Les Travaux Pratiques à l’Université Oran1-Ahmed Ben Bella

Fiches Techniques

Faculté de Médecine
Département de Médecine
Service Biochimie

Deuxième Année médecine

Elaborée par : Pr SAADI –OUSLIM AMAL SOULEF (MCA EN BIOCHIMIE)

 Fiche technique de travaux pratiques de Biochimie

T.P. N°01

 Intitulé : Les prélèvements

 Nombre de postes : 30

 But de la manipulation :
Les examens biochimiques et de biologie moléculaire peuvent être effectués sur un matériel
constitué soit:
- Par des prélèvements de liquides
biologiques (sang, urine, LCR….)
- par des prélèvements tissulaires (foie,
muscle, trophoblastes…)

Nous nous intéressons

particulièrement aux prélèvements qui relèvent de la biologie humaine.
I- Les prélèvements sanguins : Ils sont effectués en tube avec anticoagulant ou sans anticoagulant
1- Modes de prélèvement :

- Sang veineux
- Sang capillaire
- Sang artériel

2- Sérum: En absence
d’anticoagulant, le sang se coagule en qq min, Il ne contient pas de fibrinogène, il est
séparé du caillot par centrifugation.
Inconvénients: Temps de contact +/- long avec les éléments figurés(risque d’hémolyse)
L’existence de tubes activateurs de la coagulation (vacutainer) (existence de film de silice activateur de la coagulation sur
les parois et au fond)
3- Plasma: Obtenu a partir de sang recueilli sur un anticoagulant puis centrifugé

Avantages: Manipulation plus aisée et le risque d’hémolyse est réduit.

Inconvénient: L’apport d’une substance exogène
anticoagulante peut affecter certains types de dosages
4- Le sang total: Il peut être utilisé si la
concentration du produit à doser est à peu
près la même dans le plasma et les
érythrocytes, Ceci est approximativement
vrai pour l’urée et le glucose.

Le plasma contient 93% d’eau, sang total en

contient 81%. Donc les valeurs obtenues dans le plasma sont environ 1.12 fois celles du sang
 5- Les tubes sans anticoagulants

6- Les anticoagulants
a- Héparine: Anticoagulant par inhibition de la thrombine, Utilisée à la concentration de 0.5
mg/ml de sang, Souvent employée s/f de sel de lithium, de Na, ou d’ammonium
b- EDTA : éthylène –diamine- tétracetate (EDTA) complexe le Ca et inhibe la coagulation , La
concentration est de 1mg/ml de sang, Il ne permet pas le dosage de Ca, Inhibe certains
dosages(céruleoplasmine, PAL, Brb). Active la PAC

c- Citrate : Il inhibe la coagulation par fixation des ions Ca, concentration 5mg/ml, Le citrate fait
sortir l’eau des GR ce qui dilue le plasma environ 5%, la (c) élevé crée une hémolyse, Il
modifie le PH sanguin, ne permet pas le dosage du Ca, ni les cations correspondants aux sels
utilisés ( sel de Na, Li, K), Empêche le dosage de certains enzymes, Utilisé dans les poches de
transfusion pour la conservation des GR
 d- l’oxalate : Il inhibe la coagulation par fixation des ions Ca, Il faut utiliser 0.01ml d’oxalate
d’une (c) de 200g/l par ml de sang, Inc: les tubes contenant l’oxalate doivent être séché à 80°c
afin d’éviter la perte du pouvoir coagulant
e- Fluorure de sodium : Pouvoir anticoagulant par liaison aux ions Ca. Utilisé surtout comme
inhibiteur de la glycolyse des GR (complexe le Mg indispensable à l’une des enzymes de la
glycolyse), Inconvénients: Provoque une hémolyse sans réellement bloquer la glycolyse, Ne
permet pas le dosage de l’urée par l’uréase , Faible pouvoir anticoagulant (il faut l’associer à
l’oxalate)

7- Conservation et transport : Il est

important de respecter les conditions de conservation et de transport. Dans le cas des
analyses très spécialisées, s’adresser directement au laboratoire pour fixer les modalités de
recueil.

Biochimie : Le Glucose doit être acheminé rapidement après le prélèvement sauf si l’anticoagulant est
de type Fluorure. Le Fer doit se prélever le matin à jeun Le Potassium, le Phosphore doivent être
acheminés rapidement à T° ambiante, L’acide urique doit être prélevé et transporté et traité entre 2° et
8°C en cas de traitement uricolytique .

