UNIVERSIT DE NOUAKCHOTT FACULT DES SCIENCES ET TECHNIQUES DPARTEMENT DE BIOLOGIE

TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE STRUCTURALE

BIOLOGIEDEUXIME ANNE BIOLOGIE-GEOLOGIE

Elabor par : Ali O. Med Salem O. BOUKHARY Ahmedou OULD HOUMEIDA

2007-2008

SOMMAIRE

- Recommandations importantes - Verrerie et Matriel de laboratoire I. GLUCIDES

TP N 1 TP N 2 TP N 3 Caractrisation chimique des glucides Ractions furfuraliques Pouvoir rducteur des glucides Rduction de la liqueur de Fehling Pouvoir rotatoire des glucides

p.3 p. 4

page 5
p. 7 p. 9 p.11

II. ACIDES AMINES & PROTEINES

TP N 4 TP N 5 Dtermination du pHi de la glycine Dosage colorimtrique des protines

page 13
p. 14 p. 16

III. LIPIDES
TP N 6 Indice de saponification dun corps gras (huile de ricin)

page 18
p. 20

IV. ACIDES NUCLEIQUES

TP N 7 TP N 8 Extraction de lADN doignon Proprits physicochimiques des acides nucliques - Spectre dabsorption

page 22
p. 25 p. 28

I. Recommandations gnrales 1. les tudiants travaillent par binme 2. le port de la blouse pendant toute la sance de TP est obligatoire 3. Il est indispensable de prparer la sance de TP : lire attentivement le texte du fascicule correspondant la manipulation du jour. 4. Chaque binme est tenu de nettoyer sa paillasse la fin de chaque sance. II. Prcautions prendre 1. Ne pas souffler les ractifs en introduisant dans les flacons des pipettes sales 2. Reboucher les flacons immdiatement aprs usage et les remettre leur place 3. Ne jamais pipeter les ractifs toxiques ou corrosifs (acides et bases forts et solvants organiques) directement avec la bouche. Utiliser pour cela une propipette. 4. Ne pas remplir les burettes directement avec les grands flacons de ractifs. Utiliser un petit becher. 5. Ne pas fermer lorifice de la pipette avec la pouce mais avec lindex. 6. Rserver, la fin de la sance, 10 minutes pour le rangement et le nettoyage de la paillasse. 7. Rincer les pipettes leau distille et les poser inclines sur le bord du plateau. 8. Vider la burette et la remplir deau distille. 9. Laver la verrerie avec de leau savonneuse (bchers, erlens, tubes essai) et la rincer leau distille. 10. Essuyer la paillasse avec une ponge propre. 11. Ne pas jeter de papiers ni de ractifs dans les viers. III. Recommandation pour la rdaction de votre compte-rendu Le compte-rendu que vous devez obligatoirement remettre lenseignant la fin de chaque sance constitue lessentiel de ce sur quoi vous serez not. Il devra comporter en haut et gauche de la premire page les noms et prnoms, le numro de la carte dtudiant, lanne dtude, le sous-groupe ainsi que la date et le titre de la sance. Vous devrez galement apporter un grand soin la rdaction de votre compterendu, dont le plan est prdfini par les questions que vous trouverez la fin de chaque manipulation propose. Lvaluation du compte-rendu matrialise par la note/20- obira aux critres suivants : 1. Rpondre aux questions poses dans lordre propos 2. apporter des rponses prcises, claires et concises (Ex. si on vous demande dcrire le but et le principe dune manipulation, vous rechercherez dans lintroduction ce qui rpond exactement cette question- tout autre dtails superflus sera sanctionn !3. Il sera tenu compte dans la note du soin que prendra ltudiant pour manipuler et ranger sa paillasse ainsi que pour la prsentation de son compterendu.

Verrerie et matriel de laboratoire:

becher

ballon

Tube essai Bec bunsen Ampoule dcanter

propipette

Pince

Pipett e

Fiole jauge

Pilon

Burette Rfrigrant
Pompe crmaillre

Fiole vide

I. Glucides

Introduction : Les sucres, encore appels glucides ou hydrates de carbone Cn(H2O)n, sont des composs comportant de nombreux groupements hydroxyles (-OH) responsables de leur caractre trs hydrophile. La prsence de groupement carbonyle (-C = O), aldhyde ou ctonique leur confre un caractre rducteur. Ils peuvent tre diviss en deux groupes : 1. Oses ou monosaccharides : Ils ne peuvent tre hydrolyss en sucres plus simples. Suivant le nombre de leurs atomes de carbone on trouve : trioses, tetroses, pentoses, hexoses. Tous les oses naturels sont de la srie D. Ex. Hexoses : le D-glucose sont nantiomre est le L-glucose
CHO CHO HO H2C O (HOH) CH2OH CH2OH

