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4- Méthodes de dosage et mesure de l’activité enzymatique

Beaucoup de dosages, notamment biologiques, reposent sur des techniques enzymatiques. Deux cas de
figure peuvent se présenter :
- Dosage d’une molécule qui est utilisée en tant que substrat.
- Détermination de l’activité d’une enzyme.
I. Determination de la concentration d’un substrat
Il existe deux cas de figure :
- Méthode point final : transformation du substrat en un produit P qui lui va être quantifiable.
Dans ce cas là, la réaction doit se dérouler le plus rapidement possible, doit être totale et en général
la concentration en substrat doit préférablement être faible.
- Méthode cinétique : travail en vitesse de réaction. Il est préférable que la vitesse de réaction
soit lente et la concentration en substrat élevée.
1. Méthode point final
Le but de cette méthode est de transformer la totalité du substrat en produit. Le problème est que toute
réaction possède un équilibre S1+ S2= P1+ P2.
La constante d’équilibre des réactions est : Ke = [P1][P2] / [S1][S2].
Pour que la concentration en produit final soit égale à la concentration en substrat initial, il faut que la
réaction soit la plus complète possible. Pour rendre une réaction totale, on peut :
- Piéger un des produits pour inciter la consommation du substrat.
- Augmenter la concentration de S2 pour les mêmes raisons.
- Coupler la réaction avec une réaction secondaire qui va permettre de consommer un des
produits.

❖ Dosage en mesure directe :

La première réaction donne un produit coloré.

Exemple : CH3-CH2OH + NAD+⇌ CH3-CH=O + NADH,H+


L’acétaldéhyde peut être piégé par semi-carbozène. NAD et NADH n’ont pas du tout les mêmes
propriétés spectrales, ce qui permet le dosage.

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En travaillant à 340 nm, une fois que la réaction est totale, il suffit de mesurer l’absorbance du milieu
réactionnel. Par la loi de Beer-Lambert (A=εlc) et connaissant l’absorbance, on peut retrouver la
concentration du NADH produit. Comme la réaction est totale, cette concentration correspond également à
la concentration en substrat (éthanol) initial.

❖ Dosage à l’aide d’une réaction couplée :

Par exemple, pour le dosage du glucose, la réaction utilisée est la suivante :

Fig: Dosage à l’aide d’une réaction couplée (détection du glucose à partir de NADH) (See pdf: Enzymatic Food
Analysis)

Le dosage est fait de façon indirecte, à l’aide d’une deuxième réaction. On obtient le résultat en
travaillant à 340 nm et en dosant le taux de NADH final.
2. Méthode cinétique
Avec cette méthode, on étudie la vitesse de réaction, c’est à dire la quantité de produit formé en fonction
du temps.

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La vitesse suit l’équation de Michaelis et Menten :

Lorsque la concentration en substrat est largement inférieure au Km, elle est négligeable, et alors Vi = k
x [S] (avec k = Vmax/Km)

II. Méthodes de détection


Il existe 2 types de détection :
- Les méthodes nécessitant la séparation du substrat et du produit.
- Les méthodes ne nécessitant pas la séparation du substrat et du produit
1. Méthodes nécessitant la séparation du substrat et du produit

❖ Spectrophotométrie d’absorption :

En termes de spectrophotométrie, on peut travailler soit dans l’UV (200-350 nm), soit dans le visible
(350-700 nm). Cette méthode repose sur la loi de Beer-Lambert. Quand le faisceau lumineux Io, traverse
un milieu, il en résulte un faisceau d’intensité It.
Si It = Io, alors la solution n’absorbe pas.
Cette absorbance est proportionnelle au ε de la molécule à la longueur d’onde donnée, et est
proportionnelle à la concentration de la molécule.

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❖ Spectrofluorimétrie :

On mesure la fluorescence à 90° (car à 180° il y aurait une pollution du signal par It, qui est beaucoup
plus puissant).

❖ Titrage acide-base :

Il n’est utilisable que lorsque l’un des produits est un acide ou une base. La formation d’acide fait
diminuer le pH. A l’aide d’une base forte (NaOH), on rétablit le pH initial. Le nombre de molécules ajoutées
correspond alors au nombre d’esthers esthérifiés. Cette méthode est appelée méthode du pH stabilisé.

