Figure 8 : Récapitulatif du mode opératoire de l'extraction et visualisation de
l'ADN de banane. ............................................................................................. 23

2
TP N°1 : IDENTIFICATIONS DES SUCRES .................................................................................... 4
1. LE BUT ......................................................................................................................................... 4
2. PRINCIPE ...................................................................................................................................... 4
3. REACTIFS ..................................................................................................................................... 4
4. MODE OPERATOIRE ...................................................................................................................... 4
TP N°2 : EVALUATION DU TRAITEMENT THERMIQUE DU LAIT (CRU, PASTEURISE,
ET UHT) DETERMINATION DE LA TENEUR EN LACTULOSE PAR LA METHODE DE
SELIWANOFF....................................................................................................................................... 5
1. Introduction ............................................................................................................................. 5
2. Structure et propriétés physiques ............................................................................................ 5
3. Le but ....................................................................................................................................... 5
4. Principe ................................................................................................................................... 5
5. Mode opératoire ...................................................................................................................... 5
6. Résultats .................................................................................................................................. 6
7. Interprétation........................................................................................................................... 7
TP N°2 : ETUDE CINETIQUE DE L’ENZYME ALPHA AMYLASE CONTENUE DANS LE
MEDICAMENT ''MAXILASE'' ......................................................................................................... 8
1. But de la manipulation......................................................................................................... 8
2. Principe de la manipulation ................................................................................................. 8
3. Matériels utilisés.................................................................................................................. 8
4. Réactifs ................................................................................................................................ 9
5. Procédure ........................................................................................................................... 10
a. Courbe d’étalonnage du maltose (5mM) ....................................................................... 10
b. Détermination de l’activité enzymatique ........................................................................11
c. Etude de concentration de substrat ................................................................................ 12
d. Etude de la concentration d’enzyme.............................................................................. 13
e. Etude du temps de la réaction ........................................................................................ 15
f. Inactivation de l’enzyme (Incubation de l’enzyme à T = 100 °C)................................. 15
TP N°4 : MESURE PLARIMETRIQUE........................................................................................... 16
1. Introduction ............................................................................................................... 16
2. Principe...................................................................................................................... 17
3. But de la manipulation............................................................................................... 17
4. Réactifs ...................................................................................................................... 17
5. Mode opératoire......................................................................................................... 17
6. Résultats : .................................................................................................................. 17
7. Interprétation ............................................................................................................. 18
TP N°5 : EXTRACTION ET VISUALISATION DE L'ADN DE BANANE ................................. 19
1. Généralité sur l’ADN ............................................................................................ 19
2. Principe de la manipulation ................................................................................... 20
3. Manipulation.......................................................................................................... 20
a. Matériels et Réactifs............................................................................................ 20
b. Mode opératoire .................................................................................................. 20
4. IDENTIFICATION DE L'ADN PAR RÉACTION À LA DIPHÉNYLAMINE ... 23
a. Principe de la manipulation............................................................................. 23
b. Manipulation ................................................................................................... 23
c. DOSAGE DE L'ADN PAR RÉACTION À LA DIPHÉNYLAMINE ............ 24
5. Conclusion ............................................................................................................. 26

3
 TP N°1 : Identifications des sucres
1. Le but
Le but de cette manipulation c’est l’identification des cétoses dans des solutions de
monosaccharides et disaccharides.
2. Principe
L’identification s’effectue à l’aide de la solution colorée de Séliwanoff, dont on se retrouve
avec la couleur rouge cerise qui est une caractéristique des cétoses.
3. Réactifs
 Dissoudre 1 g de résorcinol dans un litre d’eau distillée contenant 330 ml d’acide
chlorhydrique concentré (4 M).
 Saccharoses ; Glucoses ; Fructose ; Maltose et Manoses.
4. Mode opératoire
On introduit 1ml de chaque sucre dans les tubes à essai, puis on ajoute1ml de la solution
Séliwanoff. On place les tubes dans un bain-marie à 100°C pendant 5 minutes. Et enfin on
refroidit les tubes sous un courant d’eau froide et on note la coloration obtenue.
Résultats

Fructose
Saccharose

Figure 1 : Résultats du test d’identifications des cétoses.

