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TD préparatoire aux TP de biochimie 2ème

série

1ère année IUT GB

Stéphane Goulaouic,
d’après Laurent Foucaud
Présentation des TP
Série de TP centrée sur les protéines
Caractérisation
Détermination de leur activité enzymatique

 5 séances de TP

TP tournants (sauf TP 3 : 1ère semaine)


Consignes pour les TP
Elles sont identiques à celles de la première série !

Il faut avoir étudié le protocole avant de venir

Indiquer les points essentiels sur son cahier de paillasse,

A chaque séance le matériel nécessaire est : cahier de


paillasse, calculatrice, papier millimétré

Une évaluation en cour de séance est réalisée par


l’enseignant, des erreurs graves de manip, un mauvais
comportant, un poste de travail et une salle sale
entraîneront un retrait de points
Consignes pour les TP
Les comptes rendus de la séance sont à rédiger
pour la séance suivante (aucun retard ne sera
accepté, sous peine de perte de points)  soit une
semaine

Dans le compte rendu il n’est pas nécessaire de


rappeler le protocole, on précise le but de la
manipulation et on apporte un soin particulier à la
présentation des résultats et à leur interprétation
TP 1 et 2 : Séparation et caractérisation

TP 1 : Techniques de chromatographie

TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse


TP 1 : Les techniques de chromatographie
 La chromatographie est une méthode d'analyse qui sépare les
constituants d'un mélange par entraînement à l'aide d'une phase mobile
liquide ou gazeuse (éluant) le long d'une phase stationnaire solide ou liquide
qui porte les solutés à traiter

 La vitesse de migration d’une substance est la résultante de 2 forces :


 migration due à la solubilité dans l'éluant
 rétention due à l'affinité dans la phase fixe

 La résultante de ces deux forces


Migration
étant variable selon le produit A B
concerné, celui-ci migrera donc à
une vitesse caractéristique Rétention
TP 1 : Les techniques de chromatographie

 Chromatographie sur couche mince (CCM)

 Repose sur des phénomènes d’adsorption :

 la phase mobile est un solvant ou un mélange de


solvants,
 elle progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur
une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de
matière plastique ou d’aluminium.
TP 1 : Les techniques de chromatographie

CCM

Couvercle
Front d’élution

Cuve Phase stationnaire

A B C X (plaque de silice)

Phase mobile
(solvant de migration)
TP 1 : Les techniques de chromatographie
 La phase mobile utilisée est la suivante :
 Buthanol 16 mL
 Acide acétique 8 mL
 Eau 4 mL
 Caractériser ce mélange
Le mélange est constitué de solvants organiques très
polaires (un alcool et un acide), ils vont donc facilement
entraîner les molécules hydrophiles notamment les
molécules polaires.
 Structure générale des acides aminés

- Molécule hydrophile plutôt polaire


- Caractère plus ou moins polaire en
fonction du radical
TP 1 : Les techniques de chromatographie
4 standards :
AA basique
L’acide aminé le
ionisable, il est
plus simple, il est
polaire
très polaire et petit
également mais
plus gros
Histidine
Glycine

La proline est un est très polaire


AA non polaire et avec une fonction
petit, c’est un cas acide
particulier (la supplémentaire,
coloration avec la cette fonction est
Proline ninhydrine est même ionisable.
différente des Acide glutamique
autres)
TP 1 : Les techniques de chromatographie
La gel filtration sur colonne

 Le gel est un séphacryl (polyholoside à très haut


poids moléculaire) qui gonfle en solution
 Il forme ainsi des mailles plus ou moins grosses de
tailles variables dans lesquelles les protéines vont
pouvoir circuler
 On sépare des molécules dans une certaine gamme
de poids moléculaire
 Si les molécules absorbent à une longueur d’onde
commune, on peut toute les mesurer au
spectrophotomètre cela permet d’identifier les
fractions qui contiennent les molécules séparées dans
chaque fraction
TP 1 : Les techniques de chromatographie

 Composés à séparer
 bleu Dextran (très grosse molécule 2000 kDa,
polysaccharide)
 hémoglobine (PM 68 kDa)
 catalase (PM 220 kDa)