Immunologie : Diagnostic Anténatal : Dépistage Trisomie 21, centrifuger le prélèvement dans les 3h
Biologie Moléculaire VHC : centrifuger le prélèvement et congeler le plasma dans les 6h VIH :
congeler le plasma dans l’heure.

Remarque : Pour certaines analyses, si les conditions pré analytiques ne peuvent être remplies, il est
préférable que le patient se rende directement au laboratoire ou il sera prélevé (ex : gazométrie).
Par ailleurs, les prélèvements doivent être transmis le plus rapidement possible au laboratoire afin
d’obtenir des résultats cohérents et éviter ainsi de reprélever le patient.

II- Les urines

Les urines de 24h : car la concentration des substances varient selon le nycthémère
À 8h le matin faire uriner le sujet, puis recueillir toutes les mictions jusqu’au
lendemain à 8h.
Flacon opaque de 2 litres avec un bouchon rouge qui peut contenir un agent
conservateur (cristaux de thymol, toluene, azoture de Na) Pour les ECBU : Petit flacon 40 ml avec un
couvercle bleu ou rouge.

III-Les autres liquides biologiques

Il s’agit principalement des liquides obtenus par ponction: LCR, liquide d’ascite, pleural, gastrique,
duodénal, bile, péricardique ou encore synovial..
Une homogénéisation et une centrifugation de ces prélèvements doivent précéder l’analyse
biochimique qui reconnait généralement des transsudats et des exsudats.

IV-Tissus
Des constituants biochimiques peuvent être appréciés sur un échantillon tissulaire prélevé le plus
souvent par ponction biopsique ( biopsie hépatique, musculaire) prélèvement de trophoblaste par
amniocentèse.
Les prélèvements peuvent être utilisés s/f de : Fragments d’organe, Coupes fine, Broyat (broyeur
Potter).
 Fiche technique de travaux pratiques de Biochimie

T.P. N°02
 Intitulé : Bandelette urinaire

 Nombre de postes : 30

 But de la manipulation :

 Protocole:
I- Phase pré analytique :
1- L’échantillon d’urines doit être :
- émis après une toilette génitale et récolté au milieu du jet dans un récipient
- non centrifugé, homogénéisé,
- traité au plus vite (dans les 2 heures) après la miction,
- émis dans un récipient propre sans aucune trace de détergent.
2- Les bandelettes doivent être :
- conservées au sec à une température inférieure à 30 0C et jamais au réfrigérateur,
- utilisées avant la date de péremption indiquée sur l’emballage,
- ne jamais être réutilisées ou coupées.
3- Le flacon contenant les bandelettes doit être : refermé immédiatement après usage
avec le bouchon
II- Phase analytique  :
 Mélanger et homogénéiser les urines avec un petit agitateur en
verre.
 Sortir la bandelette de son étui sans toucher les zones
réactives.
 Plonger la bandelette et la retirer immédiatement
 Tapoter la tranche de la bandelette contre le récipient,
afin d'éliminer l'urine excédentaire.
 Attendre le temps préconisé par le fabriquant (généralement entre 30 secondes et
2-3 minutes)
 Comparer la bandelette avec la gamme colorimétrique indiquée sur l’emballage
 Noter les résultats puis jeter la bandelette dans la poubelle à incinérer.
 Remarque : les réactions chimiques sont très sensibles et peuvent engendrer des « faux
positifs » : Des médicaments, un apport alimentaire important en nitrites ou fortement
coloré (betterave rouge), des quantités importantes de vitamine C, des traces
d’antiseptiques
 INDICATIONS : l'analyse doit être validée au moins par la mesure de la densité urinaire
à laquelle on peut avantageusement ajouter le pH.
 Surveillance d'une grossesse : Recherche d'une infection urinaire : GB, GR, nitrites,
Recherche d'une protéinurie, Recherche d'une glycosurie
 Surveillance d'un diabétique : Glycosurie, cétonurie, Recherche d'une infection urinaire :
GB, GR, nitrites, Recherche d'une protéinurie
 Suspicion d'infection urinaire : GB, GR, Nitrite et protéines normaux oriente vers un arbre
urinaire intact. GB, GR, Nitrite et protéines augmentés oriente vers une infection urinaire.
 Suspicion de colique néphrétique : On observe une hématurie microscopique dans 94%
des cas.
 - Suspicion d'insuffisance rénale : Il est rare d'observer une insuffisance rénale si les
paramètres GB, GR et protéine sont négatifs simultanément. De plus, en cas de densité
urinaire supérieure à 1.025, la probabilité qu'il existe une insuffisance rénale sévère est
faible. Ceci peut-être très utile avant la prescription de médicaments néphrologiques
comme les aminosides.

