TP de M Thodes Spectrales 3L BIOCHIMIE S6

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université Mohamed Boudiaf-M’sila

Faculté des Sciences
Département de Microbiologie & Biochimie
Polycopié de Travaux Pratiques
TP de Méthodes Spectrales
ième
Polycopié destiné aux Etudiants en 3 Année Licence
en Biochimie
Chargé de TP : Dr. RÉGGAMI Yassine
Année universitaire : 2017-2018

Semestre : 6
Unité d’enseignement Fondamentale 2 (UEM 3.2): Techniques biochimiques et méthodes

spectrales
Matière 2: Méthodes spectrales

Crédits : 6
Coefficient : 3
Objectifs de l’enseignement
Connaitre les différentes méthodes spectrales et leurs applications en analyse biochimique.
Mode d’évaluation : Contrôle continu, Exposés, Posters, Interrogations, Compte rendu de

TP, examen de TD et de TP.
SOMMAIRE
TP n° 0 : Consignes de sécurité et matériel de laboratoire……………………………….. 1
TP n° 1 : Dosage d’un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par
spectrophotométrie directe……………………………...……………..……..… 9
TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de Trinder (spectrophotométrie indirecte)… 18
TP n° 3 : Dosage des protéines totales par la méthode du biuret….………...…………… 24
TP n° 4 : Dosage des protéines tissulaires par la méthode de Bradford ………..……….. 29
TP n° 5 : Dosage du cholestérol total par la méthode Enzymatique-Colorimétrique
CHOD-POD .…………………..………………………………………..……... 34
TP n° 6 : Dosage de triglycérides par la méthode Enzymatique-Colorimétrique GPO-
POD ……………………………………………………………….…………… 37
Références bibliographiques…………………………………………………... 41
TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel
de laboratoire
TP n° 0: Consignes de sécurité et matériel de laboratoire.
1. Consignes de sécurité
Par mesure d'hygiène, il est interdit de manger dans le laboratoire.
Le port de la blouse 100% coton est obligatoire. La blouse doit être de longueur
raisonnable et à manches longues.
Les étudiants doivent toujours manipuler debout. Aucun objet ne doit encombrer les
paillasses.
Les tabourets ou les chaises doivent être rangés sous les paillasses afin de ne pas
encombrer les allées.
Pour chaque manipulation présentant un risque, le port des lunettes de protection et de
gants en latex est impératif. Les cheveux longs doivent être attachés derrière la tête.
Toute manipulation de produits chimiques présentant un risque doit être réalisée sous
une hotte ventilée, avec vitres protectrices.
Le pipetage à la bouche est interdit. Utiliser les propipettes.
IL est interdit de regarder de près les récipients contenant des liquides en ébullition.
Ne pas respirer le contenu d’un récipient pour l’identifier à son odeur.
Reboucher tout flacon immédiatement après usage.
Ne jamais prendre de produits solides avec les doigts, utiliser une spatule.
Utiliser des verreries résistantes aux hautes températures (verrerie Pyrex) lorsqu'il faut
chauffer.
Éviter de faire subir des chocs thermiques à la verrerie (ne pas refroidir brutalement un
récipient chaud).
Les paillasses doivent être nettoyées au cours de la séance et laissées parfaitement
propres et sèches en fin de séance.
Il est impératif de se laver soigneusement les mains après manipulation.
Page 2
Il est recommandé de ne jamais jeter dans les éviers de laboratoires, les produits à
risque : Verser les solutions dans les flacons de récupération prévus à cet effet.
Les pictogrammes de sécurité de produits chimiques doivent être connus.
Le SGH (ou en Europe « règlement CLP ») s’applique de façon obligatoire aux substances
depuis fin 2010. Ce nouveau système comprend 9 pictogrammes. Baptisé « Système Général
Harmonisé (SGH) » ou « Globally Harmonized System (GHS) », il a pour but d’uniformiser
l’étiquetage des produits chimiques à l’échelle mondiale. Il est appliqué en Europe sous le
nom de « Règlement CLP ». Le système européen préexistant et le nouveau système SGH
cohabitent ainsi depuis le 1er décembre 2010.
2. Connaissance des risques de produits utilisés
Il existe trois grandes catégories de dangers intrinsèques aux substances chimiques :
les dangers physiques (risque d’explosion, d’in ammation, etc.) ;
les dangers pour la santé (toxicité aiguë, lésion oculaire, toxicité pour la reproduction, etc.) ;
les dangers pour l’environnement (danger pour les milieux aquatiques).
Page 3
Page 4
3. Etiquetage de produits chimiques
La première information sur les dangers d’une substance chimique est fournie par l’étiquette
sur laquelle doit apparaître au moins :
le nom du produit ;
des pictogrammes de danger ;
des mentions de dangers (phrases H) ;
des conseils de prudence (phrases P) ;
une mention d’avertissement.
Sur l’étiquette, peuvent aussi figurer des grandeurs physiques (densité, masse molaire,
composition, etc.).
L’image suivante donne l’exemple d’une étiquette d’acide chlorhydrique concentré.
Page 5
Pictogrammes de danger
Ces schémas représentent des types de dangers particuliers. Ils sont notés SGHXX et
sont présentés dans la figure suivante.
Mentions de danger (phrases H)
Les mentions de danger complètent les pictogrammes. Elles commencent toujours par
la lettre H (pour Hazard = danger) qui est suivie d’un nombre à 3 chiffres. Le 1er
chiffre correspond à la catégorie de danger.
H2XX : mentions de dangers relatives aux dangers physiques ;

H3XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour la santé ;
H4XX : mentions de dangers relatives aux dangers pour l’environnement.
Conseils de prudence (phrases P)
Les conseils de prudence complètent également les pictogrammes. Ils commencent
toujours par la lettre P (pour Prudence) qui est suivie d’un nombre à 3 chiffres. Le 1er
chiffre correspond à la catégorie de conseil de prudence.
P1XX : conseils de prudence généraux ;

