Service de Biochimie

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Dosage de l’Amylase

Dr I FAID

PLAN

Introduction

Physiologie et Biochimie

Intérêt Clinique

Méthode de détermination de l’activité de l’α Amylase

Méthode de référence

Matériel de référence

Détermination des isoenzymes

Conditions préanalytiques

Interférence

Intervalle de référence

Interprétation

Annexe
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Introduction :

α-Amylase (EC 3.2.1.1) et la lipase (EC 3.1.1.3) sont deux enzymes digestives qui
sont principalement mesurée dans le plasma pour l’investigation de pathologie
inflammatoires du pancréas exocrine

et de nos jour α-Amylase (type P) est de plus en plus utilisé.

Physiologie et Biochimie :

α-Amylase (EC 3.2.1.1)

EC : Enzyme Commission
fait partie de la classe des Hydrolase
Catalyse la dégradation de l’Amidon (Amylose et Amylopectine), et du Glycogène
1,4-α-D glucan glucanohydrolase ; AMY
α-Amylase catalyse l’hydrolyse (Juste) la liaison α 1-4
n’attaque pas les liaison α 1-6 au points de branchement
Coupe les liaison hémiacetal (–C-O-C-)

Quelques point important :

POLYSACCHARIDE (Glycan) HOMOGENE ramifié ou non ramifié

Amylose longue chaine de Glucose non ramifié relié par des liaison glycosidique α 1-4
Amylopectine idem + ramification α 1-6
Glycogène similaire à l’Amylopectine avec + de ramification

Endohydrolase (coupe à l’intérieur de polysaccharides composés d’α-D-glucose)

produit du Glucose ; Maltose, et des dextrins (chaine intermédiaire avec des

liaison α 1-6)

Joue un rôle essentiel dans la digestion des glucides

Les polysaccharides de structures (ex : cellulose) ne sont pas dégradé par α-

Amylase

Metalloenzyme à Ca+
Les ions Calcium sont essentiel pour l’intégrité fonctionnel de l’enzyme
Toute fois elle requiert la présence d’anion monovalent pour son activation avec les
ions chlorure et bromure comme principaux activateur

L’ion chlorure se combine avec des charges + dans l’enzyme, qui va changer la
constante d’ionisation d’important groupe catalyseur.

AMY dans le sérum humain à un pH optimum entre 6,9 et 7

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Amylase plasmatique est la plus petite enzyme 54 à 62 kDA, filtré par le Glomérule
rénale et c’est la seule enzyme retrouvée dans les urine

Amy est présente dans certain organe et tissue, la plus grande concentration sont
retrouvé dans la glande salivaire (type S) et le pancréas (Acinus) Type P, Moins de
concentration sont trouvé dans le sperme, testicules, ovaires, trompes de Fallope,
le muscle squelettique, l’intestin grêle, poumon, et tissu adipeux. Présente aussi
dans les larmes, et le lait.

Majeur source de l’Amylase du sérum ou urine normal :

Pancreas (Acinus) (Type P)
Glande Salivaires (Type S)

Chez les adultes en bonne santé, le P-AMY représente environ 40 à 50% de l'activité
AMY totale dans le sérum.

L’isoamylase P et isoamylase S produit par deux loci (différents) étroitement lié situé
dans le chromosome 1 et peuvent présenter une certaine variabilité phénotypique.

Ces isoenzyme peuvent subirent des modification post traductionnelles

(désamination, glycosylations, et déglycosylations), conduisant à la formation de
nombreux isoformes.

Détermination de ces isoformes se fait Par Electrophorèse, Focalisation

isoélectrique, Chromatographie

Intérêt Clinique :

Dosage dans le plasma pour le diagnostic de la pancréatite aigue

Non spécifique, cependant le degrés d’élévation à un intérêt diagnostic
Associé à d’autre Test : Amylasurie, clearance de l’amylase, isoenzyme d’amylase,
et lipase plasmatique, ↑ la spécificité clinique pour le Dg de la Panc aigue
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Méthode de détermination de l’activité de l’α Amylase :

Méthodologie : 3 Approches ou catégorie :

Amyloclastique : mesure la disparition du substrat

Saccharogenique : mesure l’apparence du produit

Chromolytique : mesure la croissance de libération d’un chromogène soit lié à un

produit de réaction (1ére génération) soit libre (2éme génération)

1- Amyloclastique :

Principe : mesure du taux d’hydrolyse du substrat par l’amylase ; détectée par

turbidimétrie, néphélométrie, et iodométrie.