D-glucose L-glucose Reprsentation linaire de Fischer

D-glucopyranose Reprsentation cyclique de Haworth

2. osides ou polysaccharides : Ils se forment par lenchanement de plusieurs oses. Selon le nombre doses on peut les diviser en : o Holosides : forms dun nombre doses gnralement infrieur a 10. Les plus important sont les disaccharides exemple : maltose, saccharose, lactose. Le raffinose est un trisaccharides
HOH2C O 1 O HOH2C O 2 CH2OH

Le saccharose ou -D-glucopyranosyl 1 2 -D-fructofuranoside

o Polyholosides : constitus dun nombre doses important pouvant atteindre les centaines. Exemple : Glycogne, amidon , cellulose.

Structure du glycogne

TP N : CARACTERISATION CHIMIQUE DES GLUCIDES 1 I. Ractions furfuraliques 1. Principe : En milieu fortement acide et chaud, les oses ayant au moins 5 atomes de carbones subissent une dshydratation et se transforment en furfural (si lose est un pentose) ou en un driv du furfural (si lose est un hexose).
C OH H H 2 H 5 C C 1 H H OH OH C O H4 C
3 OH

CH

CH C O C O

Milieu acide chaud

CH H

+ 3H2O

Aldopentose

Furfural

H 4 C
6

HO H2C

C OH H H 2 5 H C C 1 H C OH OH O

3 OH

CH

CH C O C O

Milieu acide chaud

HO H2C
5

+ 3H2O
H

Aldohexose

5-hydroxymthyl-furfural

Le furfural et ses drivs peuvent se condenser avec des substances telles que les phnols, les amines aromatiques pour former des produits colors caractristiques. 2. Matriel - tubes essais - bain marie bouillant - pipettes - propiettes ou poires daspiration 3. Ractifs - solutions de glucose, fructose, mannose, ribose, saccharose et lactose 1% dans leau distille. - HCl concentr - HCl 1N - H2SO4 concentr - Lugol (mlanger 1g diode avec 2g dIodure de potassium dans 100 ml deau distille) - Ractif de Molisch (2 g -naphtol + 100 ml Ethanol) - Ractif de sellivanoff (2 g rsorcinol + 0,5 ml H2SO4 concentr + 100 ml H2O) - Ractif de Bial (0,2 g dorcinol + 100 ml HCl concentr + 5 gouttes FeCl3 10%)

4. Modes opratoires : 4.1- Raction de Molish : Cest une raction gnrale a tous les sucres (oses ou osides). En prsence dacide sulfurique, les sucres forment un driv furfural qui se condense avec lalpha naphtol pour donner un produit color en violet. Mode opratoire (manipuler sous la hotte). 1. Prparer 4 tubes essai : mettez dans le premier tube 2 ml dune solution de glucose, dans le deuxime tube 2 ml de solution de fructose, dans le troisime tube 2 ml de solution de saccharose et dans le quatrime tube 2 ml deau distille. 2. ajouter chaque tube 2 3 gouttes de ractif de Molish
3. Agiter les tubes pour mlanger le contenu 4. Couler doucement le long de la paroi de chaque tube 2 ml de H2SO4 concentr 5. Observer et noter la coloration obtenue

4.2-Raction de Selivanoff : Cette raction est caractristique des ctoses qui, en prsence dacide chlorhydrique concentr et chaud, se condensent avec le rsorcinol pour former un compos rouge. Mode opratoire. (Manipuler sous la hotte). 1. Prparer 4 tubes essai : mettez dans le premier tube 2 ml dune solution de fructose, dans le deuxime tube 2 ml de solution de mannose, dans le troisime tube 2 ml de solution de saccharose et dans le quatrime tube 2 ml deau distille. 2. Ajouter chaque tube 2 ml du ractif de Selivanoff 3. Ajouter chaque tube 1 ml dHCl concentr 4. Chauffer les tubes pendant 5 min au bain marie bouillant et laisser refroidir 5. Observer et noter les colorations obtenues. 4.3- Raction de Bial Cette raction est spcifique des pentoses. En milieu HCl concentr et en prsence dions Fe+3, les pentoses se condensent avec lorcinol pour former un compos de coloration verte. Mode opratoire. 1. Prparer 3 tubes essai : mettez dans chaque tube 1 ml de ractif de Bial (sous hotte). 2. Ajouter dans le premier tube 1 ml de solution de mannose, dans le deuxime tube 1 ml de solution de ribose et dans le troisime 1 ml deau distille. 3. Porter les tubes bullition 4. Observer et noter les colorations obtenues 4.4- Raction liode : Le lugol ou leau iode (I3-) se fixe sur les chanes polysaccharidiques pour donner des complexes colors. La raction du lugol avec le glycogne donne une coloration brune alors quon obtient une coloration bleue-noir avec lamidon. Mode opratoire. 1. Prparer 4 tubes essai : mettez dans le premier tube 2 ml dune solution inconnue A, dans le deuxime tube 2 ml de solution de mannose, dans le troisime tubes 2 ml de solution inconnue B et dans le quatrime 2 ml deau distille. 2. Ajouter 1 ml dHCl 1N chaque tube