P2XX : conseils de prudence - Prévention ;
P3XX : conseils de prudence - Intervention ;
P4XX : conseils de prudence - Stockage ;
P5XX : conseils de prudence - Élimination.
Page 6
Mention d’avertissement
Sur l’étiquette figure une mention d’avertissement « Attention » ou « Danger » qui
indique le degré relatif de dangerosité. « Danger » est utilisé pour les dangers les plus
graves.
Substances C.M.R. : Cancérogène, Mutagène, toxique pour la Reproduction
Il existe une classification européenne de produits chimiques C.M.R. qui s’appuie sur des
résultats d’études animales et/ou humaines. La liste des substances C.M.R. évolue car tous les
produits n’ont pas été testés.Les composés C.M.R. doivent être stockés sous clé et utilisés en
respectant scrupuleusement les consignes de sécurité.
Quelques exemples de substances C.M.R. : aniline, benzène, 1,3-butadiène, chlorure de
cobalt (II), dichromate de potassium, mercure, phénol...
4. Premiers soins aux victimes d’accident
4.1. En cas de projection cutanée
Rincer la peau longuement et abondamment à l'eau claire jusqu'à ce que le produit soit
éliminé.
Attention, ne pas chercher à neutraliser les produits acides ou basiques.
4.2. En cas de projection oculaire
Rincer immédiatement et abondamment à l'eau froide.
Consulter systématiquement un ophtalmologue.
4.3. En cas d’ingestion accidentelle
En cas d'ingestion, rincer la bouche. Boire un verre d'eau.
En cas d'inhalation de vapeurs (Eau de Javel, Brome…), amener la personne dans un
endroit aéré.
Page 7
5. Matériel de Laboratoire
Page 8
TP n° 1 : Dosage d’un colorant alimentaire
(SIN110) dans une boisson gazeuse par
spectrophotométrie directe.
TP n° 1 : Dosage d’un colorant alimentaire (SIN110) dans une boisson gazeuse par spectrophotométrie
directe.
1. Rappel : SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE UV/Vis.
La spectrophotométrie d’absorption moléculaire UV-visible est une méthode d’analyse
très commune dans les laboratoires, basée sur la propriété d’absorption des radiations
lumineuses par la matière, ou en d’autres termes l'interaction molécule/ rayonnement
électromagnétique. Le domaine de longueur d’onde utilisable correspond au spectre visible :
400 (violet) à 800 (rouge) nm environ ou au proche ultraviolet (200 à 400 nm).
Cette méthode nécessite l'utilisation d'un spectrophotomètre et permet de caractériser
des molécules, de déterminer des concentrations d'espèces chimiques en solution et par
extension de réaliser des suivis cinétiques des réactions (chimiques et enzymatiques).
1.1. PRINCIPE DE LA TECHNIQUE :
Lorsqu'une solution est traversée par un rayonnement polychromatique, elle peut
diminuer l'intensité des radiations à certaines longueurs d'onde: on dit alors qu'elle
absorbe ces radiations. La mesure de la fraction d’intensité lumineuse absorbée à cette
longueur d’onde permet de déterminer la concentration de la substance absorbante dans la
solution étudiée.
REMARQUE : « Absorption et couleur »

De façon simplifiée, si une solution absorbe dans le visible, elle apparaît de la couleur
complémentaire à la longueur d'onde absorbée (violet/jaune, bleu/orange, vert/rouge)
comme illustré par le cercle chromatique suivant :
Page 10
directe.
1.2. LOIS DE LA SPECTROPHOTOMETRIE :
Soit un rayonnement monochromatique (de longueur d'onde
) d'intensité incidente I traversant une solution absorbante de
concentration c placée dans une cuve d’épaisseur ( ;
longueur du trajet optique). Une partie de cette radiation
incidente sera absorbée par la solution et l'autre sera transmise
et son intensité est notée It avec It < I0 .