Turbidimétrie : Diminution de la turbidité de la solution de substrat par dégradation

enzymatique du substrat en plus petite unité.

Néphélométrie : mesure la croissance de la diffusion de la lumière due à l’hydrolyse

du substrat par l’amylase

Plus récemment, l’utilisation de la néphélométrie laser à montrer une

amélioration de la sensibilité et la précision analytique comparée à la néphélométrie
classique

Ces deux méthodes sont effectuées en mode cinétique ou après un intervalle de

temps fixe, le changement dans la turbidité ou la diffusion de la lumière est
proportionnelles à l’activité enzymatique

Iodométrie : basé sur la capacité de l’Iode à former un complexe Amidon-Iode

caractéristique de couleur bleu vive. Les produits de l'action de l'amylase peuvent
également former des substances colorées avec de l'iode, mais leurs maxima
d'absorbance sont à des longueurs d'onde différentes du complexe amidon-iode. Les
procédés sont réalisés en ajoutant du réactif contenant de l’iode au mélange
substrat-échantillon après une période d'incubation fixe (Approche la plus courante
intervalle de temps fixes). La diminution de l’absorbance est (mesurée par
spectrophotométrie la différence d’A à 660 nm entre le blanc et l’échantillon) est
proportionnelles à l’activité AMY Plus la quantité d'activité amylase est importante,
plus la couleur de la solution finale sera plus légère.

NB : Les méthodes amyloclastiques ne sont plus employées, en partie parce que la

variabilité du substrat rend la normalisation difficile.

Voir Annexe Méthode 1

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2- Saccharogénique :

Principe : mesure des monosaccharides ou disaccharides (propriété réductrice)

libérés par la réaction de l'amylase avec le substrat. L'échantillon et le substrat sont
incubés pendant 30 minutes, puis on mesure les substances réductrices pour un Blanc
(sérum) et l'échantillon. La quantité de substance réductrice produite est
directement proportionnelle à l’activité de l’AMY

La méthode saccharogénique, la méthode de référence classique reporté en unité de

Somogyi (1960). Unité de Somogyi c’est l’expression du nombre de mg de Glucose
libéré en 30 minute à 37 °C dans conditions spécifiques

Plus récemment (1980), l'approche saccharogènique a été modifiée pour une analyse
cinétique automatisée avec de substrat bien définie (petit oligosacharides). Dans ces
techniques, le maltose libéré par l'amylase à partir de substrat, tel que le
maltopentaose et la maltotetraose, est converti en glucose par une enzyme (incluse
dans le mélange réactif). Le glucose peut être mesuré par plusieurs techniques
enzymatiques –de dosage du glucose-
Voir Annexe Méthode 2
Les petits substrats oligosaccharidiques donnent des produits mieux définis que
l’amidon. Le maltopentaose et le maltotetraose ont montré une bonne stabilité, des
produits d'hydrolyse cohérents et une stoechiométrie de réaction sans ambiguïté.

Avantage :
Fiable
Substrats synthétiques définis avec les procédés enzymatiques

Inconvenant :
Prennent du temps
Substrat variable (ancienne méthode)
Nécessité de correction pour la quantité de glucose initialement dans l'échantillon.
On peut le faire en consommant tout le glucose dans l'échantillon du patient avant d'effectuer
l'analyse complète ou en utilisant un blanc de sérum.
DO du blanc sérum élevée (mesures spectrophotométriques difficiles
Réactifs très complexes et donc assez onéreux.
Nombreuses réactions enzymatiques couplées (perdre d’efficacité)
Ils ont rarement une cinétique vraie, d'ordre zéro.
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3- Chromolytique :

Chromolytique (1ére Gen)

Principe :
Les procédés chromogènes utilisent un substrat d'amidon auquel un chromogène a
été attaché, formant un complexe insoluble de chromogène-substrat. AMY hydrolyse
le substrat, en des fragments de polysaccharide-chromogène plus petits, solubles
dans l'eau. L'augmentation de l'intensité de couleur de la solution de colorant-
substrat soluble est proportionnelle à l'activité AMY.

