Master Sciences et Techniques (MST)

chimie des molécules bioactives

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Compte rendu
Chromatographie sur couche mince et
sur colonne

✓ Pr. Elhadi LAMCHARFI

✓ Réalisé par : EL MOUTAOUKKIL Rim

✓ Groupe de TP : 01
INTRODUCTION :
La chromatographie est une méthode physicochimique de séparation analytique ou
préparative qui nous permet d’identifier et de quantifier les composés d’un mélange .
Dans notre TP on a travaillé en utilisant deux types de chromatographie , la
chromatographie sur couche mince (CCM) et la chromatographie sure colonne .

La chromatographie sur couche mince est une méthode qualitative, analytique non
quantitative. Elle se fait sur couche mince, rigide et souple en même temps pour un
découpage facile, d’épaisseur inférieur à 1mm où on dépose la phase stationnaire.

On utilise la CCM pour 4 choses :

➢ Analyse rapide d’un mélange pour déterminer le nombre de constituants.

➢ Permet de choisir la nature de la phase mobile et de celle de la phase stationnaire
adéquate qu’on peut utiliser pour la chromatographie sur colonne.
➢ Pour l’utiliser comme détecteur pour analyser les différentes fractions obtenues
par chromatographie sur colonne.
➢ Pour avoir une idée sur l’évolution d’une réaction chimique.

Et on an la chromatographie par colonne ; la chromatographie sur colonne est

utilisée pour l’analyse de produits dont la masse peut atteindre plusieurs grammes. Elle
s’apparente étroitement à la chromatographie sur couche mince au niveau des phases
impliquées et du mécanisme mis en œuvre pour séparer les composants.

➢ BUT DE MANIPULATION :

Identification et extraction des composants de Sirop de menthe de coloration vert,

et de Sirop de Grenadine de coloration rouge à partir de la chromatographie sur
colonne et à l’aide de la chromatographie sur couche mince.

➢ MATERIELS UTILISES :

Couche mince de silice , cuve , éprouvette, bécher, tubes à essais, pincé, burette,
micropipette.
➢ Principe de CCM :

Pour faire une CCM on découpe une partie de la couche mince , on trace une ligne de
départ et on marque les produits qu’on a. On commence par déposer nos solutions en
utilisant un capillaire (tube fin qui se remplit tout seul au contact de la solution) et on le
dépose sur la phase stationnaire créant ainsi une tâche avec un diamètre le plus petit
possible. On la dépose dans la et on compte le temps de migration de la phase mobile
une fois arriver à 0,5cm. On ouvre le couvercle et on sort notre plaque où on trace notre
ligne d’arrivée directement avant qu’un produit volatil ne s’évapore et on la sèche.
Chaque produit va migrer selon son affinité.

Si les produits ne sont pas colorés on utilise un révélateur . On a 2 types de révélateur :

❖ Les révélateurs universels : on a le 1er est l’UV qui est un révélateur photochimique
qui nous permet de détecter tous les composants qui contient 2 liaisons conjugué au
minimum, lorsqu’on place notre plaque sous l’U.V on observe une tâche et on
l’entoure avec un crayon , le 2eme est l’iode qui est un révélateur chimique qui
détecte si on a un composant qui contient au moins une double liaison au moins, ils
vont former un complexe de tâche jaune.
❖ Les révélateurs spécifiques : ils sont utilisés Pour tester la présence d’une fonction
chimique , parmi ces révélateurs on trouve :
• Aldéhyde et cétone : Le révélateur utilisé est la DNPH ou 2,4-
dinitrophénylhydrazine. La DNPH en présence d’aldéhyde ou d’une cétone
donne un précipité jaune orangé.

• Les sucres : pour les sucres réducteurs qui sont des sucres simples donneurs
d’électrons dans une réaction d’oxydo-réduction, la liqueur de Fehling renferme
 des ions cuivre II de couleur bleue, à chaud en présence d'un réducteur se forme
un précipité rouge brique d'oxyde de cuivre.

• Les acides aminés : le révélateur des acides aminés c’est la ninhydrine (2,2-
dihydroxyindan1,3-dione), qui donne en présence des acides aminés un
composé de coloration violette

➢ MODE OPÉRATOIRE (1) :

Dans notre TP on a utilisé 6 solutions comme Phase mobile : Eau, solution de

NaCl(10g/l), solution de NaCl (20g/l), solution de NaCl (40g/l), solution de NaCl
(100g/l), EtOH(50%) /Eau(50%) . Ces solutions doivent être en ordre de 1% de
préférence pour plusieurs raisons , pour avoir un solvant le plus volatiles possibles qui
va aider à ne pas saturer la phase stationnaire comme ça quand on pose le capillaire sur
la couche le solvant va se volatiliser .
 • On a préparé une couche de silice comme phase stationnaire et comme on a déjà
mentionner la phase stationnaire doit être mince à base de silice, épaisse et souple
. On note en haut de la plaque le nom du solvant utilisé (dans notre cas une
solution de NaCl (40g/l)
• Dans cette couche mince on a tracé à l’aide d’un crayon de tête arrondie la ligne
de dépôt , On dépose à l’aide d’une micropipette dans le 1er point une petite goutte
de sirop vert et dans le 2 -ème une petite goutte mais d’une concentration élevée
, et dans la 2 derniers points une gouttelette de Sirop rouge et une autre plus
concentrée .
• On met la plaque CCM dans la cuve à l’aide d’un pincé d’une façon qu’on aura
une ligne horizontale et bien stable , et on la ferme avec du couvercle afin d’évité
la volatilisation des solutions.
• Chaque solvant arrive presque à l’extrémité de la plaque (0,5 cm) on le fait sortir
et on trace la ligne d’arrivée.
➢ RÉSULTATS OBTENUS :