3. Ajouter 1 2 gouttes du lugol dilu 4. Observer et noter les colorations obtenues

Questions : Justifier vos observations dans chacun des tests 1, 2 et 3 : Coloration de lanneau dans la raction de Molish (rouge violace) Coloration obtenue dans la raction Selivanoff. Coloration observe dans la raction de Bial En prcisant pour chaque test sil sagit dun pentose ou hexose, dun ctose ou aldose. Dans le test 4, Identifiez la nature du polysaccharide dans les solutions A et B. Justifier.

TP N Pouvoir rducteur des glucides (Rduction de la liqueur de FEHLING) 2. 1. Principe : En milieu alcalin et chaud, les oses et dans certaines conditions les polyholosides peuvent soxyder et en mme temps rduire des substances telles que les sels mtalliques. On parle alors de pouvoir rducteur des sucres. Cette proprit, qui est due la prsence de fonction hmi-actalique libre, peut tre mise en vidence par exemple grce au ractif de Fehling qui est une solution alcaline dions cuivreux de coloration bleue (les ions Cu+2 sont maintenus en solutions grce au double tartrate de Na+ et K+). Si la raction est positive, on obtient un prcipit rouge brique dont la quantit est proportionnelle a celle du sucre rducteur prsent. Glucides rducteurs 2 Cu+2 + 2OH- + 2eproduits doxydation + neCu2O
Prcipit rouge brique

+ H2O

Si le sucre nest pas rducteur, la coloration reste bleue. 2. Matriel : - Tubes a essai, pipettes, propipettes, papier indicateur de pH, bain marie bouillant. 3. Ractifs : - Liqueur de Fehling : La liqueur de Fehling est obtenu en mlangeant V:V deux solutions A et B dont la composition est la suivante : Solution A : 35 g CuSO4.5H2O + 5 ml H2SO4 concentr + H2O complter 1L. Solution B : 150 g tartrate de K et Na + 300 ml NaOH pure + H2O complter 1L - Solutions de Glucose, fructose, ribose, saccharose et maltose 1% - NaOH 10% - H2SO4 concentr 4. Mode opratoire 1. Prparer 6 tubes essai : mettez dans chaque tube 1 ml de la solution A puis 1 ml de la solution B. (A+B forment la liqueur de Fehling). 2. Ajoutez au premier tube 2 ml dune solution de glucose, au deuxime 2 ml de solution de ribose, au troisime 2 ml de solution de fructose, au quatrime 2 ml de

solution de saccharose, au cinquime 2 ml de solution de maltose et au sixime 2 ml deau distille. 3. Agiter pour bien mlanger le contenu des tubes 4. Porter les tubes bullition pendant 3 min 5. Observer et noter le rsultat obtenu. Pouvoir rducteur du produit dhydrolyse chimique du saccharose : Mode opratoire Mettre 5 ml de saccharose dans un tube essai. Ajouter 3 gouttes de H2SO4 concentr (sous la hotte). Agiter et porter bullition pendant 2 min. Le saccharose est ainsi hydrolys. Ajouter 5 gouttes dune solution de soude 10% jusqu raction nettement alcaline (utiliser papier indicateur de pH). Raliser alors le test suivant : prendre deux tubes et les marquer 1 et 2. Dans le tube 1 mettre 2 ml de la solution de saccharose hydrolys. Dans le tube 2 mettre 2 ml de la solution de saccharose non hydrolys. Dans les deux tubes 1 et 2 ajouter : 1 ml de la solution A 1 ml de la solution B Agiter et porter les deux tubes au bain marie bouillant pendant 3 min. Observer la coloration obtenue dans chaque tube. Questions : Comparer et justifier la diffrence des rsultats obtenus avec les tubes 1, 2, 3, 4, 5 et 6 dans la partie. Comparer et justifier les rsultats obtenus avant et aprs lhydrolyse chimique du saccharose. Citez un autre protocole dhydrolyse du saccharose.

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TP N 3.