Donc les résultats présentés dans la figure au-dessus montre que l’apparition de la couler rouge
se fait seulement pour les sucres fructose et saccharose cela vous implique que ce sont des
cétoses par contre les autres sucres ce sont des sucres qui contiennent des fonctions aldéhyde.

4
 TP N°2 : Evaluation du traitement thermique du lait (cru,
pasteurisé, et UHT) Détermination de la teneur en lactulose
par la méthode de Séliwanoff

1. Introduction
La lactulose est un diholoside (sucre) osmotiques non absorbables par l’intestin grêle ; celui-ci
ne peut pas scinder les liaisons galactose-fructose de la lactulose ou les liaisons galactose-
sorbitol du lactitol.

2. Structure et propriétés physiques

La lactulose est un diholoside comprenant un galactose et un fructose liés par une liaison
osidique du type O β (1→4).
Sa formule chimique est C12H22O11 et sa masse molaire 342,30 g/mol.
En solution à 25 °C, la lactulose est sous plusieurs formes tautomères :
61,5% β--pyranose
7,5% α--pyranose
29% β—furanose
1,6% forme linéaire
Le pouvoir sucrant du Lactulose en solution dans l'eau est de 60-70 quand le pouvoir sucrant
du sucrose est de 100%.

3. Le but
La lactulose est l’unique source de fructose dans le lait, sa détermination par la méthode
Séliwanoff s’est révélé une méthode simple et rapide pour distinguer le lait UHT du lait stérilisé
et pour identifier tous les échantillons additionnés de poudre de lait.
4. Principe
La teneur en aldose (lactose) ne varie pas au cours du traitement thermique du lait par contre la
teneur en cétose (lactulose) augmente fortement, cela dû à l’augmentation de la concentration
en lactulose. Alors on peut déterminer la teneur en lactulose pour distinguer entre le lait UHT,
le lait pasteurisé par mesure de l’intensité de la coloration qui est proportionnelle à la teneur en
lactulose.

5. Mode opératoire
Introduire 0.5 ml des différents laits -disposé dans la figure au-dessous dans plusieurs tubes à
essai stériles et y ajouter 2 ml de séliwanoff :
 Placer dans les tubes à essai dans un bain-marie à 100°C pendant 10min ;
 Refroidir et ajouter 2.5 ml d’eau distillée ;
 Filtrer la solution finale tout en éliminant les 0.5 ml premiers pour éliminer les protéines
qui précipitent.
 Mesurer l’absorbance à 482 nm.

5
 Figure 2 : Les différents Types du lait.

Figure 3 : Les différents Types du lait après chauffage et sans filtration.

NB : on doit obligatoirement faire une filtration pour éliminer par précipitation les protéines
qui peuvent par la suite fausser les résultats.

6. Résultats
Le tableau suivant représente les différents types de lait avec les absorbances trouvées :

Lait Absorbance (essai1) Absorbance (essai2)

Lait cru frontal 0.414 0.412
Lait cru 0.315 0.308
Lait pasteurisé JAOUDA 0.593 -
Lait pasteurisé SALIM 0.948 -
Lait UHT SALIM 1.147 -