 Quel sera le comportement du bleu Dextran dans la


colonne ?
 il ne va pas pénétrer dans le gel et donc il sortira très vite
 il permet donc d’évaluer le volume mort ou le volume d’exclusion
de la colonne (le liquide qui ne se trouve pas dans le gel)
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
 Principe

 L’électrophorèse permet de séparer les protéines d’un mélange


(en principe selon les charges sous l’effet d’un courant électrique)
 Dans le cas présent les protéines seront séparées en fonction de
leur masse moléculaire
 En comparant la migration d’un échantillon de protéines
inconnues avec celle d’un standard on peut déterminer la masse
moléculaire relative des protéines contenues dans l’échantillon

 Que signifie SDS - PAGE ?

 Sodium dodécyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis

 Il s’agit donc d’une électrophorèse dans un gel de polyacrylamide


(qui constitue un tamis moléculaire) en conditions dénaturantes
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
Effet du SDS et du β-mercaptoéthanol sur les protéines ?

Le SDS est un détergent, il dénature les protéines et les charge négativement


pour permettre une migration selon la taille et non pas la charge
Le β-mercaptoéthanol rompt les ponts disulfures. Le chauffage dénature aussi
les protéines

Les protéines sont dénaturées :


elles ont perdu leur structure
tridimensionnelle native

Les protéines n'ont plus de pont


disulfure : elles sont sous une
forme monomérique
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse
 Le gel de polyacrylamide est Pourcentage Gamme de
obtenu par polymérisation d'acrylamide séparation en
kDa
 Plus le pourcentage 7,5 45 - 400
d'acrylamide est élevé, plus 10 22 - 300
la densité des chaînes est 12 13 - 200
élevée et les mailles du
15 2,5 - 100
réseau sont serrées

En conséquence :
_
+ le % d'acrylamide est élevé, les molécules volumineuses peuvent migrer

moins
une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant que
sa masse molaire est élevée
TP 2 : Séparation de protéines par électrophorèse

Détermination de la masse molaire d'une protéine

mobilité relative =

distance de migration d'une bande


-------------------------------------------------

distance de migration du front


TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase

• But : étudier la cinétique de dégradation de l’eau oxygénée par la


catalase mais aussi d’évaluer l’influence de la concentration en
enzymes sur cette cinétique

 Les enzymes : des catalyseurs biologiques de réactions


biochimiques
 Vitesse initiale de réaction (apparition du produit) :

= k [S]
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
 Comment déterminer le temps de mesure d’une réaction enzymatique,
comment évolue la quantité de substrats au cours du temps ?
 Le corollaire comment évolue la quantité de produit ?

 Dans la grande majorité des cas, la


formation du produit est un
phénomène exponentiel d'où la
forme des cinétiques enzymatiques

 L'amortissement en fin de cinétique


résulte de la disparition du substrat
voire de l'accumulation du produit
et, en conséquence, de la
diminution de la vitesse de la
réaction enzymatique
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
 Comment déterminer le temps de mesure d’une réaction enzymatique,
Comment évolue la quantité de substrats au cours du temps ?
 Le corollaire comment évolue la quantité de produit

 La pente de la tangente à
l'origine de la cinétique (d[P] / α
dt) s'appelle la vitesse initiale
de la réaction enzymatique, vi
TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase

 Le substrat doit –il être limitant ou en excès pour déterminer l’activité


d’une enzyme ?

 Qu’en est-il en terme d’application analytique ?

Dosage de l’enzyme Dosage du substrat


substrat en excès substrat limitant

(mesure cinétique) (mesure en point final)


TP 3 : Dégradation de l’eau oxygénée par la catalase
Au préalable on vous demande :
• D’écrire la réaction de dégradation de l’eau oxygénée au cours du dosage
• Déduire la relation entre le volume de permanganate versé et la concentration
en eau oxygénée restante

 Vous devez donner les tableaux de résultats

 Un graphe de la concentration en eau oxygénée restante


en fonction du temps : il s’agit de traduire la consommation
du substrat par l’enzyme