❖ Manomètrie :

Elle peut être utilisée pour déterminer l’activité enzymatique lorsque la réaction produit ou consomme
un gaz.
2. Méthodes ne nécessitant pas la séparation du substrat et du produit
Il existe plusieurs techniques permettant de séparer le substrat du produit.

❖ La chromatographie sur couche mince :

Elle ne permet qu’une analyse qualitative mais permet tout de même d’avoir une idée de l’avancement
de la réaction. Elle permet de séparer les molécules en fonction de leur polarité :
- les molécules polaires restent sur la silice (hydrophile)
- les molécules apolaires avancent avec le solvant (hydrophobe)
On peut ainsi faire des CCM tout au long de la réaction, en arrêtant la réaction en modifiant le pH par
exemple.

❖ La chromatographie liquide haute performance (HPLC) :

Elle fonctionne sur le même principe que la CCM mais est plus rapide et plus précise. Sa reproductibilité
est sans faille

❖ La chromatographie en phase gazeuse (CPG) :

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De la même façon que pour la CCM et l’HPLC, les molécules sont séparées en fonction de leur polarité,
mais l’échantillon passe cette fois dans une colonne et est propulsée par un gaz inerte au lieu d’un liquide
(helium, azote…). On obtient alors des chromatographes.
De façon classique (dans 90% des cas), il faut au moins 4 à 5 cinétiques différentes, avec 4 à 5
concentrations en substrat différentes.
Il existe encore d’autres techniques qui permettent de déterminer l’activité enzymatique mais elles sont
moins utilisées (radioactivité, immunologie en test ELISA…).
III. Mesure de l’activité catalytique des enzymes
La mesure de l’activité catalytique des enzymes est l’étude de la vitesse de réaction. Cette vitesse de
réaction est déterminée dans des conditions physico-chimiques précises (force ionique, pH, température...).
La vitesse de réaction est toujours proportionnelle à la quantité d’enzyme, quelle que soit la concentration
en substrat. Cette vitesse dépend de la concentration en substrat uniquement si la concentration en enzyme
est constante. Elle atteint son maximum Vmax à partir d’une certaine concentration en substrat.
1. L’activité enzymatique
Au début du XXème siècle, il existe plusieurs unités pour l’activité enzymatique: Bolanski, Bessey.
En 1961, les chercheurs décident de créer une unité internationale, qui correspond au nombre de µmol
de substrat utilisé par minute.
En 1966, la Catal apparait, il correspond au nombre de mol utilisées par seconde. En 1972, il est
renommé Katal.
2. L’activité spécifique
AS = AE / masse de protéines
Pour 8 mol d’enzyme :
- Si l’enzyme est pure, AS = AE/8
- Si l’enzyme est contaminée par 2 mols de protéines, AS = AE/10
Ainsi, l’activité spécifique est le reflet de la pureté de l’enzyme.

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5- Démonstration de l'équation de Michaelis et Menten. Détermination graphique de
vmax et KM

1. Les enzymes michaeliennes

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques, c’est-à-dire des molécules capables d’accélérer des
réactions chimiques spécifiques et qui sont retrouvées dans leur état initial à l’issue de la réaction catalysée.

Il existe différents mécanismes enzymatiques selon l’enzyme considérée. Les enzymes dites
michaeliennes fonctionnent selon le mode suivant : un substrat S se lie avec une enzyme E pour donner un
intermédiaire ES, appelé complexe enzyme-substrat, puis cet intermédiaire se dissocie pour donner un
produit P avec régénération de l’enzyme E. Précision importante : chaque site actif se comporte
indépendamment des autres, qu’ils soient physiquement séparés (un site actif par molécule) ou non
(plusieurs sites actifs par molécule).

Bien entendu, il existe bien d’autres mécanismes enzymatiques. Citons en particulier les enzymes
allostériques qui possèdent nécessairement plus d’un site actif par molécule (au moins deux) et pour
lesquelles les caractéristiques cinétiques d’un site actif vont varier en fonction de l’état des autres sites de
la même molécule (liés ou non liés à un substrat).