6
 7. Interprétation

On sait que L'augmentation de l’absorbance est proportionnelle à l'augmentation de la lactulose

dans le lait ce qui explique que ce dernier a subi un traitement thermique fort, et par la suite sa
qualité est réduite. Et avant interpréter nos résultats faut mentionner que dans la littérature le
lait cru est normalement à une concentration en lactulose de 0 mg/l, le lait pasteurisé est d'ordre
50 mg/l cependant le lait UHT a une concentration de 600 mg/l et finalement le stérilisé est le
plus concentré en lactulose, une valeur supérieure à 600 mg/l est définit autant que le lait le plus
moins enrichissant puisque la haute température tue toutes les protéines dedans.
Alors dans notre cas on a obtenue l'absorbance la plus petite pour le lait cru ,ensuite SALIM
pasteurisé, JAOUDA pasteurisé avec une valeur d'absorbance de 0.Et finalement le lait UHT
avec une valeur d'absorbance plus élevé que les trois premiers la chose qui est logique puisque
il contient plus de lactulose et donc c'est celui qui a subi un traitement thermique plus élevé que
les autres, et finalement on a le pasteurisé super lait selon sa valeur d'absorbance il contient une
grande quantité en lactulose parmi tous les échantillon ,même supérieur à l'UHT cela signifie
qu'on est devant un type de lait stérilisé ,mais c'est une résultat un peu choquante puisqu'il est
considéré étant un pasteurisé la chose qui est faite parfois par les associations juste pour attirer
l'attention des client sous prétexte qu'il n'a pas subi un traitement thermique poussé qui va garder
toute sa qualité et sa richesse en protéine .car on a répété les mesures deux fois et toujours il
absorbe le plus .

7
 TP N°2 : Etude cinétique de l’enzyme alpha amylase
contenue dans le médicament ''MAXILASE''

1. But de la manipulation
• Réaction des sucres réducteurs avec l’acide 3,5- dinitrosalicylique ;
• Dosage de l’activité catalytique de l’enzyme alpha amylase du sirop « MAXILASE »
Optimisation des paramètres de la réaction enzymatique ;
• Expression de l’activité enzymatique de L’alpha amylase du sirop « MAXILASE »
en unité Internationale (UI/mL) ;
• Détermination de pourcentage d’inhibition de l’alpha amylase par la cannelle.
2. Principe de la manipulation
• L’enzyme alpha amylase contenue dans le médicament « Maxilase » catalyse la
réaction suivante :

• Le produit de la réaction enzymatique (Maltose) est un sucre réducteur qui peut être
dosé par le réactif 3,5-acide dinitrosalicylique (DNS) à 540 nm.
• La réaction avec le DNS permet de déterminer la teneur en sucres réducteurs libres
présents dans les échantillons à doser.
• Le DNS de couleur jaune, en présence de sucres réducteurs et à chaud, se transforme
en une forme réduite (acide 3-amino-5-nitrosalicylique) d’une couleur rouge orangé
(figure1), dosable par spectrophotométrie à 540 nm.

Figure 4 : Réaction de DNS avec les sucres réducteurs.

3. Matériels utilisés
 Tubes à essai en verre.
 Pipette graduée de 10 mL.
 Pipette graduée de 2mL.
 Pipette graduée de 1 mL.
8
 4. Réactifs
a. Solution de DNS
On mélange 1g d’acide 3,5-dinitrosalicylique,20mLNaOH 2M et 50 mL d’eau distillée. On
ajoute ensuite 30 g de tartrate de sodium et de potassium. Après dissolution, on complète avec
de l’eau distillée jusqu’à 100 mL.
b. Solution d’amidon (Substrat)
Solution mère 2 %(p/v) : 2g d’amidon ont été dissouts, successivement et sous agitation, dans
une solution de NaOH 0.15 M jusqu'à avoir une solution homogène et visqueuse d’amidon.
Cette opération peut durer environ 30 minutes. Le pH a été ajusté à une valeur de 7 avec
quelques microlitres de l’acide acétique concentrée (600µl) et le volume final a été porté à 100
mL. La solution, ainsi préparée, peut se conserver plusieurs jours à 4°C.
Solution fille 1%(p/v) : 50 mL (Solution mère 2%) + 50 mL d’eau distillée.
Solution fille 0.5%(p/v) : 50 mL (Solution fille 1%) + 50 mL d’eau distillée.
Solution fille 0.25% (p/v) : 50 mL (Solution fille 0 .5%) + 50 mL d’eau distillée.
c. Enzyme : alpha amylase
Solution mère (200 UI/mL) : Sirop « Maxilase » acheté de la pharmacie
Une solution mère du sirop « Maxilase » contenant environ 200 UI/mL d’enzyme alpha
amylase, cette activité peut varier en fonction de la température et la durée du stockage.
Solution fille (10UI/mL) : Une solution fille contenant 5 mL de solution mère et 95 mL de
Tampon phosphate pH 7.

