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corrigé_tp06

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Corrigé examen TP 2006
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TECHNIQUES D’ANALYSES BIOLOGIQUES

Corrigé : Année 2005/2006

Examen de travaux Pratiques
Nom :
Exercice n°1

Prénom :

La méthode colorimétrique de Bradford (Bradford, M. (1976)) permet de déterminer la concentration en protéines totales d'une solution contenant des protéines. Cette méthode utilise le bleu de Coomassie (le colorant) et une protéine globulaire "standard" : l'albumine de sérum bovin ou BSA ("Bovine Serum Albumin"). Cette droite étalon est obtenue de la manière suivante : - dans une série de tubes à essais, on met différents volumes d'une solution de BSA (100 µL au MAXIMUM) complétés par une solution tampon ; on ajoute 1 mL de colorant, on mélange et après 10 min à l'obscurité on mesure l'absorbance à 595 nm.

a. Sachant que l'on dispose d'une solution stock de BSA à 1 mg.mL.1, calculez les volumes (et éventuellement la dilution à effectuer au préalable) à prélever de la solution de BSA et de la solution tampon pour faire une gamme étalon : 0, 2, 4, 6, 8 et 10 µg de BSA. Les valeurs d'absorbance à 595 nm sont les suivantes : Quantité de BSA (µg) A595 0 0,13 2 0,40 4 0,48 6 0,85 8 0,95 10 1,21

b. La détermination de la concentration de la solution de protéines à doser se fait EN PARALLÈLE, de la manière suivante : - dans une autre série de tubes à essais, on prélève des volumes différents (100 µL au MAXIMUM) de la solution de protéines à doser (éventuellement diluée) complétés par une solution tampon ; - après avoir ajouté 1 mL de colorant et mélangé, on mesure l'absorbance à 595 nm de ces solutions EN MÊME TEMPS que l'absorbance des solutions de la gamme étalon. Les résultats sont les suivants : Volume prélevé de solution à doser (µL) Dilution préalable de la solution à doser A595 10 sérum 1 Non diluée 0,51 60 sérum 2 3 0,84

A partir de la droite étalon et de ces valeurs, calculez la concentration en protéines de la solution à doser en mg/ml. Réponse a: (complétez le tableau suivant). De combien est diluée la BSA avant la préparation de la gamme d’étalonnage ?
Volume de BSA (µL) à 0.1µg/µl Volume de tampon (µL) Quantité de BSA (µg) Réactif (bleu de Coomassie) (mL) 0 100 0 1 20 80 2 1 40 60 4 1 60 40 6 1 80 20 8 1 100 0 10 1

Réponse b : sérum 1 :0.46 mg/ml ; sérum 2 : 0.39 mg/ml ; dilution de la BSA : 1/10… .Attention :    l'absorbance du tube SANS BSA n'est pas nulle (A595 = 0,13). C'est parce que l'absorbance du colorant non complexé n'est pas nulle à 595 nm. Cette absorbance RESIDUELLE doit être retranchée aux valeurs obtenues avant de tracer la droite étalon.

.Exercice n°2
Quel est le pH d’un mélange de 5 ml d’acétate de sodium et de 4 ml d’acide acétique 0,1mol/l avant (pH1) et après (pH2) ajout de 1ml d’HCl à 0,1 mol/l ? (le pKa de l’acide à 25 °c = 4,76).

Réponse : pH1 : 4,86 pH2 : 4,66 Quelle conclusion tirez vous de la solution décrite ci-dessus ? Réponse : (très brève)…Solution tampon (le pH a subi une variation de 0,2 unités seulement). Exercice n°3 Le mode opératoire classique réalisé au laboratoire, est une méthode de précipitation sélective par un hétéropolyacide (A) de concentration de 7 mmol/l (PM=5708) en présence d’un cation bivalent (B) à 2 M. Le tableau récapitulatif cidessous (à compléter) permet d’avoir chaque fraction de lipoprotéines séparément, en utilisant des concentrations connues et précises pour chaque fraction de lipoprotéines indépendamment. Réactifs A B Sérum sanguin + réactifs A et B (ml) Réactif A (µl) Réactif B (µl) PréBéta lipoprotéines 0.05% 0.1M 0.1 1,25 µl (dilution 1/80) 5 µl (dilution 1/20) Béta lipoprotéines 0.2% 0.1M 0.1 5 µl (dilution 1/20) 5 µl (dilution 1/20) Alpha lipoprotéines 2% 0.2M 0.1 50 µl (dilution 1/2) 10 µl (dilution 1/10)