 Dans un deuxième temps pour différentes concentrations


d’enzymes vous allez tracer sur un graphe la variation de
substrat en fonction du temps : il s’agit de traduire les
vitesses pour chaque quantité d’enzyme

 Enfin pour chaque quantité d’enzyme, on calcule la vitesse


et on traduit sur un graphe v= f(quantité d’enzyme)
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
 Si le produit d'une réaction enzymatique possède une propriété physico-
chimique qui permet de le quantifier au fur et à mesure qu'il est formé, on
peut suivre sa cinétique de formation
 Les conditions optimales pour
l’étude de la phosphatase
alcaline devront être
déterminées :
 vitesse initiale
 Vm et Km
 effet du pH
 Vm est la vitesse maximale de
l'enzyme dans les conditions de
l'expérience quand elle est saturée
en substrat
 Km est la concentration de substrat
qui permet d'obtenir la moitié de la
vitesse maximale. C'est aussi une
bonne approximation de l'affinité de
l'enzyme pour son substrat
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline

1
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline

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TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
TP 4 : Paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
 pH
 Aux valeurs extrêmes, il dénature, donc désactive la protéine en modifiant l’état
d’ionisation des chaînes latérales des acides aminés
 Aux valeurs intermédiaires, il influe sur l’activité en modifiant l’état d’ionisation des
acides aminés du site actif et celui du substrat
-> courbe en cloche, en général Vi max pour des pH voisin de la neutralité

 Température
 Accélère les réactions en fournissant l’énergie nécessaire au franchissement de la
barrière due à l’énergie d’activation
 Dénature progressivement (et désactive) les protéines (struct 2aire et 3aire )
-> courbe dissymétrique, la vitesse est multipliée par deux tous les 10 °C jusqu’à une
température optimale, puis diminue rapidement

 Les inhibiteurs
 Ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la stopper
TP 5 : Activité spécifique de la β -fructosidase

 Le but du TP est de déterminer l’activité spécifique de la β -


fructosidase, une enzyme qui catalyse la transformation du saccharose
dextrogyre en un mélange équimoléculaire de glucose et fructose qui
est lévogyre, ce qui lui a valu le nom de sucre inverti

 Mais aussi de tester l’effet d’un inhibiteur sur cette réaction enzymatique

 L’unité enzymatique est la quantité d’enzyme qui catalyse la


transformation de 1 micromole de substrat en une minute à 25°C
dans les conditions optimales de pH et de concentration en substrat. Si
on rapporte l’unité enzymatique à la masse de protéines (en générale
au milligramme), on a l’activité spécifique
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction
jusqu’à la stopper.
Réversibles
 Compétitifs = analogues structuraux du substrat
1. Les inhibiteurs compétitifs
 Ils se lient de manière réversible au site actif de l'enzyme et en bloquent
l'accès au substrat. Ils diminuent donc la concentration d'enzyme libre ([E]).
En général ils ressemblent chimiquement au substrat. D'ailleurs, si une
enzyme a plusieurs substrats possibles, ceux-ci peuvent aussi agir comme
inhibiteurs compétitifs réciproques.
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction
jusqu’à la stopper.
Réversibles
 Compétitifs = analogues structuraux du substrat

 Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site


2. Les inhibiteurs non-compétitifs
 Ils se lient de manière réversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et
n'en empêchent pas l'accès. Il s'agit donc d'inhibiteurs allostériques, c'est-
à-dire agissant à un autre (allo-) site.
 Le Km reste constant, mais il y a perte apparente de concentration
d'enzyme, donc réduction de vmax.
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction
jusqu’à la stopper.
Réversibles
 Compétitifs = analogues structuraux du substrat

 Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site

 Inhibiteurs mixtes
3. Inhibiteurs incompétitifs
Les facteurs influençant la réaction enzymatique
 Les inhibiteurs : ils ralentissent la vitesse de réaction jusqu’à la
stopper.
 Réversibles
 Compétitifs = analogues structuraux du substrat

 Non compétitifs = non analogues, se fixent sur un autre site

 Inhibiteurs mixtes

 Irréversibles = liaison covalente au groupe fonctionnel


indispensable à l’activité catalytique