 Méthodologie:

 Définition :
La bandelette urinaire est une méthode d'analyse biologique instantanée des urines
qui sont mises en contact avec des réactifs spécifiques.

Les bandelettes urinaires permettent une analyse simple, rapide et peu chère de
différents paramètres urinaires, Les urines seront mises en contact avec des réactifs
spécifiques. Il existe des bandelettes à 1 ou 2 paramètres (généralement pour
rechercher la protéinurie et la glycosurie), mais aussi des bandelettes à 5, 7 et même
10 paramètres :
 Paramètres
1) Glycosurie
2) Protéinurie
3) Cétonurie
4) Bilirubinurie
5) Urobilinogènurie
6) Nitriturie
7) pH urinaire
8) Densité urinaire
9) Leucocyturie
10) Hématurie
Il s’agit technique semi quantitatifs, ils sont exprimés :
o Soit en négatif.
o Soit en positif.
o Soit en échelle de valeurs
 Principes des méthodes

Paramètres Principe de la méthode

Leucocytes Mise en évidence de l’activité des estérases granulocytaires.

Nitrites Mise en évidence des nitrites donc indirectement des germes

nitrites positifs (Entérobactéries).
pH Mise en évidence du pH par la présence de 2 indicateurs : le
rouge de méthyle et le bleu de bromothymol.
Protéines .Mise en évidence de l’albumine grâce au virage d’un
indicateur de pH
Glucose Mise en évidence du glucose par la méthode
glucoseoxydase/peroxydase
Corps cétoniques Mise en évidence des corps cétoniques par le principe de la
réaction de Légal (détection de l’acide acétylacétique)
Urobilinogène Mise en évidence de l’urobilinogène grâce à un sel de
diazonium stable qui forme un dérivé azoïque rouge.
Bilirubine Mise en évidence d’un sel de diazonium avec la bilirubine
Sang Mise en évidence de l’hémoglobine et de la myoglobine par
l’oxydation de l’indicateur par l’hydroperoxyde
organique.

Fiche technique de travaux pratiques de Biochimie

T.P. N°03
 Intitulé : Ionogramme

 Nombre de postes : 30

 But de la manipulation :

 Introduction : On appelle ionogramme plasmatique, l’étude quantitative des divers ions

présents dans le secteur plasmatique.
L’expression des taux de ces ions en mmol/l permet de saisir d’emblée le pouvoir
osmotique de ces ions et d’en déduire des renseignements à la fois sur l’état hydrique de
l’organisme et la répartition de ses réserves minérales. L’ionogramme plasmatique
comprend :
- Na+ et K+ pour les cations
- Cl-, CO3H- et Protéines pour les anions.
(N.B : les protéines à PH =7.4 dans le plasma se comporte comme des anions).
On traitera les principaux dosages et variations pathologiques des ions : Na+ , K+ et Cl-,
I-Prélèvement : Le dosage du Na+, K+ et Cl- se fait sur :
- Sérum ou plasma hépariné (héparinate de lithium). L’EDTA est à proscrire, ainsi
que tous les anticoagulants liquides. Il faut éviter l’hémolyse.
- Urines de 24 heures.
II-Principales méthodes de dosage
1- Sodium-Potassium
a- Photométrie d’émission de flamme : Technique de référence.
b- Potentiométrie : Electrodes sélectives

- Electodes ISE du Na+ : Le système de mesure se comporte comme une pile :

l’électrode de mesure est une électrode à membrane sélective dont le potentiel va
changer en fonction de l’activité de l’ion à doser.
La mesure se fait par rapport à une solution étalon. La
détermination du sodium plasmatique ou urinaire est réalisée
par une électrode en verre spécifique. Les verres sont
additionnés d’oxyde de silicium ; d’aluminium et de sodium.
Ces électrodes présentent une sélectivité Na/k entre 100 et
1000 et sont insensibles aux ions H+ lorsque le pH est
compris entre 6 et 10.
- Electodes ISE du K+ :l’électrode sélective de potassium
est constituée par la valinomycine dans le diphényléther.
c- Techniques chimiques colorimétriques : Elles sont
basées sur la complexation très sélective des ions par des
 chromo-ionophores. L’échange s’accompagne d’une variation de l’absorbance à
500 nm proportionnelle à la concentration du sodium présent.
d- Les techniques enzymatiques
- Sodium : mesurer l’activité catalytique d’une enzyme : la bêta-galactosidase qui a
pour cofacteur l’ion sodium. La quantité de substrat hydrolysé est proportionnelle à
la concentration du sodium. La mesure est spectophotométrique UV ou visible.
- Potassium : mesurer l’activité catalytique d’une enzyme : la pyruvate kinase qui a
pour cofacteur le K+..