Chaque mécanisme se traduit par des caractéristiques cinétiques spécifiques (évolution de la vitesse de
catalyse au cours du temps). Pour faire une étude cinétique, il faut mesurer la vitesse instantanée de la
réaction à différents moments en ayant choisi avec soin les conditions initiales. À partir des mesures on
peut tracer des courbes représentant la cinétique de la réaction, ce qui permet de déterminer certaines valeurs
caractéristiques.

L’équation de Michaelis-Menten est une expression mathématique décrivant les paramètres cinétiques
d’une réaction chimique catalysée par une enzyme michaelienne.

2. Détermination de l’équation de Michaelis-Menten

Au début du XXe siècle, Michaelis et Menten ont proposé un mécanisme réactionnel pour la
transformation d’un substrat S en un produit P par une enzyme E. Ce mécanisme comporte deux étapes et
fait intervenir un intermédiaire réactionnel : le complexe enzyme-substrat, noté ES.

k1 k2
E+S⇌ ES ⇌ E+P
k−1 k−2

Avec k1, k−1, k2 et k−2 sont les constantes de vitesse des différents actes élémentaires.

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Rappel de cinétique chimique : les concentrations des espèces à l'instant t sont notées [E], [ES], [S] et
[P]. Les concentrations initiales de ces espèces sont notées [E]0, [ES]0, [S]0 et [P]0.

La vitesse de réaction (caractérisée par la vitesse d’apparition du produit, soit v=d[P]/dt) varie avec le
temps (voir graphique 1).

Figure 1 - Concentration en produit au cours du temps pour une réaction catalysée par une enzyme
michaelienne

La vitesse de la réaction à un instant t s'obtient en mesurant la pente de la tangente à la courbe


à cet instant t. En début de réaction, la vitesse de réaction est constante, on parle d’état quasi-
stationnaire. Durant cette période la quantité de produit Preste négligeable donc les conditions
de Michaelis sont respectées. La vitesse de réaction déterminée sur cette période correspond donc
à la vitesse initiale vi. Puis, on constate un infléchissement de la courbe, qui traduit une diminution
progressive de la vitesse de la réaction. En effet, le produit continuant à s’accumuler, la réaction
inverse (disparition du produit) devient non négligeable. À plus long terme, la concentration en
produit atteint un plateau, la quantité maximale de produit pouvant apparaître dépendant de la
quantité de substrat introduite au début de l’expérience et des constantes cinétiques de la réaction.
On constate que pour des concentrations de substrat croissantes, la concentration finale de
produit ainsi que la vitesse initiale de réaction sont également croissantes.

En début de réaction, la vitesse de réaction est quasi-constante et égale à la vitesse initiale, notée vi ou
v0. En fin de réaction, la vitesse tend vers zéro. En effet, soit la réaction est totale et une fois le substrat
épuisé il n’y a plus de réaction possible (donc v=0), soit un équilibre s'instaure entre la formation de produit
(ES→E+P) et sa destruction (E+P→ES) ce qui, là encore, se traduit par une vitesse de réaction nulle.

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L’équation de Michaelis-Menten donne une expression de la vitesse initiale de réaction vi en fonction
de grandeurs connues (fixées par l’expérimentateur ou mesurées).

Pour cela il faut se placer dans des conditions expérimentales particulières, à savoir : concentration en
substrat [S] très largement supérieure à la concentration totale en enzyme [E]0 et absence ou quasi-absence
de produit P. La première condition est obtenue en choisissant des quantités adaptées d’enzyme et de
substrat à introduire dans le milieu réactionnel, la seconde en réalisant les mesures suffisamment
rapidement pour que la quantité de substrat transformé en produit soit faible. On parle de conditions de
Michaelis. À partir du moment où ces conditions sont réunies, on peut effectuer les approximations
suivantes :

1. La concentration en produit [P] étant nulle ou faible, la vitesse d’apparition du complexe ES par
réaction entre E et P (v−2=k−2[E][P]) est négligeable devant v1=k1[E][S].
2. On se place dans le cadre de l'approximation des états quasi-stationnaires, ce qui revient à considérer
que la concentration [ES] reste constante. Mathématiquement, cela se traduit par d[ES]/dt=0.
3. [S]0 étant très grand par rapport à [E]0, la concentration maximale en complexe [ES] est limitée
par [E]0 et sera donc toujours négligeable comparée à [S]0, même à saturation de tous les sites
actifs. Or [S]=[S]0−[ES], donc si [ES] est négligeable face à [S]0, il en découle l’approximation
suivante : [S]=[S]0

Ces préalables étant posés, on peut commencer à faire un traitement mathématique simple de la cinétique
de la réaction.

