UNIVERSITE D’ALGER

FACULTE DE MEDECINE D’ALGER

LABORATOIRE DE BIOCHIMIE

METHODES DE DOSAGE DES PROTEINES

Présenté par : Dr S . HAMEDI

Encadrée par : PR YARGUI
 METHODES DE DOSAGE DES PROTEINES

INTRODUCTION

I. DOSAGES DES PROTEINES TOTALES

1) Méthodes anciennes
2) Méthodes densitométriques et réfractométrique
3) Méthodes colorimétriques
4) Méthodes turbidimétrique
5) Méthodes opacimétriques

II. DOSAGES SPECIFIQUE D’UNE PROTEINE DONNEE

1) Dosage de l’albumine par le vert de bromocrésol

2) Dosages des protéines par une propriété spécifique de celles-ci
3) Dosages immunochimiques

III. CONCLUSION
INTRODUCTION

De nombreuses méthodes ont été mises au point pour le dosage des protéines dans
un but diagnostic ou de suivi thérapeutique ; ce sont des méthodes basées sur les
déverses caractéristiques spectrales ou réactionnelles des acides aminés constituant
les protéines.
Ces derniers sont présents à des concentrations variables dans les différents
milieux biologiques (sang, urine, LCR, séreuse et tissus).
Le choix entre ces méthodes dépend d’un coté de la nature du milieu et donc de
la nature et la quantité des protéines présentes et d’autre coté des performances et
des limites des techniques disponibles.
 I. DOSAGE DES PROTEINES TOTALES

1) méthodes anciennes

a- Méthode de kjeldhal
b- méthode pondérale par gravimétrie
c- absorbation en UV a 280nm

2) méthodes réfractométrique et densitométrique

a- la réfractométrie :
L’indice de réfraction d’une solution de protéine est fonction de sa concentration
en macromolécule pour un milieu biologique de forte concentration en protéines.
L’indice de réfraction dépend essentiellement de la concentration en protéines ; de
nombreux composés présents dans le milieu modifient cet indice.
Inconvénients : elle exige un appareillage dont l’utilisation en biochimie clinique
est très limitée, méthode abandonnée.

b- la densitométrie
Principe : quand on laisse tomber une goutte de sérum dans une solution de sulfate
de cuivre, il se forme un coagulum a sa surface ; on apprécie la densité du sérum par
comparaison dans une gamme à la solution de sulfate de cuivre dont la densité est
comparable a celle du sérum.
Application : tolérable uniquement pour des sérums de composition protéique
proche de la normale et pour des conditions exceptionnelles de fonctionnement d’un
laboratoire.

3. méthodes colorimétriques
 Méthodes Principe Application Avantages Inconvénients

Mise en évidence par Le biuret qui est un

composé organique formé par la condensation Adaptée au dosage Méthodes Elle n’est pas
de deux molécules d’urée NH2-CO-NH-CO- des protéines rapide adaptée aux
NH2. plasmatiques Automatisabl faibles
liquide e concentrations
BIURET Il existe une analogie structurale entre le biuret d’épanchement de Simple
et la liaison peptidique concentration>12g/ l
gornal et al 1949 En milieu alcalin, les protéines qui possèdent intervalle de mesure :
au moins 2 liaisons peptidiques forment avec 8-12 à100-120g/l
les ions (Cu2+) un complexe bleu-violet dont
l'intensité de la couleur est proportionnelle à la
concentration en protéines. Un dosage
colorimétrique est donc possible à 540 nm. Le
réactif de coloration utilisé est le réactif de
Gornall

Lowry Le réactif phospho-tungsto-molybdique Cette méthode ne Meilleure

(réactif de FOLLIN-CIOCALTEAU) donne présente d’intérêt que sensibilité
Lowry et al une coloration bleue avec la plupart des pour un travail semi que pour la
(1951) protéines. L’addition au réactif de sulfate de quantitatif appliqué a méthode de
cuivre augmente considérablement la des protéines en biuret
sensibilité .ce complexe coloré absorbe à solution diluée
600nm Intervalle de mesure :
150-200 mg/l
 BCA L’acide bicinconique réagit avec les complexes Sensible
(Paul Smith de cu+2 et de protéine de façon très similaire à rapide
en 1985) la réaction de biuret il prend une coloration
pourpre typique

Technique Non
Cette technique utilisent le bleue de coomassie Elle détecte des simple et très automatisable
CBB/SDS G250, Qui se fixe sur les protéines et entraine protéines a des sensible Limite de
1976 bradford un déplacement du maximum d’absorbation de concentrations de limite de linearité1.5g/l
465 à 595nm l’ordre détection de
50mg/l(albumine l’ordre de
urinaire) 0.05g/l