avec Tr = 3min54s
➢ EXPLICATIONS ET RÉSULTATS :
1) Le sirop rouge est composé d’un seul colorant rouge, alors on peut l’extraire par
simple extraction.
2) Le sirop vert composé de trois colorants (jaune, bleu1, bleu2),
3) Dans les six plaques les tache qu’on a déposé avec diamètre important, donnant
après CCM des taches trop dispersent. Donc on doit déposer des petites taches
4) On remarque qu’on peut extraire le colorant jaune avec n’importe quelle phase
mobile, alors on va l’extraire par NaCl(10g/l) car il y a peu de dispersion de cette
colorant et car on n’aura pas d’autre colorant qui le suit directement lors de leur
sortie.
5) Le solvant idéal pour séparer le bleu 1 est l’eau vu qu’on peut remarquer une
grande affinité .
6) Dans le cas de EtOH(50%) /Eau(50%)les colorants on des affinités presque
communes pour cette solvant alors on peut l’utiliser comme phase mobile pour
faire sortir le bleu2.
Conclusion :
On a pu conclure a travers notre CCM que le solvant (NaCl 10g /l) et aussi chaque
solvant idéal pour chaque colorant :
 Jaune NaCl (10g/l)
Bleu 1 eau
Bleu 2 EtOH(50%) /Eau(50%)

On peut remarquer que le sirop rouge contient qu’un seul colorant rouge .

➢ PRINCIPE DE CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE :

On a choisi la bonne phase stationnaire et la bonne phase mobile, on mélange dans un

bécher notre phase stationnaire avec un peu de la phase mobile et on la verse dans notre
colonne a robinet ouvert possédant le verre fritté ou un coton. On trace une ligne sur la
colonne indiquant le niveau de la phase stationnaire et on commence à tapoter avec un
tuyau sur la pince pour s’assurer que la phase stationnaire est bien tassée et on retrace
un autre niveau. On rajoute la phase mobile et on attend qu’elle soit au même niveau
avec notre phase stationnaire pour qu’on puisse déposer notre produit. Quand on
constate que les 2 sont au même niveau, on verse notre produit et on s’assure qu’il
pénètre à l’intérieur de la phase stationnaire , et on prend un petit coton et on le met sur
la surface pour éviter le changement de la phase stationnaire et on rajoute notre phase
mobile. Les composants du produit étudié vont se séparer selon leur affinité pour les
2phases et on les récupère dans différents béchers.
❖ Remarques :
✓ Il faut dégazer le Cotton pour ne pas avoir des bulles d’air dans la phase
stationnaire .
✓ Les 2 phases doivent être non miscibles.
✓ Il y a 2 types de remplissage :
 Remplissage à sec : on remplit la colonne avec la phase mobile et on rajoute la
phase stationnaire petit à petit.
Remplissage humide : consiste a mélangé une quantité de la phase mobile a la
phase stationnaire et verser le mélange dans la colonne, en rajoutant la phase
mobile petit à petit.
✓ Le matériel utilises doit être propres et sec .
➢ MODE OPÉRATOIRE 2 :

On a utilisé le CC que pour le Sirop vert , dans notre TP ,Pour cette étude on a choisi
de faire 2 différentes phases mobiles en préparant 2 colonnes différentes : une contenant
l’eau comme phase mobile, l’autre contenant NaCl 10g/l
Pour les 2 colonnes : ( une contenant le verre fritté et une le Cotton )
• On pèse 8g de Silice poudre (phase stationnaire polaire ) et On a rince chaque colonne
par sa phase mobile .
• On met un peu du verre fritter et le Cotton au fond de la colonne pour éviter le passage
du solide. . On remplit la colonne par la silice mouillée par les phases mobiles de chaque
colonne et qui présente notre phase stationnaire (le remplissage de de la colonne est un
remplissage humide).
• On trace le niveau de la phase mobile, on tape sur le support et on retrace le niveau
pour voir si la phase stationnaire est bien tassée.
• On élimine la phase mobile dans un bécher jusqu’à les deux phases devient dans le
même niveau, pour que notre produit sera en contact avec les deux phases.
• Lorsque la phase stationnaire devient mate on dispose tous doucement le produit
(10%).et On laisse le produit pénètre la colonne.
• On remarque une dispersion.

❖ Remarques :
o Pour accélérer l’élution du bleu 1 on a utilisé l’eau , et pour le bleu 2 on a utilisé dans
un premier temps le 5g/L et puis le EtOH/H2O
o Si on avait des solutions incolores, on va utiliser l’analyse par CCM (comme
détecteur)
o De préférence en chromatographie il faut prendre de petites fractions.
-Si la résolution est faible on utilise plusieurs petites fractions
-Si la résolution est grande on peut utiliser de grandes fractions
 ➢ EXPLICATIONS ET RÉSULTATS :
1) Pour la colonne 1 : NaOH (10g/l)

On a une bonne séparation du jaune , bleu 1 et bleu 2 Comme on a pu déduire

d’après les résultats de la CCM
2) Pour la colonne 2 : eau
On a eu dans cette CC une couleur verte qui est un mélange des 2 couleurs jaune
et bleu donc on peut dire qu’on a un chevauchement qu’on va constater dans notre
chromatogramme c’est-à-dire on n’a pas eu une bonne séparation et on le constate
aussi dans la CCM ou on voit une dispersion .

La colonne 1 (NaOH 10g/L) La colonne 2 (eau)

o Solvant o Solvant
o Colorant jaune o Jaune
o Solvant o Vert
o Le bleu 1 o Bleu 1
o Solvant o Solvant
o Bleu 2 o Bleu 2