Université Cheikh Anta Diop de Dakar

Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odontologie

RAPPORT DE STAGE
5ème année de Pharmacie

Option : Biologie (2020-2021)

Stagiaire : Cheikh Ismaïla Ba

Lieu : LABORATOIRE DE L’HOPITAL MILITAIRE DE OUAKAM

Période : Du 1er Mars 2021 au 9 Avril 2021

Encadreur : Dr Mame Cheikh SECK

 PLAN
Introduction
I. Description de l’hôpital
II-Les différentes paillasses du laboratoire
1-Hématologie
1-1 Test d’Emmel
1-2 Groupage
1-3 Vitesse de sédimentation
2-Bactériologie
2-1 Rappels sur la coloration de gram
2-2 ECBU
3- Sérologie
3-1 Sérologie du VIH
3-2 Sérologie de l’hépatite B
Conclusion
Introduction :

Le stage spécialisé de biologie en master 2 de pharmacie option biologie se déroule sur deux
périodes dont une dans un laboratoire polyvalent et l’autre dans un laboratoire spécialisé.

Au sein de ces structures sont réalisés des analyses biologiques qui aident au diagnostic et à la
prise en charge des malades.

Nous avons effectué notre première période au laboratoire polyvalent de l’Hôpital Militaire de
Ouakam du 1er Mars 2021 au 9 Avril 2021. Ce stage permet la mise en pratique des
connaissances acquises au cours de cinq années de formation.

Durant le stage nous avons fait le tour de la quasi-totalité des paillasses du laboratoire.

Après une description générale de l’hôpital et du laboratoire, nous décrirons l’ensemble des
analyses auxquelles nous avons pris part dans les différentes unités de travail.

I. Description générale de l’hôpital :

L’Hôpital Militaire de Ouakam est une structure de santé militaire. Il comprend plusieurs
services et un laboratoire de biologie médicale.

Le laboratoire est structuré de la manière suivante :

 Une salle de prélèvement sanguin

 Une salle pour les prélèvements vaginaux

 Le bureau du major

 Un service de biologie qui comprend :

- un secteur de bactériologie-parasitologie
 -un secteur d’hématologie

-un secteur de sérologie

 Un service de biochimie

 Un service de biologie moléculaire

Le laboratoire est doté de plusieurs automates d’analyses médicales dont l’entretien et la

réparation des pannes sont effectuées par leurs fournisseurs.
La plupart des consommables utilisés provient de la pharmacie centrale de l’hôpital après
commande. Ces derniers sont réceptionnés par le Major du laboratoire, qui se charge de les
distribuer entre les différents services du laboratoire.

II-Les différentes paillasses

1-Hématologie

1-1 Test d’Emmel

C’est un test qui permet le diagnostic de la drépanocytose.

*Principe : en présence d’un réducteur (métabisulfite de sodium 2%) les hématies du

drépanocytaire prennent une forme en faucille.

Le test est effectué sur un échantillon de sang total prélevé sur tube EDTA.

*Mode opératoire

IL faut d’abord déposer sur une lame propre une goutte de sang et une goutte de la solution de
métabisulfite de sodium à 2% puis mélanger doucement. Recouvrir avec une lamelle en
évitant les bulles d’air et essuyer délicatement l’excès du mélange avec du papier buvard (à
défaut utiliser une compresse), sceller ensuite les bords de la lamelle avec du vernis à ongles
ou de la paraffine, le but étant d’empêcher le contact des hématies avec l’oxygène de l’air
ambiant. Attendre 15 à 20 min puis lire au microscope à l’objectif 40.

Résultats
Test négatif : les hématies gardent leur forme régulièrement arrondie.

Test positif : présence d’hématies en forme de « faucille ».

Causes d’erreurs - Etalement mal fait avec hématies « traumatisées » - Présence de bulles
d’air

1-2Groupage Sanguin

_Groupage dans le système ABO

Le groupage sanguin dans le système ABO peut çtre déterminé par la méthode de Beth
Vincent où les hématies à tester sont mises en contact avec des anticorps sériques connus afin
d’identifier les allo-antigènes de ces hématies.

*Prélèvement

La méthode de Beth Vincent est effectuée à partir du sang total prélevé sur tube avec
anticoagulant (EDTA, Citrate)

*Mode opératoire

Sur une plaque déposer dans l’ordre :

 une goutte de sérum test anti-A

 une goutte de sérum test anti-B

 une goutte de sérum test anti-AB

 ajouter à côté de chaque goutte de sérum test, une goutte de culot d’hématies à tester (une
petite goutte ou des hématies diluées)

 mélanger soigneusement les deux gouttes puis animer la plaque d’un mouvement rotatoire
lent

 observer au bout d’une minute et rechercher s’il y a ou non agglutination

Nb: Lorsque l’antigène est présent, l’anticorp correspondant est absent dans le sérum.

_Groupage dans le système rhésus

La détermination du groupe Rhésus se fait par la méthode globulaire, et consiste à mettre en

évidence l’AgD à l’aide d’anticorp anti-D.