2.1. Étape 1

À tout instant, la vitesse de réaction v est donnée par v=d[P]/dt=k2[ES]–k−2[E][P].

Si l’on considère maintenant la vitesse initiale de réaction vi, d’après l’approximation 1 on peut négliger
le terme k−2[E][P], ce qui donne vi=k2[ES].

[ES] est une valeur qui n’est pas fixée par l’expérimentateur, et qui ne peut pas être mesurée (pas plus
que [E] et [S], contrairement à [E]0 et [S]0). Pour avoir une expression utilisable, il faut donc trouver une
expression de [ES] qui utilise des valeurs qui peuvent être connues (qu’elles correspondent aux conditions
expérimentales fixées par l’expérimentateur ou qu’elles puissent être mesurées).

Il est également nécessaire de faire la distinction en vi et vmax. Quelles que soient les conditions,
vi=k2[ES]. Par contre, il existe une valeur particulière de vi, la vitesse maximale vmax. Celle-ci est atteinte
lorsque [ES]=[E]0, c’est-à-dire lorsque tous les sites actifs sont saturés. La vmax est donc la vitesse

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maximale de catalyse pour une concentration donnée d’enzyme. Elle est obtenue à saturation de l’enzyme,
autrement dit lorsque tous les sites actifs de toutes les molécules d’enzyme sont occupés. Sa valeur dépend
évidemment d’autres conditions expérimentales (température, pH, etc.) mais nous n’aborderons pas leur
influence dans cet article.

2.2. Étape 2

La variation de la concentration en complexe enzyme-substrat ES est liée aux vitesses des différents
actes élémentaires du mécanisme proposé par Michaelis et Menten. Certains contribuent à sa formation
(actes élémentaires 1 et -2, tandis que d’autres contribuent à sa disparition (actes élémentaires -1 et 2).
Ainsi :

d[ES]/dt=k1[E][S]−k−1[ES]−k2[ES]+k−2[E][P]=0

Puisqu'on néglige k−2[E][P] et qu'on considère que d[ES]/dt=0, on obtient :

d[ES]/dt=k1[E][S]−(k−1[ES]+k2[ES])=0
⇔k1[E][S]−(k−1+k2)[ES]=0
⇔[E][S]/[ES]=(k−1+k2)/k1

Pour simplifier on pose KM=(k−1+k2)/k1 . KM est appelée constante de Michaelis ; sa dimension est
celle d’une concentration.

L’équation précédente devient donc

[E][S]/[ES]=KM⇔[ES]=[E][S]/KM

2.3. Étape 3

À tout instant, la concentration totale d’enzyme [E]0 se répartit entre les molécules libres E et les
molécules complexées avec le substrat, ES :

[E]0=[E]+[ES]⇔[E]=[E]0−[ES]

En remplaçant ce terme dans l’équation trouvée en fin d’étape 2 on obtient :

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2.4. Étape 4

D'après l'étape 1, vi=k2[ES], et d'après l'étape 3, [ES]=[E]0[S]KM+[S], donc

[𝐸]0[𝑆]
𝑣𝑖 = 𝑘2
𝐾𝑀 + [𝑆]

Or, d’après le raisonnement développé à la fin de l’étape 1, k2[E]0=vmax.

On en déduit donc l’équation de Michaelis et Menten :

𝑣𝑚𝑎𝑥[𝑆]
𝑣𝑖 =
𝐾𝑀 + [𝑆]

À partir de cette équation, on peut déterminer la vi pour toutes les conditions initiales connues puisque
vmax et KM sont des constantes qui peuvent être déterminées expérimentalement (voir paragraphe suivant).

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vi ne dépend donc que de la concentration en substrat [S], valeur connue puisqu’il s’agit de la concentration
en substrat introduite par l’expérimentateur (rappelons que selon l’approximation 3, [S]=[S]0).