Les procédés à film sec sont basés sur l'hydrolyse d’un complexe chromogène-Amidon
(insoluble). Les saccharides-chromogène plus petit libérés dans la couche
d'étalement diffusent dans une couche de réactif sous-jacente, où ils sont mesurés
par spectrophotométrie de réflectance. Le substrat d'amidon-chromogène n'ayant
pas réagi présent dans une couche d'étalement ne sont pas mesurée

Chromolytique (2éme Gen)

Historiquement, les méthodes saccharogénique, amyloclastique et chromolytique

(utilisant l’amidon comme substrat) ont été les dosages de choix pour la
détermination de l'activité AMY. Ces dosages ont été complètement remplacée avec
des méthodes utilisant des substrats bien définis (petit oligosaccharide). L'utilisation
de substrats AMY définis et d'enzymes auxiliaires et indicatrices dans le dosage AMY
a amélioré la stoechiométrie de la réaction et a conduit à des conditions d'hydrolyse
plus contrôlées et plus cohérentes.
Substrat utilisé inclue les petite oligosaccharides (méthode saccharogénique) ou des
oligosaccharides couplés à un chromogène (NP, ou CNP) (méthode chromolytique)

Avantage :
Rapides, précises, cohérentes et faciles à réaliser.
Plus sensibles que les procédés saccharogèniques (plus grande absorptivité molaire)

Méthode utilisant comme chromogène : nitrophénol

Méthode utilisant comme chromogène : 2-chloro-4-nitrophénol

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Méthode utilisant comme chromogène : nitrophénol

Les substrats 4-NP-glycoside sont préparés en liant le 4-NP à l'extrémité réductrice

d'un oligosaccharide défini. Si l'oligosaccharide est le maltoheptaose (G7), le substrat
est alors le 4-NPG7. AMY hydrolyse ce substrat pour produire des oligosaccharides
libres (G5, G4 et G3) et 4-NP-G2 (9%), 4-NP-G3 (31%) et 4-NP-G4 (60%).
Le P-AMY hydrolyse le substrat à une vitesse supérieure à celle du S-AMY dans le
rapport 1,8 : 1.
Le G6, G1, 4-NP-G6 et 4-NP-G5 ne sont pas produits en quantités appréciables.

Dans la technique original, le résultat de l'hydrolyse combinée par AMY et une α-

glucosidase (réactif) (EC 3.2.1.20 ; maltase) est que plus de 30% du produit est NP
libre. La NP libre est détectée par son absorbance à 405 nm. L'α-glucosidase ne réagit
pas avec un oligosaccharide contenant plus de quatre molécules de glucose dans la
chaîne ; en plus le G4 ne s'hydrolyse que très lentement. Des problèmes se posent
avec l'utilisation du 4-NP-glycoside en ce qui concerne la mauvaise stabilité du
mélange d'essai reconstitué, en raison d'une hydrolyse lente du 4-NP-glycoside par
l'α-glucosidase.

Cet effet a été réduit par liaison covalente d'un groupe "protecteur" (c'est-à-dire un
groupe 4,6-éthylidène) [ethylidene-protected substrate (EPS)] à l'extrémité non
réductrice de la molécule. [Le glucose terminal du substrat est bloqué chimiquement
pour empêcher son hydrolyse par les enzymes servant d’indicateur] Le substrat
présente également un motif d'hydrolyse différent et plus avantageux. Ainsi, le
substrat d'éthylidène-4-NP-G7 se fragmente approximativement en 4-NP-G2 (40%),
4-NP-G3 (40%) et 4-NP-G4 (20%). Par conséquent, la libération de 4-NP est
augmentée ;

Des nouvelles α-glucosidase sont également disponible [enzyme recombinante :

AGH-211 ; G3651(Bacillus stearothermophilus)] qui hydrolyse complètement les
substrats.