Mode opératoire

 Laisser le sérum test à température ambiante au moins 30 min avant l’emploi

 Sur une plaque d’opaline, déposer 1 goutte du culot érythrocytaire du patient

 Déposer une goutte du sérum anti-D à côté de la goutte de sang

 Mélanger avec le fond d’un tube à hémolyse les gouttes d’un mouvement circulaire et
essuyer le fond du tube entre chaque réaction.

 Agiter la plaque doucement par rotation

 Lecture au bout de quelques minutes

Résultats

 S’il y’a agglutination alors le sujet est de Rh+

 S’il y’a absence d’agglutination le sujet est Rh-

1-3 La Vitesse de sédimentation (VS)

Principe

C’est la vitesse à laquelle les hématies contenues dans le plasma sédimentent au fond d’un
tube calibré et gradué, appelé tube de Westergreen. Elle correspond à la hauteur de chute des
particules sanguines dans le tube. La vitesse de sédimentation permet de dépister et de
surveiller des processus inflammatoires et infectieux.

Prélèvement

Prélèvement de sang veineux (en général au pli du coude) ; le tube de prélèvement contient un
anticoagulant : EDTA ou citrate trisodique à 3,8% dans une proportion de 20% (1 volume
d’anticoagulant pour 4 volume de sang).Le prélèvement est réalisé de préférence à jeun

Mode opératoire

 Aspirer le sang, bien homogénéisé, dans la pipette de Westergreen jusqu’au trait 0 en tirant
sur la languette présente dans la pipette.

 Placer aussitôt la pipette sur le support.

 Lire la hauteur du plasma surnageant (exprimée en mm) au bout d’une heure

Les valeurs normales sont :

 enfant : 6 à 25 mm

 femme adulte : 4 à 20 mm

 homme adulte : 3 à 10 mm

2- Bactériologie-parasitologie

Nous y traitons différents produits pathologiques à la recherche de bactéries ou de parasites

pathogènes impliqués dans des infections.

Il est réparti en différentes paillasses :

- la paillasse prélèvement génitaux : à laquelle sont traités les prélèvements vaginaux et

urétraux

-la paillasse centrale : on y réalise les galeries d’identifications bactériennes et les

antibiogrammes.

-la paillasse ECBU –KAOP : on y reçoit des échantillons d’urines pour analyse

bactériologique et des échantillons de selles pour examen parasitologique KAOP
signifiant kystes, amibes, œufs, parasites.

2-1Rappel sur la coloration de Gram

Elle utilise des colorants et permet une classification des bactéries selon leur structure et
d’apprécier leur groupement.

Le Principe de la Coloration de Gram

La coloration de Gram différentie les bactéries en fonction de la composition de leur paroi.

Les bactéries Gram positif possèdent une paroi avec une couche importante de peptidoglycane
contrairement à celle des bactéries Gram négatif.

Réactifs

_ violet de gentiane

_ lugol

_ alcool à 95°

_ fuschine

Technique

 Première phase de la coloration : recouvrir la préparation de violet de gentiane, laisser

agir une minute
 Laver puis recouvrir la lame de Lugol et laisser agir une minute
 Phase de décoloration : laver successivement à l’eau et à l’alcool jusqu’à ce que le
liquide qui s’égoutte soit incolore
 Deuxième phase de coloration : recouvrir la lame de fuschine et laisser agir une
minute
 Laver à l’eau et sécher entre deux feuilles de papier buvard, puis lire au microscope à
l’immersion, avec l’objectif 100X.
 Figure n°1 : Technique de la coloration de Gram

Interprétation

Les bactéries colorées en violet sont dites à gram positifs (+) et celles colorées en rose à gram
négatif (-)

2-2EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DES URINES (ECBU)

a. Prélèvement
 Conditions

Le prélèvement doit se faire le matin (1ère miction du matin) avant toute antibiothérapie si non
observer une fenêtre thérapeutique de 3 à 5 jours. On peut faire le prélèvement à tout moment
de journée après abstention urinaire de 3 heures et sans délai chez le porteur de sonde
vésicale.

Techniques de prélèvement

Deux techniques sont pratiquées au laboratoire.

o Le recueil d’urines physiologiques

Après lavage hygiénique des mains et toilette soigneux au savon ou aux

antiseptiques doux de la région vulvaire chez la femme et du méat urinaire
chez l’homme, recueillir au milieu du jet dans un pot identifié et fourni sur
place.

o Chez le patient sondé

On clampe la sonde pendant 10 à 15 minutes puis on ponctionne à la

seringue en piquant à travers la sonde préalablement désinfectée dans sa
partie initiale lorsqu’elle est dépourvue de site de prélèvement.

b. Réalisation de l’ECBU

 Au premier jour

Examen macroscopique

Il permet de noter l’aspect des urines. Les urines normales sont claires de couleur jaune-paille.
Ainsi on peut noter des urines claires, des urines troubles, légèrement troubles ou hématiques.

Examen microscopique

 On fait un état frais entre lame et lamelle à partir de l’urine totale.