d. Tampon phosphate à pH 7 (0.1M)

Préparer une solution de KH2PO4 (0,1M). 6,80g de KH2PO4 dissoute dans 500 mL. Préparer
une solution de Na2HPO4(0,1M). 7,10g de Na2HPO4 dissoute dans 500mL Mélanger les deux
solutions de façon à voir un pH 7.

9
 5. Procédure
Mesure de l’activité enzymatique

Figure 5 : Mode opératoire de dosage des sucres réducteurs issus de la réaction enzymatique.
a. Courbe d’étalonnage du maltose (5mM)

Tube
Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5
témoin
Volume en mL
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2
(maltose (5mM))
Eau distillée (mL) 2 1,6 1,2 0,8 0,4 0
Concentration du
0 1 2 3 4 5
maltose (mM)
DNS (mL) 1 1 1 1 1 1

Chauffer à 100 °C pendant 5 min dans un bain –marie/ Refroidir sous un courant d’eau / Diluer par 10 ml d’eau

Absorbance à 540nm 0,033 0,283 0,432 0,567 0,791 1,012

Soustraction de
0 0,25 0,399 0,534 0,758 0,979
Témoin

10
➢ Résultats :

Figure 6 : Les différents concentrations du Maltose après chauffage.

➢ Courbe d’étalonnage A540 = f(CMaltose)

Courbe d'étalonnage
1,2

0,8 y = 0,1873x + 0,0185

R² = 0,9917
Abs

0,6

0,4

0,2

0
0 1 2 3 4 5 6
Concentration (mM)

Le coefficient d’adsorption K540 :

K540=0,1873
b. Détermination de l’activité enzymatique
Mélanger un volume de 0,4 mL d’eau distillée avec 1mL d tampon contenant l’enzyme
α-amylase et ajouter par la suite 0,6 mL d’amidon (0.5% P/V) puis faire réagir le mélange
pendant 5 minutes à une température ambiante. Ensuite, ajouter 1mL du réactif DNS au
contenu du tube et mettre au bain-marie 5 min à 100 °C. Après refroidissement sous courant
d’eau, diluer le mélange avec 10 mL d’eau distillée.
Effectuer les mesures à 540 nm par un spectrophotomètre UV-visible.

11
 ➢ Résultats :
• L’absorbance à 540 nm de la solution préparée est :
A=0,211
• La concentration du maltose produite durant les 5 min de la réaction enzymatique :
A partir de la courbe d’étalonnage, on a :

A= K540 C
𝐴 0.211
C = K540 =0.1873

C=1,126 mM
• L’activité catalytique de l’enzyme alpha amylase du sirop MAXILASE en unité
internationale (UI/mL) :
Sachant qu’une unité internationale (UI) correspond à 1 μmol du produit formé par minute,
donc :
C=1,126 mmol/l

1,126 ×10−6 ×2
n= 5

n = 4,5 . 10−7 mol/min

n = 0.45 UI/mL
c. Etude de concentration de substrat

Tube témoin Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

Tampon 1 mL 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL
0 0,6 0,6 0,6 0,6
Substrat (Amidon)
0 0,25% 0,5% 1% 2%
Concentration d’amidon
0% 0.15% 0.3% 0 .6% 1.2%
obtenue
Solution enzymatique
1 1 1 1 1
(10UI/mL) +5min
DNS (mL) 1 1 1 1 1