Représentation d'une cuve
A fin de quantifier l'intensité de la radiation absorbée à une
traversée par un faisceau
longueur d'onde donnée, deux grandeurs sont introduites: la
incident d'intensité I0 .
transmittance, notée T et l'absorbance, notée A :
Un faisceau d'intensité It
en émerge.
Ces grandeurs sont sans unité ; la transmittance est souvent exprimée en % :
Si T = 100 %, le milieu est parfaitement transparent et A = 0 ;
Si T = 0 %, le milieu est parfaitement opaque et A .
L'absorbance A est souvent appelée Densité Optique (D.O.).
Page 11
directe.
Loi de Beer-Lambert :
Considérons une solution contenant une espèce chimique de concentration c absorbant à la
longueur d'onde . La loi de Beer-Lambert donne une relation entre l'absorbance A et la
concentration c de l'espèce chimique en solution:
Avec :
la longueur de la solution traversée par le faisceau (exprimée en cm). Généralement on
utilise des cuves de 1 cm.
c la concentration de l'espèce considérée en solution (exprimée en mol.L -1).
le coefficient d'absorption molaire (exprimé usuellement en L. mol-1. cm-1). C'est une
grandeur qui dépend de l'espèce chimique considérée, de la longueur d'onde d'analyse,
du solvant et de la température.
Limitations de la loi de Beer-Lambert
La loi de Beer-Lambert, qui ne concerne que la fraction de la lumière absorbée,
est vérifiée dans les conditions suivantes :
La lumière utilisée doit être monochromatique ;
Les concentrations doivent être faibles ;
La solution ne doit être ni fluorescente ni hétérogène ;
le soluté ne doit pas donner lieu à des transformations photochimiques ;
le soluté ne doit pas donner des associations variables avec le solvant.
Page 12
directe.
1.3. MESURES D’ABSORPTION :
a) Principe de l’appareil :
L'absorbance (ou la transmittance) peut être mesurée par un spectrophotomètre dont le
schéma de principe est représenté sur la figure suivante.
S : Source de lumière blanche (polychromatique).
F1 : Fente (diaphragme) permettent de sélectionner l’intensité de la lumière blanche.
P : Dispositif dispersif (prisme).
F2 : Fente sélectionnant une longueur d’onde souhaitée.
C : Photodétecteur (cellule photoélectrique) engendrant un courant d’intensité proportionnelle
à l’intensité de la lumière reçue. L’intensité de ce courant est traduite en absorbance sur le
galvanomètre G (afficheur).
b) Mesure de l’absorbance :
Pour mesurer l’absorbance, il fallait effectuer ces étapes suivantes :
Choisir une longueur d’onde « max ».
Les mesures sont faites de préférence à une longueur d’onde correspondant à un maximum
de la courbe donnant l'absorbance en fonction de la longueur d'onde A = ƒ ( ). Cette
courbe est appelé spectre d'absorption.
Page 13
directe.
Placer dans le porte-cuve une cuve contenant une solution du blanc* de même
composition que la solution dont on veut mesurer l’absorbance, à l’exception de la
substance étudiée.
“Afficher ” une absorbance nulle.
Remplacer la solution du blanc par la solution étudiée* et lire l’absorbance.
L’utilisation de la cuve du blanc permet de mesurer uniquement l’absorbance du produit
étudié en éliminant l’absorption du solvant et de la cuve, les phénomènes de diffusion et
les réflexions aux interfaces.
* cuve remplie aux 2/3 seulement, extérieur bien essuyé.
Si l'absorbance de la solution étudiée est supérieure à 2, il convient de la diluer en
conséquence.
c) Utilisation des mesures :
La loi de Beer-Lambert A = . .c montre, qu’à une longueur d’onde donnée, le
rapport des absorbances de deux solutions contenant la même substance est égal
au rapport des concentrations : A1 / A2 = c1 / c2. Il suffit donc de mesurer les
absorbances d’une solution “étalon” (concentration connue) et de la solution étudiée
pour déterminer la concentration dans cette dernière.
Pour diminuer l’incertitude sur la détermination de la concentration, il est
préférable de tracer une courbe d’étalonnage en utilisant des concentrations
variables et connues de la substance à doser. Les mesures faites à plusieurs
dilutions avec la solution à doser sont alors comparées à la courbe d’étalonnage.
Page 14
directe.
2. Les colorants alimentaires
Les colorants alimentaires sont des additifs utilisés pour normaliser ou restaurer la
couleur des aliments. L’un des colorants de synthèse les plus utilisés dans l’industrie
agroalimentaire et surtout dans la production des jus de fruits et des boissons gazeuses à
l’orange est le « jaune orangé S/ jaune soleil FCF (SIN110) ». Ce colorant chimique est une
poudre ou granules rouge orangé très soluble dans l'eau. Sa formule brute est :
C16H10N2Na2O7S2 et sa masse molaire est de 452,37 g/mole.
N.B. La norme maximum tolérée du SIN 110 est de 50 mg/L.
Ce colorant est utilisé également dans certaines sirops, soupes instantanées, fromages,
gâteaux, pâtisseries, pâtes de fruits, glaces, bonbons...en cosmétologie sous l'appellation
"CI 15985" et dans certains produits pharmaceutiques (par exemple : agent colorant
pour les comprimés de vitamine C).
La consommation de SIN110 peut provoquer :
Un syndrome d'hyperactivité chez les enfants s'il est associé à des benzoates (= les
additifs de SIN210 à SIN215).
De l'urticaire et de l'eczéma notamment si il est associé avec de l'aspirine (intolérance
aux salicylates), des diarrhées et des troubles gastriques.
Le cancer, le SIN110 est possiblement cancérigène et classé catégorie 3 au CIRC
(Centre International de Recherches sur le Cancer). Il a été montré qu'il accroit le
nombre de tumeurs chez les animaux.
le SIN110 est interdit dans certains pays comme la Norvège et la Finlande.
SIN : Système International de Numérotation des additifs alimentaires.
Page 15
directe.
3. Objectif
Le but de cette manipulation est la détermination de la longueur d’onde d’absorption
maximale « max » et de la teneur en «SIN110 jaune orangé S » d’une boisson gazeuse.
4. Produits et matériel
4.1. Produits utilisés
Poudre du colorant alimentaire SIN110 ; 1g
Eau distillée ; 3 L
4.2. Matériel :
Spectrophotomètre. 8 tubes à essais.
2 cuves. Agitateur des tubes.
Papiers joseph. 2 Fiole jaugée de 100 mL.
Balance analytique. Entonnoir.
Verre de montre. Pipettes 10 et 2 mL
Spatule. Pro-pipettes.
5. Mode opératoire
5.1 – Détermination de la longueur d’onde d’absorption maximale « max » :
Dans une cuve, mettre le solvant (eau distillée) sur lequel on fera le "zéro optique".
Dans une autre cuve, mettre une solution du colorant alimentaire SIN110 à 4,42 x 10-4 M.
A partir de = 450 nm, faire une mesure tous les 5 nm ou moins quand l'absorbance
varie rapidement, dans le sens croissant des longueurs d'onde, jusqu’à 550 nm.
Pour chaque longueur d'onde, ne pas oublier de "refaire le zéro optique" avec une cuve
remplie d'eau distillée.
Page 16
directe.
5.2 – Préparation de la gamme des étalons
Préparer la gamme d’étalonnage en suivant le tableau 01 :
Tableau 01 : Préparation de la gamme d’étalonnage.
Tubes Témoin 1 2 3 4 5 6 7
SIN110 à 4,42 x 10-4 M (ml) 0 0,3 0,5 0,8 1,0 1,2 1,5 2,0
H2O q.s.p 10 ml 10 9,7 9,5 9,2 9,0 8,8 8,5 8,0
Lire l’absorbance à la longueur d’onde d’absorption maximale « max ».
6. Résultats.
6.1- Tracer le spectre d’absorption du colorant alimentaire «SIN110» : A = ƒ ( ).
6.2- Pour quelle longueur d'onde l'absorbance est-elle maximale ? La noter sur le
graphe.
6.3- Quelle est la couleur de la solution du colorant alimentaire «SIN110»? La longueur
d’onde max correspond-elle à la couleur complémentaire de cette solution?
6.4- Déterminer les concentrations massiques et les dilutions des étalons.
6.5- Etablir la gamme d’étalonnage.
6.6- Tracer la courbe d’étalonnage A = ƒ ([SIN110]).
6.7- Déterminer la concentration massique du «SIN110 jaune orangé S» dans la boisson
gazeuse. Est-ce que le fabricant de la boisson gazeuse a respecté la norme
internationale ?
6.8- Calculer le coefficient d’absorption molaire.
Page 17
TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de
Trinder.
(Spectrophotométrie indirecte)
TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de Trinder.
1. Rappel : Méthodes de dosage spectrophotométrique
Spectrophotométrie directe et indirecte
Deux cas sont possibles selon la substance à doser :
(1)- la substance à doser possède un pic d’absorption caractéristique dans le visible
(substance colorée) ou dans l’UV ; on fait alors un dosage spectrophotométrique
direct de cette substance.
(2)- la substance à doser ne possède pas un pic d’absorption caractéristique dans le
visible (substance incolore) ou dans l’UV ; on fait alors un dosage
spectrophotométrique indirect de cette substance en dosant un produit coloré résultant
d’une réaction de coloration spécifique à la substance à doser.
Substance incolore + réactifs de coloration Produit coloré
Comment calculer la concentration c d’un échantillon :
Méthode directe :
Elle consiste à mesurer l’absorbance Aéch et à calculer directement la concentration
céch en appliquant la loi de Beer-Lambert.
Elle nécessite de connaitre le coefficient d'absorption molaire de la substance à
doser à la longueur d’onde choisie, et de bien caler le monochromateur, car varie avec
Page 19
Méthodes indirectes : Elles ne nécessitent pas de connaitre :
a)- Méthode par comparaison avec un étalon unique :
Elle consiste à mesurer dans les mêmes conditions l'absorbance Aéch de la solution à
doser "échantillon" et l'absorbance Aet d'une solution "étalon" ou "standard" de
concentration connue cet, puis à calculer la concentration de la solution à doser céch ; en
utilisant l’équation suivante : céch= (Aéch x cet) /Aet .
Elle suppose mais ne vérifie pas la linéarité.
b)- Méthode par comparaison avec une gamme d’étalonnage :
Elle consiste à préparer une gamme de dilutions d'une solution étalon "mère", à
mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons "filles", puis à tracer la courbe
d'étalonnage A = ƒ(c). L'absorbance de la solution à doser est mesurée dans les mêmes
conditions, puis reportée sur la courbe d'étalonnage; on fait ainsi une détermination
graphique de la concentration de la solution à doser (la gamme doit encadrer la valeur
probable de la solution à doser) ;
Elle permet de vérifier la linéarité, et tient compte des éventuelles erreurs de
manipulation.
2. Introduction
Le glucose est un hexose (ose à 6 C), possédant comme fonction réductrice une fonction
aldéhyde (aldose). En tant qu’aldohexose, le glucose en solution se présente sous plusieurs
formes en équilibre : linéaire ou cyclisées. Les plus stables, et donc les plus abondantes dans
la nature, sont les formes cycliques pyrannes.
L'enzyme (la glucose-oxydase) étant très spécifique, le glucose peut être décelé et dosé
seul dans un mélange complexe de glucides. La méthode proposée est la plus employée pour
déterminer le taux de glucose dans le sang (glycémie) ou dans les urines (glycosurie), sous
Page 20
forme liquide ou sous forme de bandelettes réactives, que ce soit en laboratoire d’analyses, en
milieu hospitalier ou par les diabétiques (autocontrôle de la glycémie).
3. Principe
La Glucose-oxydase (GOD) catalyse l’oxydation du glucose en acide gluconique. Le
peroxyde d'hydrogène (H2O2) formé de cette réaction est détecté par un accepteur d’oxygène
chromogénique, le Phénol-Aminophénazone, ce chromogène réduit incolore, en présence
de la Peroxydase (POD), sera oxydé en un dérivé coloré en rose (Quinone). L'intensité de la
coloration obtenue est proportionnelle à la quantité initiale en glucose.
GOD
-D-Glucose + O2 + H2O Acid gluconique + H2O2
POD
H2O2 + Phénol + Aminophenazone Quinone + H2O
On peut simplifier l’ensemble de ces réactions ainsi :
L'intérêt d’utiliser un chromogène est d'obtenir un produit coloré permettant d'effectuer des
mesures spectrophotométriques faciles à mettre en œuvre.
4. But
L’objectif de la présente manipulation est la détermination spectrophotométrique indirecte
des concentrations de solutions de glucose par une méthode enzymatique-point final à l’aide
d’un d’étalon (c.-à-d. en utilisant une solution-standard de glucose).
Page 21
5. Réactifs et matériel
5.1. Réactifs utilisés
Kit pour le dosage de glucose SPINREACT© « Trinder. GOD-POD » ;
Réactifs Composition Concentration