Exercice n°4 Préparation de solutions de caféine de différentes concentrations Avec la caféine extraite que l'on a purifiée, on fabrique une solution de caféine dans le dichlorométhane de concentration 32 mg.L-1. On désire préparer des solutions de concentrations 4 mg.L-1, 8 mg.L-1, 12 mg.L-1et 16 mg.L-1 Parmi le matériel suivant, indiquer celui utilisé pour préparer la solution de caféine de concentration 16 mg.L-1. Justifier votre choix. Matériel à disposition : - béchers de 100 mL et 200 mL - fioles jaugées de 5,0 mL ; 10,0 mL et 50,0 mL - pipettes jaugées de 2,0 mL et 5,0 mL - éprouvette graduée de 5 mL Réponse :…Fioles et pipettes jaugées MESURE D'ABSORBANCE On a tracé ci dessous (figure n°l) le spectre d'absorption de la caféine entre 220 nm et 320 nm pour une des solutions de caféine.

a- À quel domaine appartiennent ces longueurs d'onde ? Réponse : Ultra violet. ( < 400 nm, donc les radiations utilisées appartiennent au domaine des ultraviolets). On veut tracer la courbe d'étalonnage A = f(c) de la caféine à l'aide des différentes solutions précédemment préparées. Quelle longueur d’onde faut-il choisir ?pourquoi ? Réponse : 271nm qui correspond à un maximum d’absorption.

La

figure

2

ci-dessous,

représente

les

absorbances

des

5

solutions

de

caféine.

bÀ l'aide de la droite d'étalonnage, trouver quelle est la concentration solution qui a servi à faire le spectre d'absorption de la figure 1. Réponse : Sur la figure 1, pour =271 nm on lit A=0,5. A l’aide de la figure 2, on en déduit c=16 mg.L–1.

de

la

cParmi les 3 droites d'étalonnage de la figure n°3, l'une correspond à l'étalonnage effectué à 228nm. Sachant que la droite n°2 correspond à un étalonnage à 271 nm, en déduire celle qui correspond à l'étalonnage à 228 nm. Réponse : La droite n°3 correspond à l'étalonnage effectué à 228 nm. Dans tous les cas, l'absorbance est proportionnelle à la concentration en caféine : A = k.c Soit A = k271.c pour la droite n°2 et A = k228.c pour la droite à identifier. D'après la figure 1, on constate qu'une solution de concentration donnée en caféine absorbe moins la lumière dont  = 228 nm que celle dont  = 271 nm. Donc k228 < k271 Le coefficient directeur de la droite à identifier est plus faible que celui de la droite n°2. Exercice n°5 La manipulation et la mise en évidence de la quantité de glycogène par la méthode colorimétrique présent dans le foie se déroulent en deux temps. Expliquer brièvement le protocole (2 lignes) ? Réponse : il faut en premier lieu ...Extraction.................................................................................................. puis dans un deuxième temps…Dosage du glycogène grâce courbe d’étalonnage…………… Exercice n°6 Afin de doser les sucres réducteurs d’un jus de fruit par la méthode colorimétrique, nous avons pressé le matériel biologique (oranges), puis nous avons utilisé 3 traitements successifs. En 1centrifugation du jus (Préciser le type de centrifugation utilisée). En 2 récupération de l’échantillon dans du méthanol. En 3 ajout de la liqueur de Fehling suivi de la solution molybdique. Expliquez le rôle de chaque étape ? Réponse : 1 Centrifugation différentielle ; les sucres étant solubles (récupération dans le surnageant). 2…Précipitation des protéines 3…Dosage des sucres réducteurs ; précipitation et dépôt (cuivrique) par fehling redissolution par la solution molybdique.

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