Chauffer à 100 °C pendant 5 min dans un bain –marie/ Refroidir sous un courant d’eau / Diluer par 10 ml
d’eau

Absorbance à 540nm 0,054 0,258 0,363 0,573 1,276

Soustraction de Témoin 0 0,204 0,309 0,519 1,222

12
 ➢ Courbe de A540 = f(CSubstart)

1,4

1,2

0,8
Abs

0,6 y = 59,12x + 0,0074

R² = 0,9889

0,4

0,2

0
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025
Concentration du substrat en (%)

Interprétation :
D’après la courbe Abs=f(CSubstrat), On constate que l’absorbance augmente proportionnellement
avec l’augmentation de la concentration en substrat.
d. Etude de la concentration d’enzyme

Tube Témoin Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

Tampon phosphate 0.4 Ml 0.4 Ml 0.4 Ml 0.4 Ml 0.4 Ml

Amidon (0.5% P/V) 0.6Ml 0.6Ml 0.6Ml 0.6Ml 0.6Ml

Tampon phosphate 1 Ml 0.2 Ml 0.4 Ml 0.6 Ml 0.8 Ml

Solution enzymatique (10UI/Ml)
0 0,8 0,6 0,4 0,2
+5min
DNS (Ml) 1 1 1 1 1
Chauffer à 100 °C pendant 5 min dans un bain-marie/ Refroidir sous un courant d’eau / Diluer par 10 ml
d’eau
0,165 0,244 0,217 0,208 0,19
Absorbance

13
 ➢ Courbe de A540 = f(CEnzyme)

Interprétation :
On constate que lorsque la concentration de l’enzyme augmente, l’absorbance mesurée
augmente.
Et ceci est dû à l’augmentation de la concentration du maltose qui est libérer de plus en présence
d’une concentration élevée de l’enzyme qui favorise la dégradation de l’amidon donc la
production du maltose.

Tube1 Tube 2 Tube 3 Tube 4

Tube T0
(2min) (4min) (6min) (8min)
Tampon 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL

Amidon (0.5% P/V) 0.6 mL 0.6 mL 0.6 mL 0.6 mL 0.6 mL

Solution enzymatique
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
(10UI/mL)
DNS (mL) 1 1 1 1 1
Chauffer à 100 °C pendant 5 min dans un bain-marie/ Refroidir sous un courant d’eau / Diluer par 10
ml d’eau
Absorbance 0,167 0,193 0,169 0,21 0,197

14
 e. Etude du temps de la réaction

Interprétation :
Dans cette partie de manipe c’était le temps de réaction qui était varié n en fixons tous les autres
paramètres, dans le but de voir si en changeant la marge de temps y’auras une différence ou
non.
Les résultats donc peuvent concrétiser que le temps influence, et que l’absorbance est plus
élevée dans le cas où le temps est plus élevé, donc la vitesse de la réaction augmente en agissant
progressivement par rapport au temps.

f. Inactivation de l’enzyme (Incubation de l’enzyme à T = 100 °C)

Mettre 1mL de la solution enzymatique dans un tube à essai et porter le à 100°C pendant 5 min.
Refroidir le tube sous courant d’eau et compléter la réaction enzymatique selon le protocole b.
Mesurez l’absorbance.
• L’absorbance à 540 nm de la solution préparée est :

A=0,161
Interprétation :
La valeur de l’absorbance est diminuée, cela expliqué par le fait que l’enzyme qui accélère la
production du maltose est inactivé, donc son rôle catalytique est perdu.