Réactif R1 TRIS pH 7.4 92 mmol/L
(Tampon) Phénol 0.3 mmol/L
Réactif R2 Glucose oxydase (GOD) 15000 U/L
(Enzymes) Peroxydase (POD) 1000 U/L
4 – Aminophenazone (4-AP) 2.6 mmol/L
Préparation du réactif de travail ;
Pour préparer le réactif du travail (RT): dissoudre le contenu de R2 (enzymes) dans la
fiole de réactif R1 (tampon), puis agiter gentiment pour homogénéiser le contenu.
La solution enzymatique (RT) est stable après reconstitution pendant 4 semaines à
une température de 2-8 °C ou 7 jours à une température ambiante (15-25 °C).
Solution de glucose de 2 g/L..
5 Solutions de glucose de concentration à déterminer, proche des conditions
biologiques sanguines (concentrations entre 0,5 à 1,5 g/L).
Eau distillée ; 3 L.
5.2. Matériel
Spectrophotomètre. Spatule + Verre de montre
Bain-marie. 2 Fiole jaugées 50 mL.
Balance analytique. Tubes à essai (20) et Porte-tubes (4).
Pipette 10 et 2 mL. 3 cuves.
Agitateur des tubes. Papiers joseph.
Fiole jaugée de 100 mL.
Page 22
6. Mode opératoire
À partir de la solution de glucose de 2 g/L, préparer une solution-standard de glucose à
0,05 g/L dans une fiole jaugée de 50 mL.
Les concentrations des solutions à doser doivent être faibles, pour une bonne
détermination. Il est donc nécessaire de réaliser une dilution préalable des solutions
inconnues (Ne pas oublier de tenir compte de cette dilution dans le résultat final d=1/10).
Dosage
Blanc Standard Échantillon