La réaction est contrôlée par mesure du p-nitrophénol libéré à 405 nm en

cinétique

Domaine de mesure : 0 à 1500 U/l (ADVIA)

Avantage :
Celle des méthodes chromolytique de 2ém Gén
actif avec les deux isoenzymes salivaires et pancréatiques de manière égale
Cette méthode n'a montré aucune interférence par l'hémoglobine, la lipémie ou le
glucose.
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Méthode utilisant comme chromogène : 2-chloro-4-nitrophénol

Principe : l’AMY catalyse l’hydrolyse d’un subtrat de synthèse defini ; le 2-chloro-

p-nitrophényl-α-D-maltotrioside (CNP-G3) pour produire du 2-chloro-4-nitrophénol,
du 2-chloro-p-nitrophényl-α-D-maltoside (CNP-G2), du maltotriose (G3) et du
glucose.
Après une incubation à 70 secondes à 37°C, l’absorbance due à la formation du CNP
est mesurée en cinétique à 405nm

α-Amylase
CNP-G3 CNP + CNP-G2 + maltoriose + glucose

Domaine de mesure analytique (AMR) : 0-650 U/L (Dimension)

Avantage :
Celle des méthodes chromolytique de 2ém Gén
Dosage "direct" (ne necessite pas de glucosidases)

Inconvénient :
Ont été indiqués comme incluant son faible taux de conversion de substrat par
rapport aux essais G4, G5 et G7;
La variation de l'absorptivité molaire de CNP est associée à des changements de pH,
de température et de teneur en protéines ;

La présence de l'activateur, le thiocyanate de potassium, provoque des modifications

allostériques de l'AMY empêchant l'utilisation d'anticorps pour la détermination du P-
AMY.

Méthode de référence :

Une procédure de référence primaire pour la mesure de l'amylase à 37 °C a été

optimisé par la Division scientifique de l'IFCC, Committee on Reference Systems for
Enzymes (C-RSE) en utilisant une technique chromolytique avec comme substrat le
4,6-ethylidene(G1)-p-nitrophenyl(G7)-α-D-maltoheptaoside (EPS).

Le principe réactionnel de la procédure de référence primaires IFCC 37 °C pour la

mesure de l’activité de l’AMY dans le plasma est le suivant (Schumann et al.,2006):

α-Amylase
EPS + H2O 4,6-Ethylidene-Gx + 4-Nitrophenyl-G(7–x)

α-Glucosidase
4-Nitrophenyl-G (7–x) + (7–x)H2O (7–x) Glucose + 4-Nitrophenoxide

La réaction se déroule à pH 7 en présence d’ions chlorure (activateur de l’amylase)

et l’activité cinétique est mesurée en cinétique par le suivi de l’augmentation
d’absorbance à 405 nm
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Matériel de référence :
α Amylase pancréatique humaine purifiée (IRMM/IFCC-450) Institute for
Reference material and measurement (bureau communautaire de
référence)

Méthode utilisé par les automates du service de biochimie de l’EHU

d’Oran :

Automate Méthode Domaine de Commentaires

mesure
ADVIA 1800 EPS PNPG7 0 à 1500 U/l Corrélée à la
(Jensen et Wydeveld) méthode IFCC
Immunoinhibition 0 à 1500 U/l Amylase pancréatique
+ EPS PNPG7
Dimension CNPG3 0 à 650 U/l

Détermination des isoenzymes :

Basé sur l’électrophorèse, la Chromatographie par échange d'ions, la focalisation

isoélectrique, l'inhibition sélective du S-AMY par un extrait de germe de blé (Triticum
aestivum), l'immunoprécipitation par un anticorps monoclonal et l'immuno-
inhibition.
Cependant, seules les méthodes basées sur l'inhibition sélective de l'isoenzyme par
des anticorps monoclonaux ont montré une précision, une fiabilité, une praticabilité
et une vitesse d'analyse suffisantes pour permettre l'introduction de la détermination
de P-AMY dans la pratique clinique.

Immun-inhibition
L’activité S-AMY est inhibée par l'addition d'anticorps, l'activité P-AMY non inhibée
est mesurée en utilisant EPS-4- NP-G7 comme substrat.