Note : en fait, cette équation est celle de Michaelis-Menten modifiée par Briggs et Haldane. Dans la
version initiale de Michaelis et Menten, le terme k2 était négligé. En effet, la dissociation du complexe ES
en E+S est beaucoup plus rapide que la réalisation de la réaction catalysée ES→E+P, ce qui revient à dire
que la constante k2 est très faible comparée à la constante k−1. De ce fait, la constante KS=k−1/k1
(correspondant à la constante de dissociation de [E][S]/[ES]) était utilisée en lieu et place de KM

3. La détermination graphique de la constante de Michaelis et de vmax

Pour déterminer les constantes KM et vmax, il faut faire une étude cinétique.

Figure 2 - Vitesses initiales en fonction de la concentration en substrat

La détermination graphique de l’asymptote, et donc de KM et vmax, est peu précise.

Une première méthode consiste à tracer le graphique représentant les vi en fonction de la concentration
en substrat [S] utilisé. D’après l’équation de Michaelis, on peut en effet déduire que vi se rapproche
asymptotiquement de vmax lorsque [S] augmente. Par ailleurs, lorsque [S]=KM, vi=vmax2. On peut donc
déterminer graphiquement vmax, puis KM (voir graphique 2). La difficulté vient du fait que la détermination
graphique d’une asymptote est une nécessairement imprécise, entachant d’erreur la détermination de KM et
vmax.

Pour améliorer la précision de la détermination graphique de ces deux constantes, il existe des
représentations graphiques qui linéarisent les résultats, permettant des extrapolations plus précises.

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Figure 3 - Représentation de Lineweaver et Burk

Chaque point correspond à une mesure de vi pour une concentration en substrat [S]
donnée. Les intersections avec les axes permettent de déterminer graphiquement KM et vmax.

La méthode la plus connue est celle de Lineweaver et Burk dans laquelle on représente
1 1
= 𝑓 ( ) (voir figure 3).
𝑣𝑖 [𝑆]

𝑣𝑚𝑎𝑥[𝑆] 1 𝐾𝑀+[𝑆] 1 𝐾𝑀 [𝑆] 1 𝐾𝑀 1 1


𝑣𝑖 = ⇔ = ⇔ = + ⇔ = +
𝐾𝑀+[𝑆] 𝑣𝑖 𝑣𝑚𝑎𝑥[𝑆] 𝑣𝑖 𝑣𝑚𝑎𝑥[𝑆] 𝑣𝑚𝑎𝑥[𝑆] 𝑣𝑖 𝑣𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑣𝑚𝑎𝑥

1 1 𝐾𝑀
On reconnaît une équation de droite de type =𝑎 + 𝑏, avec : 𝑎 = (ce qui correspond à la
𝑣𝑖 [𝑆] 𝑣𝑚𝑎𝑥
1
pente de la droite) et 𝑏 = (ce qui correspond à l’ordonnée à l’origine).
𝑣𝑚𝑎𝑥

Cette représentation permet donc, à partir des mêmes données que précédemment, de déterminer
graphiquement les valeurs de vmax et de KM plus précisément qu’avec la représentation précédente.

Il existe bien entendu d’autres traitements mathématiques permettant d’améliorer la précision de la


détermination de ces constantes et de nos jours les paramètres cinétiques sont déterminés par des méthodes
de régression non-linéaires beaucoup plus efficaces mais qui sont moins accessibles.

4. Conclusion

S’il existe bien des enzymes dont le mécanisme n’obéit pas strictement au schéma très simple des
enzymes michaeliennes, ce modèle permet d’obtenir au minimum une première approximation des
paramètres cinétiques que sont vmax et KM.

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Il faut aussi se rappeler que la mise au point de ce modèle et de l’équation associée, très simple à
résoudre, a permis d’accéder à ces données à une époque où l’outil informatique n’existait pas. Il était alors
beaucoup plus difficile d’approcher un résultat par de nombreux calculs.

De fait, il faudra attendre les années 1960 pour connaître une évolution conceptuelle aussi importante
dans le domaine de l’enzymologie avec la découverte de l’allostérie.

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