Consiste a déposer sur un papier buvard une

petite quantité du liquide biologique.aprés Simple
AMIDOSCHW séchage les protéines sont colorées par une Urine, LCR sensible ne
ARTZ solution d’amidoshwart. les buvards son nécessite pas
ensuite décolorées par une solution de de
méthanol acetique.la coloration est comparée a photomètre
une gamme d’étalonnage sur papier
Limite de
ROUGE DE En milieu acide le complexe molybdate rouge Milieu biologique de détection Interférence de
PYROGALLOL de pyrogallol se fixe sur la fonction amine des faible concentration 0.05g/l l’hémoglobine
fujitat et al 1983. protéine en donnant une coloration bleue dont en protéine Bonne et du plasmion
watanab et al l’intensité est mesurée à 600nm et qui est linéarité
19Q86 proportionnelle a la concentration en protéine 5g/l
automatisab
le
4) Méthodes turbidimétrique
Principe : basé sur la précipitation des protéines par un réactif acide (acide sulfo-
salicylique 0 ,4 m , acide trichloracétique 3 % ) auquel on ajoute des substances (
polyethyleneglycol, polyvinylepyrrolidone) capable d’assurer l’homogénéité et la
bonne dispersion des micelles en suspension : puis on évalue la turbidité qui est
proportionnelle a la concentration en protéines .
Applications : LCR, URINES.
Avantages : rapide, sensible, simple.

5) OPACIMETRIE (REACTION DE FLOCULATION) :

Principe : après addition au sérum d’un réactif qui se veut spécifique il se forme
un trouble que l’on apprécie par mesure opacimétriques entre 630 –650nm.
Inconvénients : peu sensible, peu fiable, abandonnée.

II. DOSAGE SPECIFIQUE D’UNE PROTEINE DONNEE :

1) DOSAGE DE L’ALBUMINE PAR LE VERT DE BROMOSCRESOL

Principe : le vert de Bromocrésol forme avec l’albumine dans le tampon

succincte un complexe coloré. L’intensité de la coloration est proportionnelle à
la concentration de l’albumine dans le milieu, l’absorption est mesurée à 630
nm.
Application : sérum sanguin, LCR, liquide d’épanchement.
Sensitivité : 11,4 g/l, linéarité : 68 g/l .

2) DOSAGE DES PROTEINES PAR UNE PROPRIETEE SPECIFIQUE DE

CELLE-CI :

EXP : Orosomucoide : possède un point isoélectrique de 2,7 ; en électrophorèse

a PH=3,7 il possède une charge électronégative et migre vers l’anode, toutes les
autres protéines se déplacent vers la cathode une révélation par le réactif de
schiff après oxydation périodique permet de le doser.
Céruloplasmine : possède une propriété oxydasique que l’on peut mettre en
évidence par action sur la para phenylen diamine.
3) DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE :

Principe générale : fixation de l’anticorps spécifique sur l’antigène d’intérêt

puis révélation de la présence de cet anticorps.

3-1 Dosage par immuno précipitation :

3-1-1 Immuno-précipitation en phase solide :

3-1-1-1 Immun diffusion radiale de Mancini :

Principe : diffusion libre des antigènes dans le gel d’agarose imprégné par une
concentration connue d’anticorps spécifiques, semi quantitative.
Avantage : simple et pratique.
Inconvénients :
Longue 2 a 3 jours.
Nécessite plusieurs étalons.
Interprétation difficile
Constante sensibilité supérieur ou égale a 10 mg.
Applications : sérum humain. Urine. LCR.

3-1-1-2 Electro-immun diffusion de LAURELL :

Principe : le même que la précédente avec l’orientation de la migration des
antigènes par un courant électrique.
On obtient des précipités en formes de fusées ou en raquettes dont les hauteurs
est proportionnelle a la concentration en protéines semi quantitative.
Avantages : beaucoup plus rapide ( 3 a4 heures de migrations) et beaucoup plus
précise que l’immun diffusion.
Application : elle s’applique a de très faibles quantités de protéines (fig 1).
 3-1-1-3 Immuno-electrophoresebidimentionnelle :
Principe : on sépare les protéines par électrophorèse en gel d’agarose puis dans
une direction perpendiculaire a la precedente, on fait migrer les protéines
résultant de la première séparation dans un gel contenant les anticorps.
Chaque protéine se présente comme un cône de précipitation dont la taille est
sensiblement proportionnelle a la quantité de protéine présente.
Valeur qualitative supérieur a la valeur quantitative (figure 2).