Domaine de mesure : De 0 à 1500 U/l

Avantage :
Plus spécifique
Disponible en automatisation
Coûts de réactifs semblables à l'AMY totale

Ceci permet aux laboratoires d'abandonner ce dernier

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Electrophorèse :

On retrouve deux bande majeur (on peut trouver 4 band)

Corresponde à deux type : Type S (Salivaire), et Type P (Pancreatique)

Type S origine Salivaire, trompes de Fallope, Poumon (S1 S2 S3)

Migre le plu rapidement
= 2/3 de l’amylase plasmatique

Type P origine pancréatique (P1 P2 P3)

Migre moins rapidement

Le plus commun observé les fraction P2 S1 et S2

Lors de l'électrophorèse, le macro-AMY forme habituellement une large bande

migrante, nettement différente des bandes homogènes produites par les
isoenzymes AMY présentes dans le sérum

Si la séparation électrophorétique n'est pas disponible, la précipitation du

macrocomplexe par une solution de PEG 6000 (240 g/L) représente une bonne
alternative. L'activité AMY résiduelle de moins de 30% dans le surnageant est
indicative de la macroamylasémie.

Condition préanalytique :

Sang : sur tube sec (Sérum) ou tube hépariné (Plasma)

Les anticoagulant chélateurs (Citrate, EDTA, oxalate) inhibe l’activité AMY (Chélate
le Ca2+)

Conservation : AMY est assez stable

4 jour à température ambiante
2 semaine à – 4 °C
1 année à -25 °C
5 année à -75 °C

L’amylase ↑ de 6% entre la position couché et position debout

Tend à être plus élevée chez les noirs que les blancs

Urine : de 24 heure, ou Aléatoire ;

Conservation :
Sans conservateur
doivent être analysés dans les 12 heures à température ambiante
ou dans les 5 jours à 5 ° C,
NB : l’amylase urinaire est instable dans les urines acides, il faut ajuster le pH à 7
avant de réfrigérer.
L’urine ne doit pas être congelé
NB : il faut ajouter de l’albumine à tous les échantillons d’urines à fin de
maximisé l’activité de l’AMY (Conc final d’ALB dans l’urine doit être ≤ 30g/L)
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Interférence :

Ne sont généralement pas sujettes à l'interférence de l'hémoglobine, de la

bilirubine ou des triglycérides.

Intervalle de référence :
Plus de 5 ans
Amylase totale 31- 107 U/L (IFCC 37°C)
Amylase Panc 13 – 53 U/L (immunoinhibition + IFCC à 37 ° C)

Urine : ≤ 650 U/l (ADVIA)

Interprétation :

Variation physiologique :

L'activité de l'amylase du sang des nouveau-nés est d'environ 18% des adultes.
L'activité moyenne de l'amylase sérique augmente depuis la période néonatale
jusqu'à l'âge de 3 à 4 ans environ (reflétant le développement de la fonction
pancréatique exocrine)
En conséquence, l'utilisation de cette enzyme pour le diagnostic de pancréatite aiguë
chez les jeunes enfants doit être évitée et le test doit être remplacé par la mesure
de la lipase.
Il n'y a pas de différences significatives entre les mâles et les femelles dans l'activité
sérique de l'amylase

Variation pathologique :

Activité AMY physiologique au niveau du plasma est faible et constante.

Elle augmente considérablement dans la pancréatite aigue et l’inflammation de la
glande salivaire

Evolution de l’activité AMY au cour d’une pancréatite aigue

↑ Activité AMY après 5 à 8 heure du début des symptômes, retourne à la normale au
3éme ou 4éme jour avec maximum au bout de 12 à 72 heures. L’élévation de 4 à 6
fois la limite supérieure de référence est courante.
La magnitude de l’élévation de l’activité AMY n’est pas relié à la sévérité,
cependant, une élévation importante augmente la probabilité d’une pancréatite
aigue

↑ de l’activité AMY est reflété par ↑ Activité AMY urinaire

En comparaison avec AMY plasmatique, AMY urinaire atteint des concentrations plus
élevée et persiste pour une plus longue période (intérêt sensibilité de diagnostic dans
les phase tardives)
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La spécificité clinique de l’AMY pour le Dg de la Panc aigue est très faible (20 à 60
%) = intérêt de la mesure direct de la AMY (Type P) ; Si on applique un seuil de 3 fois
la limite supérieure de référence = la spécificité clinique du diag de la panc aigue
est supérieur) 90 % ; ↑ Sensibilité de détection (dans les phase tardives)

Dans les causes intra-abdominal autre qu’une pancréatite : comme les maladies des
voies biliaires (Ex : Cholécystites) l’activité AMY s’élevé de 4 fois la LNS