POUVOIR ROTATOIRE DES SUCRES : MISE EN EVIDENCE DE LACTIVITE OPTIQUE DUNE MOLECULE CHIRALE

1. Introduction : Toute molcule qui possde un carbone asymtrique (carbone li quatre substituant diffrents) est dite chirale. Elle existe alors sous deux configurations symtriques (par rapport a un miroir) non superposables dites nantiomres qui reprsentent deux structures isomres relles dans la nature. Toute molcule chirale est optiquement active. On dit encore quelle possde un pouvoir rotatoire : travers par un faisceau de lumire polarise plane, cette molcule provoque une rotation du plan de polarisation de cette lumire dun angle donn. Le pouvoir rotatoire qui est une valeur spcifique est calcul comme suit :

[] =

______ C x l

[] = pouvoir rotatoire spcifique en degrs = angle de rotation de la lumire polarise en degrs l = longueur du trajet optique (dm) C = concentration de la solution chorale (g/ml) La mesure de langle de rotation se fait a 20C en utilisant la raie de Na comme source lumineuse. Lappareil utilis pour mesurer le pouvoir rotatoire est appel polarimtre. Il peut tre manuel ou digital mais le principe est le mme : * Une source de lumire qui est ici une lampe de sodium (lumire monochromatique de longueur d onde =589.5 nm : raie D) * Un prisme polariseur * Un tube polarimtrique qui contient la substance analyser * Un second prisme analyseur que lon tourne en tournant un cercle gradue en degr
filtre

Lampe Na

prisme polariseur tube polarimtrique

prisme analyseur

lentille

il

Schma dun polarimtre

2. Matriel et ractifs - Polarimtre - Tube de polarimtre - Solution de glucose 10%

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3. Mode opratoire : Rglage du zro Allumer la lampe de Na 10 min environ avant utilisation Remplir le tube polarimtrie avec leau distille (solvant utiliser) et sassurer de labsence de bulles d air. Rgler le zro du polarimtre : Regardant dans lobjectif; on observe un cercle avec deux zones de diffrente intensit lumineuse : une zone claire et une zone sombre. Ou bien

Le rglage se fait en tournant le cercle gradu, tout en observant le cercle lumineux, jusqu ce que les deux zones soient de mme intensit : zone de pnombre gale.

Noter langle sur le cercle gradu. Vider alors le tube polarimtrique et prparer rapidement une solution de -D-glucose a 10%. Remplir le tube polarimtrique avec cette solution. Lintroduction de la solution optiquement active va perturber luniformit de la zone de pnombre : tourner alors le cercle gradu jusqua rtablissement de luniformit des zones. Lire langle sur le cercle gradu. Il correspond langle de dviation de la lumire polarise par la solution de glucose. Attendre 10 min et mesurer encore langle de dviation comme dcrit cidessus. (Aprs rtablissement de luniformit des zones). Continuer lire et noter (dans le tableau) la valeur de langle de dviation de la lumire polarise jusqu stabilisation de cette valeur : quilibre. En dduire le pouvoir rotatoire a lquilibre de la solution de glucose. Expliquer le changement de langle de dviation au cours du temps puis la stabilisation de cette valeur. Comment appelle-t-on ce phnomne ? Prsenter selon Haworth les structures anomriques du Glucose prsentes lquilibre. Temps (min) Angle de dviation () 10 20 30 40

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II. Acides amins & Protines

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Rappel thorique : Les protines sont des macromolcules constitues dacides amins lis les uns aux autres par des liaisons amides substitues appeles liaisons peptidiques.
R1 CH NH C O NH CH R2 O C NH R2 CH C O

Liaison peptidique Les acides amins constitutifs (20 a.a frquemment rencontrs) de formule gnrale H2N CH COOH

R Possdent tous ( lexception de la proline) au moins deux fonctions caractristiques : carboxylique -COOH et amine -NH2. Certains acides amins possdent en plus dans le radical R dautres groupements ionisables (Asp, Arg, Glu, Lys, Tyr ). Gnralement une squence peptidique possde deux extrmits libres -NH2 et -COOH. Par convention, cette squence scrit en plaant gauche lextrmit -NH2 et droite lextrmit terminale -COOH.