3-1-1-4 Immuno-fixation (IFI) :

Association d’une électrophorèse de routine a une immuno-précipitation par
utilisation d’un immun sérum spécifique de chaque Ig .
La différence fondamentale avec l’immunoélectrophorèse réside dans la mise
en contact de l’antigène avec l’anticorps.
Dans l’IEP : l’Ag ne rencontre l’Ac qu’après diffusion dans l’agarose
Dans l’IFI : l’Ag est fixé a l’Ac au site de sa migration électrophorétique.

3-1-2 IMMUNO-PRECIPITATION EN PHASE FLUIDE

3-1-2-1 Turbidimétrie:
Repose sur la mesure de l’absorption apparent (densité optique) correspondant a
la formation des immune complexes, selon une technique au point final ou en
cinétique.
Avantages : adaptation possible sur de nombreux spectrophotomètres équipant
déjà les laboratoires.

3-1-2-2 Néphélémétrie :
Repose sur la diffusion de la lumière au contact des particules de l’immuno-
précipité.
Avantages : sensible, rapide , adaptable au grandes séries .
3-2 Technique d’agglutination :
Les réactions d’agglutination mettent en jeu un antigène situe a la surface d’une
particule de taille comprise entre la dixième et la dizaine de micron. C’est un
phénomène complexe au cours duquel les anticorps s’unissent aux antigènes
portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques permettant leur réunion
en amas .
On distingue deux types : Agglutination directe.
Agglutination indirecte.

3-3 Dosage immunochimique avec marquage :

3-3-1 Dosage radio immunologique RID:

Principe : basé sur la compétition des deux AC (ou Ag) pour un même Ag (ou
Ac) immobilisée sur une phase solide, l’un des Ac (ou Ag) est marqué par isotope
radioactif et permettant la mesure.

3-3-1 Dosage immuno-enzymatique E I D :

3-3-1-1 Non compétitif :

3-3-1-1-1 Méthode ELISA (enzyme linked immun sorbent assay) :

Dosage d’un Ag par ELISA sandwich :
L’antigène doit posséder deux épitope différents il est pris en sandwich entre 2
deux Ac.

Dosage d’un antigène par la méthode de double sandwich :

Dans ces cas la fixation de l’Ag est révélée grâce a un Ac anti Ig marqué qui se
lie sur l’Ac spécifique qui a reconnue l’Ag (figure 4).
Dosage direct d’un antigène (ELISA direct).
Consiste a fixer la totalité de l’Ag présent dans l’échantillon a doser sur la paroi
du tube ou de la cupule de réaction puis de révéler cet Ag par l’Ac marqué ou par
l’Ac spécifique lui-même révélé par un Ac anti Ac marqué (figure 5 et6 )

Dosage d’un Anticorps :

L’Ac a doser est pris on ’’ sandwich ’’ entre l’Ag et un Ac anti Ac marqué
(figure7).

3-3-1-1-2 Dosage immuno-enzymo-métrique (IEMA) :

L’Ag a doser est mis en présence d’un excès d’Ac marqué on met ensuite le
milieu en présence de l’Ag fixé sur un support solide de manière a révéler l’Ac
marqué qui ne s’est pas lie a l’Ag lors de la première étape ( figure 8 ).
3-3-1-2 Méthodes par compétition :

3-3-1-2-1 ELISA par compétition :

Vis-à-vis de l’Ac présent en quantité limitée, est fixé sur un support, il y a
compétition entre l’Ag a doser et l’Ag marquée (de même spécificité) ajouté en
quantité définie dans le même temps (figure 9).

Ces méthodes nécessitent une étape de lavage pour éliminer l’excès de marqueur
qui ne s’est pas fixer.

3-3-1-2-2 Méthodes EMIT (Enzyme multiplier immuns assay technique) :

L’enzyme marqueur est fixée sur l’haptène et la formation du complexe
Anticorps –haptène empêche l’accès du substrat au site actif de l’enzyme
entrainant ainsi l’inhibition de l’activité enzymatique au cour de la réaction
indicatrice l’activité de l’enzyme est mesurée par rapport a celle de conjugué
Antigène-enzyme non combiné a l’Ac (figure 10).

APPLICATIONS :
Dosage des protéines a faible concentration.
Recherche et dosage d’Ac pour le diagnostic de maladies infectieuses (sérologie).
Dosage de molécule de petite taille.

CONCLUSION

Le dosage des protéines constituent une source d’information très importante

parfois unique pour la biochimie clinique.
Les méthodes de dosage totales ou spécifiques basées sur les propriétés physico-
chimiques des protéines ont bénéficiée des progrès de l’électrophorèse,
chromatographie, et l’immunochimie, c’est ainsi que leur usage dépasse le
domaine routinier vers une nouvelle discipline : la protéomique.