2- Chlorures : Principal anion des liquides extracellulaires (plasma, liquide interstitiel).

Son métabolisme est souvent lié à celui du sodium.

a- Méthodes de dosage
-Méthodes chimiques colorimétriques : Après précipitation d’AgCl, on dose l’excès
de nitrate d’argent par une solution sulfocyanure en présence d’alun de fer ; l’excès de
sulfocyanure est indiqué par l’apparition de la coloration brunâtre.
- Méthodes par mercurimétrie
Technique de Votoceck : Il se forme un complexe soluble non ionisé de chlorure
mercurique. On utilise dans ce cas une solution de diphénylcarbazone qui vire du jaune
au violet
Technique de Zall : composé coloré en rouge brun (480nm).
Méthode au TPTZ (tripyridyl-triazine) : Elle utilise du nitrate mercurique et du sulfate
ferreux qui donne une coloration bleue avec le (595nm).
- Méthodes physicochimiques
- Technique Coulométrique : Par passage du courant entre deux électrodes en
argent, il se forme des ions Ag+ qui se combinent aux ions Cl- de la solution et
produisent un précipité de chlorure d’argent.
- Potentiométrie (ISE) : L’électrode est constituée par une membrane compacte de
chlorure d’argent.

III- Valeurs de référence 

Electrolyte Sang (mmol/l) Urine (mmol/24h)
Na+ 138-145 100-260
K+ 3.5-4.5 25-130
Cl- 95-110 50-220

IV- Variations pathologiques

1- Sodium
a- Hyponatrémie : c’est une diminution de la concentration plasmatique de sodium en-
dessous de 136 mmol/l à une diminution de l’osmolarité plasmatique (hypotonicité
extracellulaire).
b- Hypernatrémie : est définie par une augmentation de la concentration plasmatique de
sodioum au-dessus de 145mm/l.

2- Potassium
 Hypokaliémie (K+ < 3 mmol/l) Hyperkaliémie (K+ > 5.5 mmol/l)

Moins fréquente que l’hypokaliémie mais

-Diminution des apports de K plus dangereuse.
-Mouvements transcellulaires de K+ ex : alcalose. -Fausse hyperkaliémie, ex : hémolyse.

-Augmentation de l’excrétion de K+ : -Apports excessifs de K+, ex : perfusion

*Rénale : l’insuffisance rénale aigue, intraveineuse.
*Extrarénale : aspiration gastrique, fistule
entérocutanée. -Mouvements transcellulaires de K+, ex :
dommages tissulaires.

-Excrétion diminuée de K+, ex : IRA.

3- Chlorures :
Hypochlorémie (Cl<90mmol/l) Hyperchlorémie(Cl>110mmol/l)

Ces perturbations sont étroitement liées à Ne s’accompagnant d’aucun signe clinique

l’équilibre acido-basique  particulier 

-Alcalose métabolique hypokaliémique : -Acidose hyperchlorémique :

Tubulopathie chronique congénitale ou acquise.
*Fuite digestive : vomissement, aspiration, -Hypernatrémie de déshydratation :
diarrhée.
*Diabète insipide hypothalamique ou
*Fuite urinaire : Acidose respiratoire. Rétention néphrogénique.
plasmatique d’anions organiques :*IRA *Coma *Polyuriesosmotiques ;coma hyperosmolaire
diabétique. Hyponatrémie

Fiche technique de travaux pratiques de Biochimie

T.P. N°04
 Intitulé : Urée été créatine

 Nombre de postes : 30
 But de la manipulation :

INTRODUCTION
Le rôle vital des reins est intimement lié à leur fonction dans l’homéostasie du milieu
intérieur, permettant de protéger les cellules vis-à-vis des conséquences des variations
environnementales de l’organisme. Les reins éliminent des produits métaboliques
terminaux, un grand nombre de substances exogènes comme les médicaments, les additifs
alimentaires et une quantité ajustée d’eau et d’électrolyte.
1. Examen « physique » des urines : Diurèse et l’aspect de l’urine.
 Aspect de l’urine: apprécier la coloration, l’odeur et la turbidité.
 Diurèse: Chez un adulte normal 0,75 L à 1.5 L/ 24h. Polyurie (D > 2500 ml/24
h),Oligurie et anurie(D< 600 et D < 100 ml/24 h) :