TP N : DETERMINATION DU pHi DE LA GLYCINE 4

Les acides amins en solution sont toujours sous formes charges. Cette charge dpend du pH, de la force ionique et des constantes de dissociation de leurs fonctions. En milieu acide ces composs amphotres gagnent des protons. La fonction -CCOH qui a la constante de dissociation la plus forte donc le pK le plus bas, va sioniser la premire. LAA portera la fois la charge positive et ngative. Au moment o les charges + et squilibrent, le pH du milieu correspond au point isolectrique (pHi). En milieu basique, lAA perd un proton et sera charg ngativement. 1- Cas dun acide amin neutre : ex. la glycine (Gly)
H H3N CH H COOH H H2N CH COO

ka

+ H3N CH COO

kb

forme cation = A+ (zone de pH acide) charge nette = +1

ion mixte = A ion dipolaire ou Zwitterion charge nette = 0

forme anion = A(zone de pH basique) charge nette = -1

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On dfini par pH isolectrique, pHi, le pH pour lequel la charge nette de la molcule est nulle c'est--dire le pH auquel va prvaloir la forme ion dipolaire ou zwitterion A. On calcule ce pH partir des constantes de dissociation ka et kb des fonctions ionisables. Do : pHi = pka + pkb 2 2. Cas dun acide amin acide : ex. lacide aspartique (Asp) COOH COOH COO
CH2 H3N CH

COO

COOH

ka

CH2 H3N CH

COO

Kr

CH2 H3N CH

COO

Kb

CH2 H2N CH COO

Forme cation = A+ Charge nette= +1

ion mixte = A charge nette= 0

forme anion 1= Acharge nette= -1

forme anion 2= A-charge nette= -2

pHi = pka + pkr 2 3. Cas dun acide amin basique : ex. la lysine
H3N

+ Ka

H3N

+ Kb

H3N

+ Kr

H2N (CH2)4 H2N CH COO

(CH2)4 H3N CH

(CH2)4 H3N CH

(CH2)4 H2N CH COO

COOH

COO

Forme cation 1 = A++ Charge nette= +2

forme cation 2= A+ charge nette= +1

ion mixte= A charge nette= 0

forme anion = Acharge nette= -1

pHi = pkb + pkr 2 1. But: Dtermination des pk et du pHi de lacide amin, glycine ou glycocolle (Gly) 2. Principe : Il sagit de suivre lvolution du pH sur un volume dtermin dune solution dAA de pH gale 2, en fonction de la quantit de NaOH ajoute. 3. Matriel et ractif : - pH mtre - Agitateur, barreau aimant - Burette - Bechers - Solution NaOH 0,2N - Solution de glycine 20mM (0,02M) - Solution dHCL 2N

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4. Mode opratoire : - Pour la mise en route demand au technicien * Attention : Les lectrodes sont trs fragiles et coteuses Prire : - de ne pas laisser le barreau aimant les heurter pendant lagitation - de ne pas les laisser sec - de bien les rincer avant et aprs la titration avec de leau distille Mesurer 50 ml de la solution dAA laide dune prouvette Verser la solution dAA dans un bcher de 100 ml Aprs talonnage du pH mtre, rincer llectrode du pH mtre leau distille, et la placer dans le bcher contenant la solution dAA - Mesurer le pH de dpart de la solution et le ramener pH 2 avec quelques gouttes dHCl 2N - Mettre dans la burette la solution de NaOH 0,2N - Titrer la solution dacide amin en ajoutant la solution de soude par additions successives de 0,5 ml tout en agitant. - Pour chaque volume de soude ajout, noter ce volume et noter la valeur du pH correspondante et ce jusqu pH 10,5.
-

5. Exploitation des rsultats - quappelle-t-on le pH isolectrique de lacide amin en solution ? - tracer la courbe de titration pH = f (VNaOH) - dterminer partir de cette courbe les diffrentes valeurs de pK et le pHi de cet acide amin.

TP N 5. DOSAGE DES PROTEINES PAR LA METHODE DU BIURET

1. Principe : La Biuret rsulte de la condensation de 2 molcules dure avec dpart dammoniac.

NH2

2O C
NH2

NH2

CO

NH

CO

NH2

NH3

La Biuret ragit en milieu alcalin avec le CuSO4 en donnant une coloration violette dont le maximum dabsorption est 540 nm. Par suite de leur analogie de structure avec la Biuret, Les peptides et les protines donnent la mme raction. La zone dutilisation est de 1 20 mg/mL

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2. Matriel et ractifs : - Spectrophotomtre 540 nm - Eau physiologique : solution contenant 9g de NaCl dans 1L deau distille - Solution standard dovalbumine 10 mg/mL dans de l'eau physiologique - Solution inconnue dovalbumine (nous utiliserons un blanc duf) - Ractif de biuret : - CuSO4, 5H2O : 1,5g - NaOH : 300 mL 10% - KI : 1g - Tartrate double de Na et K : 6g - H2O Q.s.p 1L (Q.s.p = Quantit suffisante pour) - tubes essai de 15 ml - Pipettes (1ml, 2ml, 5ml) - Portoirs pour 10 tubes essai 3. Mode opratoire 3.1. Prparation de la solution inconnue dovalbumine Peser un blanc d'uf. Noter sa masse Mettre le blanc duf en solution dans 1L deau physiologique 3.2. Prparation dune gamme talon dovalbumine - A partir de la solution talon d'ovalbumine 10 mg/mL, raliser une gamme de 6 tubes (tubes 1-6) contenant de 2 10 mg d'ovalbumine par tube. - Prparer en mme temps les tubes exprimentaux qui contiendront une prise dessai de solution inconnue dovalbumine (tubes 7-8).
tube N 1 Solution standard dovalbumine 0 10mg/mL (ml) Solution inconnue dovalbumine (ml) Eau physiologique (ml) Ractif du Biuret (ml) Lire les D.O 540nm 1 2 0,2 3 0,4 4 0,6 5 0,8 6 1 0,4 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,6 0,8 0,2 7 8