15
 TP N°4 : Mesure plarimétrique
1. Introduction
Toute molécule qui possède un carbone asymétrique (carbone lié à quatre substituant différents)
est dite chirale. Elle existe alors sous deux configurations symétriques (par rapport a un miroir)
non superposables dites énantiomères qui représentent deux structures isomères réelles dans la
nature. Toute molécule chirale est optiquement active. On dit encore qu’elle possède un pouvoir
rotatoire : traversé par un faisceau de lumière polarisée plane, cette molécule provoque une
rotation du plan de polarisation de cette lumière d’un angle α donné. Le pouvoir rotatoire qui
est une valeur spécifique est calculé comme suit :

▪ La loi de Biot :

𝛼
[𝛼] =
𝐿𝐶
[α] = pouvoir rotatoire spécifique en degrés α = angle de rotation de la lumière polarisée en
degrés
l = longueur du trajet optique (dm)
C = concentration de la solution chorale (g/ml)
La mesure de l’angle de rotation se fait a 20C en utilisant la raie de Na comme source lumineuse.
L’appareil utilisé pour mesurer le pouvoir rotatoire est appelé polarimètre.
Il peut être manuel ou digital mais le principe est le même :
 Une source de lumière qui est ici une lampe de sodium (lumière monochromatique de
longueur d’onde =589.5 nm : raie D)
 Un prisme polariseur
 Un tube polarimétrique qui contient la substance à analyser
 Un second prisme analyseur que l’on tourne en tournant un cercle gradue en degré

16
 2. Principe
On place une solution de (D-glucose+ Enzyme) entre deux polariseurs, (le polariseur et
l'analyseur), ce qui permet de déterminer le pouvoir rotatoire spécifique, et la concentration de
la solution du glucose.

Dans notre cas on : α- D glucose → β-D glucose On Utilise une solution de C=2mg/l d’eau
distillé de α-D glucose et on l’introduit dans le polarimètre pour lire le pouvoir rotatoire de la
solution toutes les 10 minutes, sachant que : [α] (α-D glucose) = +112,2° [α] (β-D glucose) =
+18,7° [α] (α/β -D glucose) = +52,7° Note : On peut voir d’après les valeurs des pouvoir
rotatoire spécifiques, que celui du α-D glucose va diminuer au cours du temps pour tendre vers
celui du β-D glucose afin d’avoir un équilibre.

3. But de la manipulation
Le but de cette manipulation est la détermination de la cinétique de la réaction d’hydrolyse du
glucose en utilisant un polarimètre pour la mesure du pouvoir rotatoire.

4. Réactifs
o D-glucose (2M).
o quelques gouttes d’Enzyme invertase.

5. Mode opératoire
L’hydrolyse du saccharose (2M) peut être réalisée par ajout de quelques unités d’enzyme
invertase ou bien de quelques gouttes d’acide concentré. On effectue la lecture du pouvoir
rotatoire toute les 5 minutes.

6. Résultats :
Le tableau suivant résume les résultats obtenus
Pouvoir rotatoire t(min)
38,035 0
37,96 5
34,185 10
30,16 15
26,24 20
25,82 25
24,91 30
24,37 35
23,46 40
22,99 45
22,06 50
21,429 55
21,02 60

17
 Pouvoir rotatoir
40

35

30
Pourvoir rotatoir en degré

25

20
Pouvoir rotatoir
15 Linéaire (Pouvoir rotatoir )

y = -0,2877x + 35,756
10
R² = 0,8628
5

0
0 10 20 30 40 50 60 70
temps en min

7. Interprétation
D’après la courbe ci-dessus, on peut remarquer que le pouvoir rotatoire du glucose diminue
d’une manière faible à cause de sa concentration (1M) aussi à cause de volume d’enzyme ajouté
(quelques gouttes), et pour le temps 1/2 le temps équivalent à un taux de rotation (isomérisation)
ou la moitié d'échantillon a transformé du alpha glucose en beta glucose. On a l'équation de
régression est : y = -0,2877x + 35,756donc x pour (y=la moitié des angles ) X=(Y-35,756)/(-
0,2877)avec: Y=30,035et donc X= 19,88. Et par cela on peut dire que le T1/2 = 19,88min .