2. Urée plasmatique et urinaire

Def : produit d'élimination de l'azote organique. Urée peut être dosée dans le plasma et les
urines.
Méthodes de dosage : sont essentiellement enzymatique à l'uréase avec dosage
colorimétrique du produit formé NH4+ par la réaction de Berthelot ( salicylate et
hypochlorite en milieu alcalin) ou couplée à la glutamate déshydrogénase GLDH ou encore
par conductimétrie dosant l'ensemble carbonate d'ammonium(NH4+ HCO3-)
UREASE
2HN CO NH2 +2 H2O CO3-2 + 2NH4+

NH4++α cétoglutarate+NADH,H+ GLDH glutamate + NAD+

l'urémie est dosée sur plasma hépariné à jeun. Fluorure de sodium est un inhibiteur de
l'uréase

Valeurs normales urémie : 0,15 - 0,45g/l

Variations physiologiques : taux bas chez la femme,

diminue au cours de la grossesse et augmente avec
l'alimentation riche en azote (viande) et avec l'âge.

Variations pathologiques :
 taux diminué dans les hémodilutions, déficit enzymatique qui touche l'uréogènèse
hépatique, carence nutritionnelle, malabsorption digestive.
 taux augmenté : septicémie, hémorragie digestive, grands brulés ,des situations souvent
associées d'une insuffisance rénale fonctionnelle et d'une augmentation de l'urée
urinaire.

3. Créatinine :
Def : produit de déshydratation spontanée de la créatine musculaire . elle est produite en
quantité constante par le métabolisme musculaire, et librement filtrée dans le glomérule :
meilleur marqueur endogène de la filtration glomérulaire.
Méthode de dosage:

 Méthode colorimétrique de Jaffé au picrate alcalin soit au point final soit cinétique

Interférences : protéines, acides organiques, les corps cétoniques pyruvate, acide urique...
  Méthodes enzymatique : utilisant la créatininase

Créatinine +H2O créatine

La créatine formée est dosée enzymatiquement
par la CK avec dosage à 340nm.

La méthode de référence : chromatographie en

phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse après dilution isotopique (IDMS) .

Prélèvement : plasma hépariné à jeun, à distance des repas et exercices physiques.

Les urines de 24h ou miction qui doivent être acidifiés. Il est recommandé d'hydrater le
patient et éviter les diurétiques.
Valeurs normales de la créatinémie: H: 6 - 13mg/l F: 5- 12mg/l

Variations physiopathologiques: indépendante de l'alimentation (sauf apport

carné), elle augmente par l'exercice physique, doit être mesurée au repos. La créatinémie
augmente au cours de l'IR mais elle est utilisée pour suivre des malades insuffisants rénaux
et une estimation du DFG.
La relation entre la créatinémie et le DFG n'est pas linéaire, mais une hyperbole inverse
avec une relation plate autour de 6-13mg/l avec valeurs DFG abaissé.

La créatinurie: 1-2g/24h, elle est augmentée dans les diurèses forcées, sensible à
l'alimentation carnée ou supplémentation orale de créatine.

4. Clairance de la créatinine: La clairance d'une substance éliminée par le rein se définit

comme le volume de plasma épuré totalement de cette substance dans l'unité de temps.
Plus la clairance est élevée plus le « pouvoir d'épuration » du rein pour la substance
considérée, est grand.
Cl Cr= créatinurie (mg/l). Débit urinaire (ml/min)/ créatinémie (mg/l)

La valeur normale : 90 à 120 ml/mn exprimé en ml/min

Cl Cr corrigée=Cl Cr mesurée.1,73/surface calculée

Formules et algorithmes pour calculer le DFG:

 Formule la plus utilisée est la formule de Cockcfoft et Gault:
Cl Cr( homme)= (140-âge)poids (Kg) = (140-âge)xpoidsx1,23
72x créât plasmatique (mg/dl) = créât plasmatique
(umoles/l)
Cl Cr(femme) = (140-age)x poids(Kg) (140-age) x poids x 1,04
= 85x créât plasmatique (mg/dl = créât plasmatique (umoles/l)

 Formule MDRD (Modification of Diet in Renal Disease) simplifiée

 Formule CKD-EPI (Chronic Kidney Disease-Epidemiology collaboration)