4 ml dans chaque tube essai

Attendre 10 min lobscurit temprature ambiante

4. Rsultats exprimentaux: 4.1. Etablir un tableau complet de colorimtrie: N de tube, composition des tubes, Absorbance, quantits et concentration en ovalbumine par tube. 4.2. Tracer, sur papier millimtr, la courbe d'talonnage : A = f(quantit de protines/tube) 4.3. En dduire la concentration en protines (en g/L) dans la solution de blanc duf puis en dduire la teneur en protines pour 100 g de blanc duf.

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III. Lipides

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Introduction Les lipides sont en gnral des esters dalcool et dacides gras. La nature de lalcool est variable et les acides gras sont saturs ou insaturs, parfois substitus par de lacide phosphorique et une base azote (phospholipides). Les graisses sont gnralement riches en acides gras saturs et les huiles en acides gras insaturs. Ce sont les longues chanes paraffiniques des acides gras qui confrent aux lipides leur insolubilit dans leau et leur solubilit dans les solvants organiques.
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H3 C H3 C

CH2 CH2

CH2

CH2 CH2

CH2

CH2

CH2

CH2 1

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

COOH

Acide gras satur

COOH Acide gras monoinsatur

Les lipides neutres les plus abondants sont les acylglycrols (anciennement appels glycrides), ce sont des substances de rserve essentiellement constitues de triacylglycrols. Les triacylglycrols rsultent de lestrification dun trialcool, le glycrol, par 3 acides gras qui sont diffrents dans la plupart des cas (triacylglycrols htrognes). Il y a des exceptions de triacylglycrols homognes tel que la triricinoline (esters de glycrol et dacide ricinolique) composant lhuile de ricin.

CH2 CH CH2

OH

OH
OH OH

3 ( HOOC- (CH2)7 - CH = CH CH2- CH - (CH2)5 - CH3 ) Acide 12-hydroxy-9-octadcnnoque ou acide ricinolique

Glycrol

O CH2 O C O CH O C O CH2 O C

OH (CH2)7 - CH = CH CH2- CH - (CH2)5 - CH3 OH (CH2)7 - CH = CH CH2- CH - (CH2)5 - CH3

+ 3 H2O

OH (CH2)7 - CH = CH CH2- CH - (CH2)5 - CH3

Triricinoline

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TP N IDICE DE SAPONIFICATION DUN CORPS GRAS 6. 1. But A partir de lindice de saponification, on dtermine le poids molculaire de la triricinoline, triacylglycrol majeur de lhuile de ricin. 2. Principe de la raction de saponification En milieu chaud et fortement basique les triacylglycrols librent le glycrol et les sels alcalins dacides gras (acides starique, olique, palmitique) appels savons.
CH2 CH CH2 O O O CO CO CO R1 R2 R3

R1 COOK

CH2

OH OH OH

+ 3 KOH

R2 COOK R3 COOK

CH CH2

triacylglycrol

Sels dacides gras

Glycrol

La raction de saponification se droule en prsence dun excs de KOH, non entre en raction et dos par une solution acide (dosage en retour). La potasse consomme par lhuile est calcule par rfrence un tmoin et permet de dterminer le poids molculaire du triacylglycrol. 3. Matriel et ractifs - 2 ballons saponification de 250 ml - Rfrigrant ascendant - Huile de ricin - Potasse alcoolique 0,2M dans lthanol - Acide sulfurique 0,25N, phnol phtaline 4. Mode opratoire - Choisir 2 ballons saponification, qui sadaptent au bouchon du rfrigrant. Ballon saponification 1 - Peser le ballon saponification - Introduire laide de la pipette de 1 ml, 0,5 ml dhuile de ricin et repeser, dterminer m : la masse dhuile. - Ajouter 10 ml de KOH alcoolique la pipette, agiter - Brancher le ballon saponification au rfrigrant (celui-ci permet de condenser les vapeurs mises lors du chauffage de la solution). - Brancher la circulation deau froide - Chauffer modrment pour amener la solution alcoolique bullition douce, poursuivre la saponification 30 minutes. Agiter frquemment. - Retirer le ballon et le refroidir sous un courant deau de robinet Ajouter 5 gouttes de phnol phtaline et doser la potasse en excs par H2SO4 0,25N = V1

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Ballon saponification 2 (tmoin)

-

Verser la mme quantit de KOH alcoolique Chauffer une demi heure sous rfrigrant Ajouter 5 gouttes de phnol phtaline Doser la potasse par lH2SO4 0,25N = V2

4. Rsultats
-

Dterminer le PM de la triricinoline.