(témoin) (étalon)
Réactif du travail (RT) 3 mL 3 mL 3 mL
Eau distillée 0.1 mL - -
Standard (glucose à 0,05 g/L) - 0.1 mL -
Échantillon (Solution inconnue diluée) - - 0.1 mL
Homogénéiser.
Mettre au bain-marie à 37°C pendant 10 min (ou 20 min à une à une température ambiante
15-25°C).
Mesurer l’absorbance à 505 nm.
7. Résultats
Calculer la concentration du glucose dans les 5 échantillons !
Page 23
TP n° 3 : Dosage des protéines totales par la
méthode du biuret.
TP n° 3 : Dosage des protéines totales par la méthode du biuret.
1. Introduction
De nombreuses méthodes ont été mises au point pour doser les protéines. La méthode
effectue dans le présent TP dite du biuret ; elle tire son nom de la molécule le biuret
NH2-CO-NH-CO-NH2 (obtenu par condensation de 2 molécules d’urée NH2-CO-NH2 avec
départ d’ammoniac) qui donne une coloration violette en réagissant avec le sulfate de cuivre
CuSO4 dont le maximum d’absorption est à 540 nm. Par suite de leur analogie de structure
avec le Biuret, Les peptides et les protéines donnent la même réaction. Cette technique a été
développée par Gornall et al (1949).
2. Objectif
Le but de cette manipulation est la détermination de la concentration en protéines dans
un liquide biologique (blanc d’œuf).
3. Principe
En milieu alcalin, à froid, les ions cuivriques (Cu 2+) forment avec les liaisons peptidiques
un complexe de coordination coloré en rose, qui ajouté à la teinte bleue du réactif donne
finalement une coloration pourpre (bleu-violet). Cette réaction est positive dès que la
molécule possède 3 à 4 liaisons peptidiques, elle est donc utilisable pour les protéines et les
polypeptides. La mesure de l’absorbance se fait à 540 nm après avoir laissé la coloration se
développer 30 min. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration des
protéines.
Page 25
4. Matériel et réactifs
- Spectrophotomètre.
- Eau physiologique : solution contenant 9g de chlorure de sodium (NaCl) dans 1L d’eau
distillée.
- Solution standard d’ovalbumine à 10 g/L dans de l'eau physiologique.
- Solution (s) inconnue (s) d’ovalbumine (nous utiliserons des blancs d’œuf).
- Réactif de Gornall :
- Sulfate de cuivre 5H2O : CuSO 4, 5H2O = 1,5g
- Tartrate double de sodium et de potassium : Tartrate double de Na et K = 6g
- Soude : NaOH = 30g
- Iodure de potassium : KI = 1g
- Eau distillée : H2O Q.s.p 1L (Q.s.p = Quantité suffisante pour)
- Béchers de 50 ml
- Fiole jaugée de 250 ml
- Tubes à essai de 15 ml
- Pipettes (1ml, 2ml, 5ml)
- Portoirs pour tubes à essai
5. Mode opératoire
5.1. Préparation du Réactif de Gornall
• Dissoudre le sulfate de cuivre et le tartrate dans 500ml d’eau distillée.
• Ajouter les 30g de NaOH.
• Ajouter l’iodure de potassium et compléter à 1L avec de l’eau distillée.
* Réactif à conserver à l’abri de la lumière, dans un flacon en polyéthylène
soigneusement fermé.
Page 26
5.2. Préparation des solutions de concentrations inconnues d’ovalbumine
• Peser les blancs d'œuf (utiliser des béchers). Noter les masses.
• Réaléser des dilutions au 1/50 des blancs d’œuf en eau physiologique.
5.3. Préparation d’une gamme étalon d’ovalbumine
- A partir de la solution étalon d'ovalbumine à 10 g/L, réaliser une gamme de 5 tubes
(tubes n° 1-5) contenant de 2 à 10 mg d'ovalbumine par tube.
- Préparer en même temps les tubes expérimentaux qui contiendront une prise d’essai de
solutions inconnues d’ovalbumine (tubes essai 1-5).
Tube n° 0 1 2 3 4 5 essai 1 essai 2 essai 3 essai 4 essai 5
Solution étalon d’ovalbumine 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0 0 0 0
à 10 g/L (ml)
Echantillon d’ovalbumine (ml) 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1
Eau physiologique (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 0 0 0
Réactif du Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Albumine / tube (mg) 0 2 4 6 8 10
- Agiter le contenu des tubes; Attendre 30 minutes à l'obscurité à température ambiante.
- Lire les absorbances à 540 nm contre le tube témoin de la gamme: tube 0.
- Stabilité de la réaction : 30 min.
6. Résultats expérimentaux
6.1. Etablir un tableau complet de colorimétrie: N° de tube, composition des tubes,
Absorbance, quantités et concentration en ovalbumine par tube.
6.2. Tracer, sur papier millimétré, la courbe d'étalonnage : A = ƒ( m de protéines/tube)
6.3. En déduire la concentration en protéines (en g/L) dans les solutions de blanc d’œuf
puis en déduire la teneur en protéines pour 100 g de blanc d’œuf.
Page 27
7. Données: Composition moyenne du blanc d'œuf (% en masse) est:
Eau : 85 %
Protéines : 12,9 %
Lipides : 0,3 %
Glucides : 0,8 %
Sels minéraux : 1,0 %
8. Préparation de la solution étalon d'ovalbumine à 10 g/L :
(fiole jaugée de 250 ml)
- Séparer les blancs des jaunes de 5 gros œufs (la masse d’un blanc d’œuf étant environ de
20 grammes par œuf)
- Peser 19.37g du mélange de 5 blancs d’œuf (utiliser pour cela une pipette compte-goutte
en plastique pour le prélèvement).
- Transférer dans une fiole jaugée de 250 ml.
- Ajuster avec de l’eau physiologique Q.S.P 250 ml.
Un blanc d’œuf contient 12,9 % de protéines (ovalbumine).
La solution étalon d'ovalbumine à préparer 10 g/L.
10 g (ovalbumine) 12,9 %
x g (blanc d’œuf) 100 %
x=10.100/12,9= 77,51g en eau physiologique Q.S.P 1L
19,37 g en eau physiologique Q.S.P 250 ml
15,50 g en eau physiologique Q.S.P 200 ml
Page 28
TP n° 4 : Dosage des protéines tissulaires par la
méthode de Bradford.
TP n° 04 : Dosage des protéines tissulaires par la méthode de Bradford.
1. Introduction
Les méthodes de dosage des protéines sont nombreuses et présentent chacune des
caractéristiques différentes : sensibilité, interférents, réponse plus ou moins différente selon la
composition en acides aminés, etc....
Le choix d'une méthode dépend donc du contexte. Citons quelques méthodes : par
l'intermédiaire du dosage de l'azote total protéique (méthode de kjeldahl), par mesure directe
de l'absorbance en domaine UV à 280 nm (méthode de Christian-Warburg), par méthodes
spectrophotométriques après mise en œuvre d'une réaction chimique (méthode du Biuret,
méthode de Lowry) ou de la fixation d'un colorant (méthode de Bradford) ...
2. Principe
La méthode de Bradford est un dosage spectrophotométrique, basé sur le changement
d'absorbance après la fixation d'un colorant, se manifestant par le changement de la
couleur du Bleu de Coomassie après liaison (complexification) avec les acides aminés
basiques (arginine, histidine, lysine.) et les résidus hydrophobes des acides aminés présents
dans la ou les protéines. La forme anionique (liée) du colorant est bleue, et possède un
spectre d’absorption maximal estimé historiquement à 595 nm. Les formes cationiques
(libres) du colorant sont rouges et marrons, absorbant à 465-470 nm. Le changement
d'absorbance est proportionnel à la quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en
protéines dans l'échantillon.
3. But
L’objectif de la présente manipulation est le dosage des protéines de quelques tissus
biologiques (tissus hépatique, musculaire, intestinal, etc….) par la méthode de Bradford en
comparaison avec une gamme d’étalonnage.
Page 30
4. Réactifs et matériel
4.1. Réactifs et produits chimiques
EDTA (Acide Ethylène Diamine Tétra Acétique): 7.4448 g.