18
 TP N°5 : EXTRACTION ET VISUALISATION DE L'ADN
DE BANANE
La manipulation suivante est un exemple de technique d'extraction et d'isolement de l'acide
désoxyribonucléique (ADN) des cellules ou des tissus des fruits du bananier (bananes). Le
choix de la banane comme matériel végétal est fait en raison de la richesse de ses cellules en
ADN.

1. Généralité sur l’ADN

Les molécules d'acide désoxyribonucléique (ADN) sont les plus grosses molécules du monde
vivant et sont présentent dans tous les organismes. Elles sont le support de l'information
génétique et de sa transmission au cours des générations successives.

L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'acide désoxyribonucléique des
cellules ou des tissus. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des fins différentes
comme la mise en évidence de la présence d'agents pathogènes dans l'eau ou l'identification
d'organismes génétiquement modifiés (OGM) dans certaines matrices alimentaires.

19
 2. Principe de la manipulation
Le principe général de l'extraction de l'ADN repose ici sur quatre étapes majeures : 1 – La
destruction mécanique des parois rigides qui entoure les cellules végétales. 2 – La dissociation
des membranes cellulaires et nucléaires par le biais d'un détergent. 3 – La séparation de l'ADN
des autres constituants cellulaires par le biais d'une filtration. 4 – Le relargage de l'ADN extrait.

Figure 7 : Principales différences entre une cellule végétale et une cellule animale (Jesslyn
Shields ; 2019).

3. Manipulation
a. Matériels et Réactifs
Une banane – sachets en plastique à fermeture zip – solution de Chlorure de sodium (NaCl) –
solution de Dodécylsulfate de sodium (SDS) – filtres à café – entonnoir – deux tubes à essais –
solution froide d'éthanol à 90° – spatule de laboratoire.
b. Mode opératoire
1 – Pèse d'environ 20 g de banane et broyage mécanique jusqu'à obtenir une soupe de banane.
▪ La force mécanique exercée va permettre une destruction des parois
pectocellulosiques rigides qui entoure les cellules végétales de la banane.

20
 2 – L'ajout de 2,5 mL de la solution Dodécylsulfate de sodium - Chlorure de sodium à la
soupe de banane dans le sachet et mélanger pendant un temps d'environ 120 secondes.
▪ Le Dodécylsulfate de sodium est un détergent et tensioactif ionique fort. Il va
permettre de dissocier les membranes cellulaires et nucléaires de natures
phospholipidiques. Elles sont attaquées de la même façon que le liquide vaisselle
attaque les graisses. Le dodécylsulfate de sodium permet également de débarrasser
une partie des protéines liées à l'ADN. Le Chlorure de sodium va permettre une
neutralisation des charges négatives portées par les groupements phosphates de
l'ADN. La neutralisation des charges négatives va permettre d'éliminer les
molécules d'eau qui entourent l'ADN et ainsi sont relargage dans la solution
d'éthanol.

21
3 – La filtration du contenu du sachet dans un tube à essai par le biais d'un filtre à café.
▪ La filtration va permettre une séparation de l'ADN des autres constituants et débris
cellulaires.

4 – L'ajout d'un volume d'éthanol deux fois celui du filtrat. L'ADN va être relargué dans la
solution froide d'éthanol sous forme d'un enchevêtrement de filaments blancs translucides. Les
filaments blancs translucides obtenues est ce qu'on appelle une méduse ou pelote d'ADN.
▪ La solution froide d'éthanol doit être versée délicatement le long de la paroi du tube
à essai. Les deux liquides eau et éthanol vont former deux phases distinctes.

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 Figure 8 : Récapitulatif du mode opératoire de l'extraction et visualisation de l'ADN de
banane.