Cet examen permet de faire :

La cytologie quantitative : une appréciation quantitative ou semi-quantitative des

leucocytes, des hématies, des cellules épithéliales qui seront exprimés en nombre/champs.

La cytologie qualitative : permet de vérifier la présence de cristaux, de levures, de

parasites (Trichomonas vaginalis, œufs de bilharzies), et de préciser la mobilité des
bactéries.

 La coloration de Gram peut être effectuée sur un frottis réalisé à partir du culot de
centrifugation. Elle apporte les informations supplémentaires sur les caractères
morphologiques des bactéries : forme et mode de groupement
 Culture

Les urines sont ensemencées sur milieu CLED. C’est un milieu déficitaire en électrolyte ce
qui empêche son envahissement par les Proteus. Le milieu CLED est non sélectif et contient
un indicateur de l’attaque du lactose.

Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des germes urinaires.

On ensemence selon la méthode de l’anse calibrée :

On dilue 10ul d’urine totale dans 1ml d’eau physiologique, on ensemence en stries 10ul de la
dilution sur la gélose coulée en boite de pétri. On incube à 37° pendant 18 à 24h.

 Deuxième jour

Examen macroscopique

S’il y a pousse, on dénombre les germes urinaires. Le dénombrement des germes urinaires
(DGU) fait partie des critères de recherche d’infections urinaires du tractus urinaire.

Le nombre de germes supérieur à 105 et la présence de leucocytes est en faveur d’une

infection.

On prend compte de l’aspect et la couleur des colonies.

Examen microscopique

On fait un état frais et un examen après coloration au Gram.

On prélève une colonie puis on fait l’examen microscopique afin de déterminer la

morphologie de la bactérie (bacille ou Cocci), le mode de regroupement, chainette, en amas,
en diplocoque et le Gram (positif ou négatif)

 Quand il s’agit de bacille Gram négatif, on fera l’identification à la mini galerie (urée
indole, mannitol mobilité, Kligler-Hajna, citrate de Simmons) pour les entérobactéries.
 Quand il s’agit de cocci Gram positif on fera catalase, Chapman, BEA pour identifier les
staphylocoques et les streptocoques.
 Troisième jour

Lecture

 Mini galerie pour les bacilles Gram négatif

 Cocci Gram + :
Si catalase +, on est dans la famille des staphylococcaceae
Si catalase -, on est dans la famille des streptococcaceae
 Figure n°2 : les différents milieux de cultures

Interprétation

Tableau 1 : Récapitulation des différents cas significatifs

Bactériurie/m
Leucocyturie/ml Eventualités possibles Suite à donner
l
> 104 > 105 ITU typique si monomicrobienne ECBU
- Infection débutante
Faire 2ème
< 104 > 105 - Contamination prélèvement -
prélèvement
Terrains particuliers
> 104 < 105 - Infection / espèce bactérienne Recherche
(BK) particulière

- Infection génitale
- Infection décapitée
- Cause non bactérienne
< 104 <104 Absence d’ITU

Antibiogramme
Il permet de tester la sensibilité aux antibiotiques de la souche isolée.

3.Section de sérologie

3-1 Sérologie du VIH

Il s’agit d’une opération qui vise à détecter la présence du Virus de l’Immunodéficience

Humaine dans l’organisme. Dans cet hôpital, le test se fait à l’aide des bandelettes « VIH-
Test » qui portent des antigènes de synthèse correspondant exclusivement aux antigènes
d’enveloppe du VIH. Le sérum du patient provenant de son échantillon de sang (tube sec)
centrifugé (3000trs/mn) est déposé au niveau de la partie de la bandelette préparée à cet effet.
Après 15mn de migration du sérum par capillarité, nous pouvons lire la bandelette :

Figure n°3 :Bandelettes de VIH-test

 Un 1er trait = Trait de control, qui confirme la fiabilité du test. Lorsque ce trait est
unique, le résultat est dit négatif.
 Un 2e trait = Séropositivité.

3-2Sérologie de l’hépatite B

L’hépatite B est une infection virale qui s’attaque au foie et peut être à l’origine d’une
maladie aigue ou chronique, potentiellement mortelle. Réaliser la sérologie de l’hépatite B
revient à révéler la présence de marqueurs sérologiques (anticorps anti-Hbs) ou biologique
(ADN virale) dans l’organisme du patient. Divers tests permettent de les révéler, notamment
les bandelettes réactives avec lesquelles nous avons travaillé. Sur le même principe que les
bandelettes de VIH-test, la positivité confirme la présence d’anticorps dans le sérum du
patient mais aussi la présence de l’antigène de l’agent pathogène.

Conclusion

Le stage de six semaines effectué au laboratoire de l’HMO nous a permis d’avoir un aperçu
beaucoup plus clair sur l’organisation d’un laboratoire médical et de comprendre le rôle du
biologiste dans le diagnostic et la prise en charge des pathologies humaines. Cette première
période de stage très riche en enseignement nous a également permis de mettre en pratique la
connaissance théorique accumulée à la faculté.