Bleu de Coomassie (G 250) : 0.1 g
Ethanol (95 %) : 50 ml.
Acide Orthophosphorique (85%) : 100 ml
Eau distillée : 3L
Glaçons (Cubes)
4.2. Matériel
Spectrophotomètre + 2 cuves + Papiers joseph.

Tubes à essais + 4 portoirs + Agitateur des tubes.
Agitateur magnétique (Plaque chauffante) + barreau aimanté.
Bécher de 100 ml + entonnoir + Pipettes (1ml, 2ml, 5ml) + Pipeteur.
Balance analytique + Spatule+ Verre de montre + Mortier et pilon en porcelaine.
Matériel biologique congelé (1g de foie, 1g de muscle, 1g d’intestin…etc).
5. Mode opératoire
5.1. Préparation de la solution d’EDTA (0.02 M)
EDTA………………………………………..7.4448 g.
Eau distillée………………………………qsp 1000 ml.
5.2. Préparation du Réactif de Bradford
Bleu de Coomassie (G 250)……………………. 0.1 g.
Ethanol (95 %)………………………………….50 ml.
Agitation pendant deux heures (agitateur magnétique) puis ajouter :
Acide Orthophosphorique (85%)……………...100 ml.
Eau distillée………………………………qsp 1000 ml.
Ce réactif doit être filtré puis ; il peut être conservé pendant 1 mois à une
température de 4°C et à l'abri de la lumière.
Page 31
5.3. Préparation de l'homogénat
Mettre 200 mg de tissu congelé dans un mortier en présence de 8 ml d'une solution
d'EDTA à 0.02M.
Mettre le mélange dans un bain de glace.
Broyer à l'aide d'un pilon en porcelaine.
5.4. Dosage
Prélever 0,1 ml de l'homogénat.
Ajouter 5 ml du réactif de Bradford.
Blanc (témoin) Échantillon
Réactif (R) 5 ml 5 ml
Eau distillée 0,1 -
Échantillon (l'homogénat) - 0,1 ml
Homogénéiser
Laisser reposer 5 min.
Lire la densité optique à 595 nm, contre le blanc.
La densité optique obtenue est rapportée sur une courbe d'étalonnage préalablement
tracée. La concentration des protéines est déterminée par comparaison à une gamme
étalon d'albumine sérique bovine (1 mg/ml) réalisée dans les mêmes conditions.
Réalisation de la gamme d'étalonnage des protéines
BSA………………………………..l g.
Eau distillée………………qsp 1000 ml.
Tubes 1 2 3 4 5 6
BSA (µl) 0 20 40 60 80 100
Eau distillée (µl) 100 80 60 40 20 0
Réactif de Bradford (ml) 5 5 5 5 5 5
Page 32
Page 33
TP n° 5 : Dosage du cholestérol total par la
méthode Enzymatique-Colorimétrique
CHOD-POD.
TP n° 5 : Dosage du cholestérol total par la méthode Enzymatique-Colorimétrique CHOD-POD.
1. Introduction
Le cholestérol est à la fois apporté par l'alimentation et synthétisé par le corps
humain, principalement dans les cellules hépatiques et intestinales. Molécule insoluble,
circule associé à des lipoprotéines : HDL, LDL et VLDL.
Les HDL (High Density Lipoprotein) comportent environ 50% de lipides dont
20% de cholestérol. La molécule d'HDL a pour mission d'assurer l'efflux du cholestérol
depuis les membranes cellulaires et donc son épuration.
Les LDL (Low Density Liporpotein) qui transportent près de 60% du cholestérol
sérique total sont des lipoprotéines athérogenes.
2. Objectif du TP
Détermination d'une concentration inconnue du cholestérol sérique humain.
3. Principe
Le dosage du cholestérol sérique s'effectue selon les réactions suivantes :