4. IDENTIFICATION DE L'ADN PAR RÉACTION À LA

DIPHÉNYLAMINE
a. Principe de la manipulation
L'identification de l'ADN à la diphénylamine est basée sur une réaction spécifique de la
diphénylamine avec la ω-hydroxylevulinyl aldehyde. Le 2-désoxyribose des nucléotides
puriques en milieu acide à chaud se transforme en ω-hydroxylevulinyl aldehyde. Le ω-
hydroxylevulinyl aldehyde réagit spécifiquement avec la diphénylamine et forme un composé
bleu dont le maximum d'absorption se situe à 650 nm. Le 2-désoxyribose des nucléotides
puriques est le seul qui réagit avec la diphénylamine après transformation en ω-
hydroxylevulinyl aldehyde, ainsi la valeur obtenue représente approximativement la moitié du
désoxyribose total présent dans la solution
b. Manipulation
 Matériels et Réactifs :
Tubes à essais. Pipettes. Spatule. Bain-marie. Échantillon d'ADN extrait. Tampon Citrate.
Réactif à la diphénylamine. HCl.
 Mode opératoire :
1. Dissoudre l'ADN extrait dans un tube à essais avec 1 mL de la solution de tampon citrate.
Prendre un 2 ème tube à essais avec 1 mL de la solution de tampon citrate ; il servira de témoin
négatif.
2. Ajouter exactement 2.5 mL de réactif à la diphénylamine dans les deux tubes à essais suivi
de 1 mL de l'acide chlorhydrique (HCl) concentré et bien mélanger. 3. Placer dans un bain marie
pendant 5 minutes et observer s’il y a une coloration bleue qui témoigne de la présence d'ADN
dans la solution

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 c. DOSAGE DE L'ADN PAR RÉACTION À LA DIPHÉNYLAMINE
Le tableau ci-dessous représente les valeurs d'absorbance obtenues pour une série de dilutions
d'une solution standard d'ADN après réaction à la diphénylamine.
Tube blanc 1 2 3 4 5 6
Concentration 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1
standard
d'ADN
(µg/mL)
Réactif de 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
diphenylamine
(mL)
Absorbance à 0 0.06 0.12 0.23 0.36 0.48 0.59
650 nm

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Les valeurs d'absorbance sont ensuite utilisées pour tracer la courbe de calibration qui permet
d'estimer la concentration approximative d'ADN dans des échantillons de banane inconnus en
se reportant aux valeurs de leur absorbance

l'Absorbance en fonction la Concentration standard d'ADN

0,7
y = 0,5939x - 0,0001
0,6 R² = 0,9996

0,5

0,4
A

0,3

0,2

0,1

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
-0,1
c

▪ Pour notre échantillon :

Tube blanc 1 2 3 4 5 6
Concentration 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1
standard
d'ADN
(µg/mL)
Réactif de 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
diphenylamine
(mL)
Absorbance à 0.019 0.123 0.127 0.133 0.151 0.472 0.493
650 nm

l'Absorbance en fonction la Concentration

0,6
y = 0,4537x + 0,0159
0,5 R² = 0,8256

0,4
A

0,3

0,2

0,1

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
c

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 5. Conclusion
Les valeurs expérimentales qu’on a trouvées d’absorbance sont différentes a celle de solution
standard d’ADN, ce qui est dû aux erreurs de manipulation.
Pour notre échantillon à une longueur d'onde de 650 nm on a trouvé une absorbance de :
A=2,767.
Donc la concentration de l’ADN Pour notre échantillon :
C=6,063 µg/ml
Pour la solution standard de l’ADN :
C =4,659 µg/ml

▪ Pour notre échantillon à une longueur d'onde de 650 nm et en comparent au ADN standard
on a trouvé, que notre échantillon est un peu moins élevé.

▪ Après tout ce qui a été avancé si haut, Nous avons réussie à atteindre le but de cette
manipulation à savoir l’extraction de l’ADN et le visualiser. Cette réalisation était grâce à
la méthode d’extraction liquide-liquide Cette technique qui nous a permis d’extraire la
substance ADN dissoute dans le liquide que nous avions, à l’aide d’utilisation d’un autre
liquide ou Les deux liquides ne doivent pas être miscibles.

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