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IV. Acides nucliques

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Introduction : Les acides nucliques sont des polymres de nuclotides. Ils jouent un rle important dans le support et le transfert de linformation gntique. Ce sont des macromolcules pouvant atteindre une taille trs leve ex : lADN de la bactrie Escherischia coli un PM = 2x109 Daltons et dpasse le millimtre pour une cellule qui na que 1 2 de diamtre. Composition chimique des acides nucliques Les acides nucliques sont constitus de D-pentose, de bases et de phosphore. - Le D-pentose peut tre le D-ribose ou le D-dsoxyribose. Ce qui a permis de distinguer deux grandes classes dacides nucliques : 1. Les acides ribonucliques (ARN) 2. Les acides dsoxyribonucliques (ADN) - Les bases : sont au nombre de quatre pour chaque classe dacide nuclique. - 2 bases puriques (adnine et guanine) communes lADN et lARN - 2 bases pyrimidiques (cytosine, thymine pour lADN ; cytosine et uracile pour les ARN) Lassociation dun pentose avec une base constitue un nucloside. La liaison covalente qui stablie entre le C1' du pentose et lazote N1 des pyrimidines ou N9 des purines est de type N-osidique

H2C

Liaison N-osidique

H2C

Liaison N-osidique

Un nucloside : 2'- dsoxyadnosine

Un nucloside : 2'- dsoxythymidine

Lestrification dun nucloside par lacide phosphorique conduit un nuclotide. La premire molcule dacide phosphorique estrifie le nucloside essentiellement sur le C3' ou le C5'. On parle alors de nucloside 3 ou 5 monophosphate. Exemple :

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La fixation dune deuxime puis dune troisime molcule dacide phosphorique se fait par une liaison pyrophosphate riche en nergie. Ce qui aboutit des nuclosides di et tri phosphates. Exemple ladnosine-5-triphosphate.

Dans les cellules, les acides nucliques rsultant de lassociation covalente de nuclosides-5monophosphate : un pont phosphodiester stablit entre le OH libre en position C3 du 1er nuclotide et lacide phosphorique fix en C5 du second nuclotide. Cette opration se rptant successivement aboutit la formation dune longue chane nuclotidique ayant une extrmit 5-phosphoryle ou libre et une extrmit 3-OH libre.

T OH 3

Pont phosphodiester

P 5

Dans les manipulations qui suivent nous nous proposons 1/ dextraire lADN partir dun tissu biologique. Voici, titre indicatif, un tableau donnant les teneurs de quelques organes et microorganismes en acides nucliques (en g pour 100 g de matire sche)

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Pancras Thymus Foie Reins Rate Cerveau Muscle E. coli Staphylococcus Levure (boulangerie)

ADN 1,9 12,3 1,3 2 7 0,8 0,3 4,2 2,8 0,3

ARN 8 2,2 2,7 2 2,6 0,8 0,2 9,7 8,8 4

2/ dtudier une des proprits physicochimiques : labsorption dans lultra-violet. 7. TP N EXTRACTION DE LADN 1. But Extraire lADN partir de tissus animaux ou vgtaux (testicules dagneau, thymus de veau, oignon), pour en tudier les constituants. 2. Matriel et ractifs 2.1. Matriel testicule dagneau ou oignon - couteau - mixer Waring blendor - glace pile grand entonnoir - gaze pansement - prouvettes de 250 et 100 ml un erlen de 100 ml + bouchon - centrifugeuse + tubes centrifuger - une pipette pasteur strile 2.2. Ractifs : - Tampon dextration pH 7,5 : Tris-HCl 0,02M ; NaCl 1% ; Citrate de Na 0,02M ; EDTA dissodique 2mM. - SDS (Sodium dodcyl sulfate) 10% - NaCl 6M - Ethanol absolu (95) plac au conglateur - Solution de rinage : Ethanol 70% - Tampon SSCx1 : tampon sodium citrate salin : 150mM NaCl et 15mM citrate de sodium : dissoudre 8,75 g de NaCl et 4,4 g de citrate de sodium dans 900 ml deau distille. Ajuster le pH 7 avec du HCl 1M et complter 1 litre.
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3. Mode opratoire a) Homognisation Pour 4 binmes, peser (10 g de testicules de veau ou 1 oignon) et 40 g de glace pile, mettre le tout dans le mixer en y ajoutant 65 ml de tampon dextraction. Broyer pendant 1 2 min vitesse rduite. - Filtrer la suspension au travers dune double couche de gaze laide de lprouvette de 250 ml et du grand entonnoir. - Partager le filtrat en quatre volumes gaux dans 4 prouvettes de 100 ml (1 par binme).
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Noter le volume du filtrat obtenu par binme = V1. Transvaser le contenu dans un erlen de 100 ml