(1)
Réaction 1 : Cholestérol estérifié + H2 O Cholestérol + Acide gras
(2)
Réaction 2 : Cholestérol + O2 Cholestene-4-one-3 +H2O2
(3)
Réaction 3 : 2 H2O2 + Chromogene Chromophore + 4 H2O
a) Indiquez les noms des enzymes des trios réactions :
(1) : Cholestérol….………………………….
(2) : Cholestérol……………………………..
(3) : ………………………………………….
b). indiquez les noms du Chromogène et Chromophore.
Chromogène :……………………………….
Chromophore :………………………………
Page 35
TP n° 5 : Dosage du cholestérol total par la méthode Enzymatique-Colorimétrique CHOD-POD.
4. Mode opératoire
4.1. Préparer une solution étalon mère de cholestérol à 0,2 g/L.
4.2. Réaliser une série de dilutions des solutions étalons filles à une concentration
massique maximale de 0,1 g/L en eau physiologique 0.9% (9g NaCl/ 1 L Eau
distillée).
4.3. Préparer un sérum humain dilué au 1/10; chaque essai est réalisé sur un volume de
0,1 mL du sérum dilué.
4.4. Réaliser la gamme d'étalonnage selon le tableau suivant :
Tableau 1 : Préparation de la gamme d'étalonnage
Tube N° 0 1 2 3 4 5 ESSAI
Etalon Cholestérol (uL) 0 20 40 60 80 100 -
Eau physiologique (uL) 100 80 60 40 20 0
Réactif (mL) 10 10 10 10 10 10 10
Sérum dilué (uL) - - - - - - 100
4.5. Les absorbances sont lues après 15mn d'incubation à 37°C.
5. Résultats et interprétation
5.1. Calculer les concentrations massiques et les dilutions des étalons.
5.2. Tracer la courbe d'étalonnage A (lue) = f (concentration massique en cholestérol).
5.3. Interpréter le résultat de l'essai (échantillon du sérum humain x).
5.4. Quel est l'intérêt physiopathologique de ce dosage (la cholestérolémie totale) ?
5.5. Indiquer les autres dosages de cholestérolémie.
5.6. Déterminer le rôle physiologique des HDL, LDL et VLDL
Page 36
TP n° 6 : Dosage de Triglycérides par la
méthode Enzymatique-Colorimétrique
GPO-POD
TP n° 6 : Dosage de triglycérides par la méthode Enzymatique-Colorimétrique GPO-POD
1. Introduction
Les triglycérides ou « Triacylglycérols» servent de réserve énergétique. Ils ont une
double origine: exogène (aliments) et endogène (synthèse hépatique). Ils sont dosés dans le
cadre d’une exploration d’une anomalie lipidique (EAL).
Ø Valeur de Triglycéridémie normale < 1,5 g/L (1,7 mmol/L).
Ø Seuil d’intervention thérapeutique: 2 g/L (2,3 mmol/L).
Facteur de conversion : g/L × 1,143 = mmol/L. mmol/L × 0,875 = g/L.
Une hypertriglycéridémie de l’ordre de 2 à 3 g/L (2,3 à 3,4 mmol/L), inférieure à 4 g/L,
favorisée par une alimentation riche en sucres ou en alcool est fréquemment rencontrée
dans la population générale et chez les diabétiques.
2. Principe
Le dosage des triglycérides sériques s'effectue selon les 4 réactions suivantes :
LPL
Réaction 1 : Triglycérides + H2O Glycérol + Acides gras libres
GK
Réaction 2 : Glycérol +ATP Glycérol-3-phosphate +ADP
GPO
Réaction 3 : Glycérol-3-phosphate + O2 Dihydroxyacétone phosphate + H2O2
POD
Réaction 4 : H2O2 + 4-AP + p-Chlorophénol Quinonéimine (rose) + H2O
Les triglycérides présents dans l’échantillon sont hydrolysés enzymatiquement par la
Lipoprotéine lipase (LPL) afin de libérer du Glycérol et des Acides gras libres. Le glycérol
résultant est phosphorylé par l'Adénosine triphosphate (ATP) et la Glycérol kinase (GK)
pour produire du Glycérol-3-phosphate (G3P) et de l'Adénosine diphosphate (ADP). Le
glycérol-3-phosphate est ensuite oxydé en Dihydroxyacétone phosphate (DAP) par la
Glycérol phosphate oxydase (GPO) en produisant du Peroxyde d'hydrogène (H2O2). Dans
une dernière réaction colorée (de Trinder), le peroxyde d'hydrogène réagit avec la 4-
Aminophénazone (4-AP) et le p-Chlorophénol en présence de la Peroxydase (POD) pour
Page 38
produire un composé rose (la Quinonéimine).
L'absorbance du composé coloré (la Quinonéimine) est proportionnelle à la
concentration de triglycérides présents dans l'échantillon testé.
3. Objectif du TP
Détermination d'une concentration inconnue des triglycérides sériques.
4. Réactifs
R1 : GOOD pH= 7,5 50 mmol/L