Dans IR, Activité AMY s’élève, l’élévation est proportionnelle au degrés l’altération
rénale (usuellement pas plus de 5 fois la limite supérieur normale)

Tumeur épithélial du poumon et des ovaires peut aussi contenir une activité AMY
considérable de Type S, Activité AMY est 50 fois plus élevé que la LSN
Des cas de myélome multiple produisant de l'AMY ont été décrits

Liquide d’Ascite et le liquide pleurale peuvent contenir de l’AMY résultant d’une

tumeur ou d’une pancréatite

L’élévation de l’AMY en cas Rupture de grossesse ectopique, cepandant l’isoenzyme

n’est pas bien caractérisé

Dans 1 % de la population, une macroamylose est présente dans le plasma et peut

causer une hyperamylasemie asymptomatique.
Macroamylasémie : Combinaison de l’amylase avec des IgG ou IgA : formation d’un
complexe non filtré par le Glomérule (grande taille) ; ↑ amylase plasmatique 2 à 8
fois la LSN avec ↓ de la clearance de l’Amylase et ↓ de l’amylasurie

Une diminution de la AMY de type P est très spécifique de l’insuffisance du pancreas

exocrine, cependant si la AMY P est normale, on ne doit pas exclure une IPE.

Les individus avec une déficience isolée en P-AMY (rare), ont une maldigeston des
glucides avec comme conséquence une distension abdominale, des flatulences, selles
molles, et un faible gain de poids
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Annexe :

Méthode 1: Amyloclastique:

A.Turbidimétrie ou néphélométrie : La diminution de la turbidité ou de la

lumière diffuse (néphélométrie) d'une solution d'amidon est proportionnelle à la
concentration en amylase.
B. Iodométrie : La dégradation de l'amidon par l'amylase réduit la réaction de
l'iode avec l’amidon ; la réduction du complexe amidon-iode (Amax = 660 nm) est
inversement proportionnelle à l'activité de l'amylase.

Commentaires :
A. Rare; Avec un substrat cohérent, technique automatisée acceptable
B. Rare; Peut être facilement adapté par la plupart des laboratoires

Methode 2: methode Saccharogénique

Glucose libéré à partir du substrate est quantifié, généralement par par une
procedure enzymatique

a. substrat = Maltopentaose:
Amylase
maltopentaose -------------------------------------> maltotriose + maltose
α-Glucosidase
maltotriose + maltose ------------------------------> 5 glucose
Hexokinase
glucose + ATP --------------------------------------> glucose-6-phosphate + ADP
Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase
+ +
glucose-6-phosphate + NAD --------------------> 6-phosphogluconate + NADH + H

b. substrat = Maltotetraose:
Amylase
maltotetraose + H2O ------------------------------> 2 maltose
Maltose phosphorylase
maltose + phosphate ------------------------------> glucose + glucose-1-phosphate
β-phosphoglucomutase
glucose-1-phosphate ------------------------------> glucose-6-phosphate
Glucose-6-phosphate dehydrogenase
+ +
glucose-6-phosphate NAD ---------------------> 6-phosphogluconate + NADH + H

Commentaire :
Commun ; Peut être facilement adapté à de nombreux analyseurs discrets
automatisés
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Methode 3: Chromolytique

a. Liberation of a dye coupled to a polysaccharide to dyed saccharide

Amylase
dyed polysaccharide -------------------> dyed saccharides

b. Libération d’un chromogène à partir d’un substrat définie (4,6-ethylidene-

G7PNP)
Amylase
4,6-ethylidene-G7PNP + H2O -----------------> 4,6-ethylidene-Gx + G(7−x) PNP
Glycosidase
G(7−x) PNP + (7−x) H O ----------------------> (7−x) glucose + PNP
2

4,6-ethylidene-G7PNP = 4,6-ethylidene(G1)-p-nitrophenyl(G7)-α-D-maltoheptaoside;
PNP = p-nitrophenol

c. Libération d’un chromogène à partir d’un substrat définie (CNP-G3)

Amylase
CNP-G3 --------------> CNP + CNP-G2 + maltotriose + glucose
Where CNP-G3 is 2-chloro-p-nitrophenyl α-D-maltotrioside

Commentaire :
a. Commun
b. Commun ; méthodes recommandé par IFCC
c. Commun