b) dprotinisation - Au volume V1 ajouter un volume de SDS 10% de manire obtenir une concentration finale en SDS gale 1% (faite le calcul au pralable). - Boucher lerlen, agiter vigoureusement pendant 5 min. - Ajouter dans lerlen un volume de NaCl 5M de manire obtenir une concentration finale en NaCl gale 1,3M. Agiter fortement (Vortex). - Centrifuger le contenu de lerlen pendant 10 min 3000 rotation par minute (rpm) - Rcuprer le surnageant contenant lADN et noter son volume V2. Jeter le culot. c) prcipitation de lADN - Au mme volume V2 du surnageant ajouter doucement le long de la paroi du tube, 2 volumes dthanol absolu trs froid (conserv au conglateur). - Observer les fibres dADN qui forment un prcipit dans lalcool (mduse dADN). d) rcupration des fibres dADN Introduire dans le tube une pipette Pasteur et la faire tourner entre les doigts, les fibres dADN senroulent sur cette pipette. Continuer cette opration jusqu ce que la solution devienne limpide. - Tremper ensuite la pipette pasteur avec les fibres encore enroules pendant 5 min dans la solution de rinage (alcool 70%). - Sortir doucement les fibres de la pipette et les plonger dans un tube plastique Falcon bouchon vissant de 50 ml contenant 8 ml de solution SSCx1. Attendre quelques minutes la rhydratation de l'ADN puis drouler en agitant modrment jusqu' dissolution complte. - remettre les tubes lassistant
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Tissus : 10 g de testicules ou 1 oignon entier. Glace pile : 40 g Tampon dextraction 65 ml Broyage (mixer)

Pour 4 binmes

Homognat Filtration

Noter V1 obtenu/ binme

V1 + x ml SDS 10% Agitation 5 min

+ x ml NaCl 6M Agitation Centrifugation 10 min 5000 rpm

Pipette pasteur

Solution dADN = V2 + 2 Volumes dthanol absolu froid Fibres dADN enroules autour de la pipette

Fibres dADN scher

Rsum des diffrentes tapes dextraction de lADN

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TP N Proprits physicochimiques des acides nucliques 8. Spectre dAbsorption dans lUV et estimation de la puret de lextrait dADN

Les acides nucliques (ADN et ARN) possdent la capacit d'absorber une longueur d'onde () de 260 nm, c'est dire dans lU.V. Cette proprit peut tre utilis pour doser la quantit dacides nucliques en solution et pour en estimer la puret (contamination avec des protines). La loi de Beer-Lambert donne une relation linaire entre l'absorbance (A) d'une substance en solution et sa concentration dans la solution. Cependant, les spectrophotomtres que nous utilisons ont des "limites de fabrication" : ils ne peuvent suivre cette loi que pour des A comprises entre 0 et 1. Au del de cette valeur, la droite n'est plus linaire et les valeurs d'A obtenues sont sous-estimes. Il est donc indispensable de diluer les chantillons pour tre toujours dans la bonne zone de lecture. 1. Matriel et ractifs Spectophotomtre UV + cuve en quartz de 1 cm Extrait dADN en solution Tubes essai Tampon SSCx1 2. Mode opratoire Spectre dabsorption

Pour l'ADN obtenu en fin de prparation (TP 8), prlever 0,5 ml faire une dilution au 1/10 et tracer le spectre d'absorption DO = f() entre 220 et 320 nm. DO 220 230 240 245 250 255 260 265 270 280 290 300 320

En dduire max. Estimation de la puret de lextrait dADN

Utiliser les valeurs des DO pour les longueurs dondes 260 et 280. Calculer le rapport DO260/DO280 . En gnral pour des solutions dADN pure, ce rapport doit tre compris entre 1,8 et 2. Si ce rapport est infrieur 1,8, lextrait dADN est contamin avec des protines. Si en revanche le rapport est suprieur 2, lextrait dADN est contamin avec de lARN. Donnez vos conclusions sur le degr de puret de votre extrait dADN

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