Tampon p-Chlorophénol 2 mmol/L
R2: Lipoprotéine lipase (LPL) 150000 U/L
Enzymes Glycérol-kinase (GK) 500 U/L
Glycérol phosphate oxydase (GPO) 2500 U/L
Peroxydase (POD) 440 U/L
4-Aminophénzone (4-AP) 0,1 mmol/L
ATP 0,1 mmol/L
TRIGLYCERIDES CAL Etalon primaire de Triglycérides 200 mg/dL
v Préparation des réactifs :
Le réactif de travail (RT): dissoudre une capsule d’enzymes R2 dans le contenu d’un
flacon de 10 mL de tampon R1, Refermer et agiter doucement jusqu’à ce que le contenu
soit homogène. Stabilité du RT : 6 semaines au réfrigérateur (2-8ºC) ou une semaine à
15-25ºC.
5. Mode opératoire
5.1. Préparer une solution étalon mère de triglycérides à 0,2 g/L.
5.2. Réaliser une série de dilutions des solutions étalons filles à une concentration
massique maximale de 0,1 g/L en eau physiologique 0,9 % ( 9g NaCl / 1 L Eau
distillée).
Page 39
5.3. Préparer un sérum humain dilué au 1/10; chaque essai est réalisé sur un volume de
0,1 mL du sérum dilué.
5.4. Réaliser la gamme d'étalonnage selon le tableau suivant :
Tableau 1 : Préparation de la gamme d'étalonnage
Tube N° 0 1 2 3 4 5 ESSAI
Etalon Triglycérides (uL) 0 20 40 60 80 100 -
Eau physiologique (uL) 100 80 60 40 20 0
Réactif de travail (mL) 10 10 10 10 10 10 10
Sérum dilué (uL) - - - - - - 100
5.5. Agiter les tubes préparés, puis les incubés pendant 5 minutes à 37 °C ou 10 minutes à
température ambiante (15-25 °C).
5.6. Lire l’absorbance (A) de l’étalon et de l’échantillon à 505 nm contre le blanc. La
coloration est stable au moins 30 minutes.
6. Résultats et interprétation
6.1. Calculer les concentrations massiques et les dilutions des étalons.
6.2. Tracer la courbe d'étalonnage A(lue) = f (concentration massique en triglycérides).
6.3. Interpréter le résultat de l'essai (échantillon du sérum humain x).
6.4. Quel est l'intérêt physiopathologique et clinique de ce dosage ?
Page 40
Références bibliographiques
· Allain, C.C., Poon, L.S., Chan, C.S., Richmond, W., Fu, P.C. (1974)., Enzymatic
determination of total serum cholesterol. Clin. Chem. 20, 470–475.
· Bradford, M.M., (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–
254. doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3
· Fossati, P., Prencipe, L., (1982). Serum Triglycerides Determined Colorimetrically with
an Enzyme That Produces Hydrogen Peroxide Clin. Chem. 28, 2077–2080.
· Gornall AG., Bardawill CJ., David MM. (1949). Determination of serum proteins by
means of the biuret reaction. J. Biol. Chem. 177:751–766
· Institut national de recherche et de sécurité pour la prévention des accidents du
travail et des maladies professionnelles (INRS). Mis à jour le 01/03/2018. Comprendre
les deux systèmes d’étiquetage des produits chimiques. Disponible sur Internet :
http://www.inrs.fr/risques/classification-etiquetage-produits-chimiques/comprendre-
systemes-etiquetage-produits-chimiques.html, [consulté le 25/octobre/2018].
· Trinder, P., 1969. Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase system
with a non-carcinogenic chromogen. J. Clin. Pathol. 22, 158–161.
doi:10.1136/jcp.22.2.158
Page 41

TP de M Thodes Spectrales 3L BIOCHIMIE S6

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

TP de M Thodes Spectrales 3L BIOCHIMIE S6

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mohamed Boudiaf-M’sila

Département de Microbiologie & Biochimie

Polycopié de Travaux Pratiques

Chargé de TP : Dr. RÉGGAMI Yassine

Année universitaire : 2017-2018

Unité d’enseignement Fondamentale 2 (UEM 3.2): Techniques biochimiques et méthodes

Matière 2: Méthodes spectrales

Mode d’évaluation : Contrôle continu, Exposés, Posters, Interrogations, Compte rendu de

TP n° 0 : Consignes de sécurité et matériel de laboratoire……………………………….. 1

TP n° 2 : Dosage du glucose par la méthode de Trinder (spectrophotométrie indirecte)… 18

TP n° 3 : Dosage des protéines totales par la méthode du biuret….………...…………… 24

TP n° 4 : Dosage des protéines tissulaires par la méthode de Bradford ………..……….. 29

TP n° 5 : Dosage du cholestérol total par la méthode Enzymatique-Colorimétrique

TP n° 6 : Dosage de triglycérides par la méthode Enzymatique-Colorimétrique GPO-

Par mesure d'hygiène, il est interdit de manger dans le laboratoire.

raisonnable et à manches longues.

encombrer les allées.

Pour chaque manipulation présentant un risque, le port des lunettes de protection et de

une hotte ventilée, avec vitres protectrices.

Le pipetage à la bouche est interdit. Utiliser les propipettes.

Ne pas respirer le contenu d’un récipient pour l’identifier à son odeur.

Reboucher tout flacon immédiatement après usage.

Les paillasses doivent être nettoyées au cours de la séance et laissées parfaitement

propres et sèches en fin de séance.

Il est impératif de se laver soigneusement les mains après manipulation.

Les pictogrammes de sécurité de produits chimiques doivent être connus.

2. Connaissance des risques de produits utilisés

Il existe trois grandes catégories de dangers intrinsèques aux substances chimiques :

les dangers physiques (risque d’explosion, d’in ammation, etc.) ;

les dangers pour l’environnement (danger pour les milieux aquatiques).

3. Etiquetage de produits chimiques

sur laquelle doit apparaître au moins :

des pictogrammes de danger ;

des mentions de dangers (phrases H) ;

des conseils de prudence (phrases P) ;

une mention d’avertissement.

L’image suivante donne l’exemple d’une étiquette d’acide chlorhydrique concentré.

sont présentés dans la figure suivante.

Mentions de danger (phrases H)

chiffre correspond à la catégorie de danger.

H2XX : mentions de dangers relatives aux dangers physiques ;

Conseils de prudence (phrases P)

Les conseils de prudence complètent également les pictogrammes. Ils commencent

chiffre correspond à la catégorie de conseil de prudence.

P1XX : conseils de prudence généraux ;

Sur l’étiquette figure une mention d’avertissement « Attention » ou « Danger » qui

Substances C.M.R. : Cancérogène, Mutagène, toxique pour la Reproduction

respectant scrupuleusement les consignes de sécurité.

Quelques exemples de substances C.M.R. : aniline, benzène, 1,3-butadiène, chlorure de

cobalt (II), dichromate de potassium, mercure, phénol...

4. Premiers soins aux victimes d’accident

4.1. En cas de projection cutanée

Attention, ne pas chercher à neutraliser les produits acides ou basiques.

4.2. En cas de projection oculaire

Rincer immédiatement et abondamment à l'eau froide.

Consulter systématiquement un ophtalmologue.

4.3. En cas d’ingestion accidentelle

En cas d'ingestion, rincer la bouche. Boire un verre d'eau.

En cas d'inhalation de vapeurs (Eau de Javel, Brome…), amener la personne dans un

(SIN110) dans une boisson gazeuse par

1. Rappel : SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE UV/Vis.